医学微生物学与免疫学实验

微生物与寄生虫学尝试指导目录尝试一微生物的形态学检测〔2学时〕尝试二理化因素对微生物的影响〔2学时〕尝试三肠道致病性细菌的别离与鉴定〔4学时〕尝试四抗酸染色〔2学时〕尝试五寄生虫学尝试〔2学时〕微生物与寄生虫学尝试序言本尝试在于使学生加深和安定课堂内容，并在掌握系统理论常识的根底上，学习微生物与寄生虫学的底子操作技能，通过尝试加强无菌概念，培养独立工作和阐发问题的能力，为此后有关的疾病诊断与中医中药的科学研究工作打下良好的根底。

本尝试指导共包罗五个试验工程，共计教学12学时，按教学方案及大纲要求供我院中医学专业、针灸按摩专业、骨伤学专业、护理学专业、中西医结合等专业学生使用。

实验室规那么本门学科尝试的对象大多是病原微生物，如果不慎发生不测，不仅自身可能遭致传染，并有可能将病原微生物传给他人。

因此，进入尝试室必需遵守以下规那么：1. 非尝试必需物品，不准带进尝试室。

2．进入尝试室必需穿工作服，按规定就座，保持肃静。

3．上尝试课要严格遵守课堂纪律，不得大声谈笑及乱动物品，禁止抽烟和进食。

4．尝试时听从老师指导，安稳树立无菌不雅点，严格遵守无菌操作规程，假设发生菌液污染，损坏物品等变乱，应当即陈述老师及时处置。

5．尝试顶用过的染菌器材如吸管，试管和用过的玻片等应及时放人含有消毒液的容器内，不得放在桌上，也不成在水槽里冲刷。

6．庇护公物，节约使用尝试材料；注意安然使用水、电、煤气。

7．尝试完毕，按要求整理器材物品，清扫卫生。

脱下工作服，消毒洗手后，离开尝试室。

8．作业应在规按时间内完成，尝试陈述要求简洁扼要，笔迹清楚，画图力求正确、客不雅。

尝试一微生物的形态学检测一、尝试目的1、掌握细菌的底子形态〔球菌、杆菌、弧菌〕。

2、掌握革兰氏染色的操作方法。

3、熟悉生物显微镜的使用，出格是油镜的使用和庇护；4、熟悉革兰氏染色的道理。

二、尝试内容〔一〕显微镜油镜的使用及庇护1、道理：在一般微生物学尝试中最常使用的是普通光学显微镜的油镜。

油镜镜头透镜很小，进入镜筒的光线很少，使用时为了增加亮度，必需在标本玻片与油镜头之间，滴加香柏油，因为香柏油的折光率与载玻片相似，这样就可使通过聚光器进入载玻片的光线不会因折射而散掉，几乎全部进入镜筒内，使视野敞亮，物象清楚。

2、材料与试剂生物显微镜及香柏油、二甲苯、标本片等。

3、操作步调（1）坐姿：使用显微镜油镜时，必需坐端，镜体保持垂直位，不要使载物台倾斜，以免香柏油或悬液标本流出。

〔2〕识别油镜头：油镜头上一般刻有“X 100”，“Oil〞，“HI〞等标识表记标帜。

〔3〕对光：用低倍镜对光，查抄染色标本时光线宜强，要抬高聚光器，放大光圈，取得最大亮度。

〔4〕滴加香柏油：将标本放在载物台上固定好。

滴加香柏油1滴，换油镜查抄。

〔5〕找焦点：将油镜移至中央对准标本，从侧面注视镜头，并迟缓动弹粗螺旋，使物镜筒下降，直至镜头浸于香柏油中并几乎接触到标本为止。

然后将视线移至目镜，一面不雅察一面向上慢慢动弹粗螺旋，待看到模糊的物象时，即改用细螺旋，调节焦点以寻求清晰的物象。

〔6〕清洁调养：镜检完毕，将镜筒升起，取出标本片，用镜纸将镜头上的油擦净。

假设油已干，可用擦镜纸蘸少许二甲苯擦去油迹，再用擦镜纸揩去二甲苯。

然后，将聚光镜降下，各物镜呈“八〞字形，套好庇护套。

〔二〕细菌的革兰氏染色法1、道理G+菌细胞壁布局致密〔肽聚糖层厚〕，且脂质含量少，乙醇不易渗入脱色。

G-菌细胞壁布局疏松〔肽聚糖层薄〕，且脂质含量多，乙醇溶解脂质后易渗入细胞而脱色。

G+菌菌体含有大量核糖核酸镁盐，可与碘、结晶紫安稳结合，使已着色的细菌不被乙醇脱色；G-菌菌体内核糖核酸镁盐含量小，易被乙醇脱色。

G+菌等电点比G-菌低，在同一pH值条件下阳性菌比阴性菌所带负电荷要多，故与带正电荷的碱性染料〔结晶紫〕结合安稳，不易被乙醇脱色。

2、材料金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌培养液、接种环、酒精灯、革兰染色液〔结晶紫、卢戈碘液、95％乙醇、复红或沙黄染液〕。

3、操作步调〔1〕标本片制备①取干净载玻片l块，用玻璃铅笔划一个区域。

②接种环按无菌操作法挑取少许菌液于区域中涂成一薄层，接种环在火焰上烧灼灭菌。

③在室温下自然枯燥。

④将玻片通过火焰3次固定标本，自然冷却。

〔2〕染色①初染：在固定好并已冷却的涂片标本上滴加结晶紫染液，要盖满菌膜。

约1分钟后用细水流从玻片的一端把游离的染液洗去。

②媒染：滴加卢戈碘液数滴，作用l分钟后，轻轻水洗。

③脱色：在玻片上加95％乙醇2～3滴，并轻轻动弹玻片数秒钟，使玻片倾斜让乙醇流去，如此重复数次，直至流下的乙醇几乎无色或稍呈淡紫色，流水冲刷。

④复染：滴加稀释复红染液数滴，作用1分钟后流水冲刷。

染色完毕，用吸水纸将标本片吸干，玻片上滴加香柏油，油镜不雅察。

〔3〕成果判定：染成紫色者为革兰阳性〔G＋〕菌，染成红色者为革兰阴性〔G-〕菌。

〔三〕细菌的底子形态〔示教〕油镜下不雅察：球菌〔葡萄球菌〕革兰染色片、杆菌〔大肠杆菌〕革兰染色片、弧菌〔霍乱弧菌〕革兰染色片，注意不雅察细菌的形态、大小、摆列和染色。

三、作业1、绘出示教镜下细菌的底子形态〔注意标明菌名、形态、摆列、染色性〕。

2、革兰氏染色成果〔1〕、用红蓝铅绘制出镜下所见两种细菌的形态〔注意大小、形态、摆列和染色性〕。

〔2〕、表达革兰氏染色的意义。

四、思考题1、试比较革兰氏阳性菌与革兰氏阴性菌细胞壁布局的特征？尝试二理化因素对微生物的影响一、尝试目的1、掌握细菌常用的接种方法和在不同培养基上的发展现象，细菌的三种特殊布局。

2、熟悉常用人工培养基的种类，尝试室常用消毒和灭菌设备的道理及使用方法。

3、了解常用人工培养基的制备方法、细菌在自然界和人体的分布特点。

二、尝试内容〔—〕常用培养基的制备方法1、道理：培养基是用人工方法制备而成的，专供微生物发展繁殖使用的混合营养成品。

培养基按其物理性状可分为固体培养基、半固体培养基和液体培养基三种。

2、材料与方法：〔1〕肉汤培养基①成分：新鲜绞碎牛肉50g〔或牛肉膏〕，蛋白胨lg，氯化钠，蒸馏水100m1。

②方法：取新鲜牛肉50g去脂肪、筋膜，绞碎。

加水100rnl，搅匀，置冰箱过夜，次日取出，煮沸半小时，用脱脂棉和纱布过滤，并补足水分至本来的量，即为牛肉浸液。

再加人蛋白胨、氯化钠，加热使之完全溶解，调整pH值至7.6～7.8，煮沸10分钟，过滤，分装，高压灭菌后备用。

〔2〕琼脂培养基①固体培养基：在肉汤培养基中加人2％～3%琼脂，融化后调整pH值至7.6～7.8，分装，高压灭菌，在室温下凝固即为固体培养基，有平板、斜面和琼脂高层等数种。

②半固体培养基：如果在肉汤培养基中加人的琼脂量为0.3％～0.5％，如上炮制，灭菌后取出直立冷却，即为半固体培养基。

③血液琼脂培养基：有些细菌营养要求比较高，在普通的琼脂培养基上不克不及很好发展，需用血液琼脂培养基进行培养。

将预先制备好的普通固体培养基100ml加热融化，待冷却到50℃摆布时，用无菌操作法参加8～10ml的脱纤维兔血或羊血，混匀后倒入无菌平皿或试管中，冷却后即为血平板或血琼脂斜面培养基。

〔二〕细菌的培养技术〔技术操作〕1、材料：普通液体培养基、琼脂平板培养基、斜面培养基、半固体培养基、大肠埃希菌与葡萄球菌混合菌液、大肠埃希菌斜面培养物、酒精灯、接种环、恒温培养箱。

2、操作步调：细菌的接种方法因各种培养基的不同而异。

常用的有以下几种方法：〔1〕液体培养基接种法①用灭菌接种环取细菌〔链球菌、大肠埃希菌等〕培养物少许。

②按无菌操作法将沾有细菌的接种环在倾斜的接近液面的管壁上轻轻涂抹研匀，试管直立使沾附在管壁上的细菌混人液体即可。

③接种完毕将试管置37℃培养24小时，不雅察上述细菌在液体培养基中的发展状况。

〔2〕平板划线接种法：本法要求通过划线将稠浊的细菌在平板上分散开来，并在平板上长成菌落，以达到别离培养获得纯培养物的目的。

具体的方法有两种：①平行划线法：左手斜持平板底，右手持接种环。

接种环在火焰上灭菌，冷却后，沾取菌种，先在平板的一端涂开，然后由此开始向下平行密集划线，约占平板的一半。

将平板转180°角，从平板的另一端开始平行密集划线，直至划满平板的残剩局部。

置37℃温箱培养。

②分区划线法：右手将接种环按无菌操作法沾取少许培养物〔金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌等〕，左手拿平板略翻开，将标本涂于平板外表的一侧边缘，运用腕力持续划线〔要密但不要重叠，不要划破培养基〕，划线范围约占平板面积的1／4。

将平板旋转约90°，接种环经灭菌、冷却后，通过第一次划线区2～3次。

再作同样划线又占平板面积约1／4。

重复上述操作，划完整个平板。

将平板放在37℃温箱内，18～24小时后不雅察各区细菌发展情况，有无单个菌落，以及菌落的颜色、形态等。

比较金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、大肠杆菌等的菌落特点。

〔3〕半固体接种法：左手持半固体培养管，右手持接种针，火焰灭菌冷却后，挑取细菌〔大肠埃希菌、痢疾杆菌等〕，垂直刺入半固体培养基中心，至近管底处，然后循原路退出。

塞上硅胶塞，接种针从头灭菌。

接种完毕，于37℃培养18～24小时，不雅察细菌发展情况。

比较大肠埃希菌和痢疾杆菌固体培养基中的发展情况。

〔三〕细菌发展现象〔示教〕不雅察金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、甲型溶血性链球菌、乙型溶血性链球菌、大肠埃希菌及痢疾志贺菌在各种培养基上的发展现象和特点。

1、在液体培养基上发展情况〔1〕外表发展：液体清晰，细菌发展在液面形成菌膜。

如枯草杆菌。

〔2〕混浊发展：液体均匀混浊，或有少量沉淀。

如大肠埃希菌。

〔3〕沉淀发展：液体清晰，细菌发展在管底，形成沉淀。

如链球菌。

2、在固体培养基上的发展情况〔1〕菌落：将细菌划线接种在固体培养基上，经18~24小时培养，由单个细菌繁殖成的肉眼可见的细菌集团。

不雅察时要注意菌落的大小、形状、外表性状、边缘是否整齐、透明度、颜色等，可作为辨别细菌的依据之一。

3、在半固体培养基上的发展情况有鞭毛的细菌，由于能运动，在半固体培养基内沿穿刺线弥漫性长，使穿刺线变的模糊不清，呈现试管刷现象。

无鞭毛的细菌，因为不克不及运动，接种后仍沿穿刺线发展，穿刺线与周围边界清楚。

〔四〕微生物的分布检测〔讲解并指导学生操作〕1、空气中细菌的查抄〔采用沉降法〕取无菌普通平板1只，置一处，启盖约15分，再盖上，37℃培养24h，取出不雅察有无细菌发展。

2、皮肤外表、水中细菌、75%乙醇消毒试验查抄〔采用涂抹法〕在普通培养基上分区后，直接用手指在无菌平板外表轻轻涂按1处，之后用自来水洗手指在平板外表2处轻轻涂按，再用75%乙醇棉球擦拭手指后，手指在平板外表3处轻轻涂按，37℃培养24h后，取出不雅察有无细菌发展。

3、咽喉部细菌查抄用无菌棉拭子在咽喉部涂抹后，涂在血平板上，37℃培养24h后不雅察成果。