细胞培养实验室操作准则.10版
细胞培养操作规范
细胞计数板计数室构造
细胞数/ml=（4个大方格
细胞总数/4）×104×稀
释倍数
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四、细胞培养注意事项
1. 实验进行前，无菌室及无菌操作台(laminar flow) 以紫外灯照射20-30分钟灭菌，以75 %酒 精 擦拭无菌操作抬面，并开启无菌操作台风扇运 转10 分钟后，才开始实验操作。
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细胞培养皿 ▫ 35mm （加液量3ml) ▫ 60mm （加液量5ml) ▫ 100mm（加液量10ml)
150mm (加液量15ml)
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常用培养基：
RPMI1640：
适合许多种细胞，如肿瘤细胞、正常细胞的原代培 养、传代培养等。
尤其适合人白细胞，如H9、HL-60、IM-9和K562等细胞系的培养。
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天，至室温下全溶后再分装，一般用15ml无菌 离心管分装。
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谷氨酰胺：
谷氨酰胺在溶液中很不稳定，4℃放置1周可分 解50％，故应单独配制，置于-20℃保存，临 用前加入培养液。
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消化液：
胰蛋白酶溶液： 常用浓度：0.25%。 消化时间：2-10分钟（显微镜下观察）
用含血清培养液终止其对细胞的消化作用 。
0.5M NaOH煮沸15分钟或浸泡过夜，流水冲洗，0.5M HCl煮沸15分钟或浸泡过夜，流水冲洗，蒸馏水冲洗
15次以上，50℃烤干备用。
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消毒： 消毒前常用的包装：牛皮纸、棉布、铝饭盒包
装 高压蒸汽消毒：121℃ ，维持20-30分钟。
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三：细胞培养方法
细胞培养室操作规程
细胞培养室操作规程1. 引言细胞培养室是进行细胞培养和实验的专用场所，为保障实验的准确性和安全性，制定了以下操作规程。
2. 操作要求为了保持细胞培养室的洁净和细胞的无菌状态，请遵守以下要求：- 进入细胞培养室前，请先穿戴干净的实验服和手套。
- 禁止携带任何未经消毒的物品进入细胞培养室，包括食物和饮料。
- 在离开细胞培养室前，请使用培养室专用消毒液清洁双手和操作台面。
- 所有细胞培养器材和试剂都需要进行严格的消毒和清洁处理。
- 遵守细胞培养室内的安全操作流程，不得随意更改实验设备或移动培养皿。
3. 培养皿的处理- 使用无菌的培养皿，确保无菌操作环境。
- 打开培养皿前，请先将双手浸泡于培养皿消毒液中，保持10秒钟。
- 使用灭菌鮯头夹拿取培养皿，不要直接用手接触培养皿。
- 不要将培养皿放在操作台上超过30分钟，以防止细菌污染和消耗培养基的水分。
4. 细胞培养物的操作- 细胞培养物必须在无菌实验室中进行。
- 添加培养基和培养物时，请使用灭菌的移液器或吸管，并且保证无气泡的形成。
- 实验结束后，请将细胞培养物放置于相应的培养箱进行保存，并确保环境温度和湿度的合适条件。
- 禁止将培养物带出实验室，以免造成交叉污染。
5. 实验设备的使用- 在使用实验设备之前，请先了解并熟悉相关使用方法和安全操作规程。
- 使用完毕后，及时清理和消毒实验设备，并将其恢复到原有的存放位置。
- 长时间闲置的实验设备需要进行周期性的保养和检修，以确保其正常运作。
6. 废物处理- 废弃物需要分类投放，如废纸、塑料瓶、试验台面等，要分别放入不同的垃圾桶中。
- 临床废液和含病原体细胞培养物的废液应根据相应的危险废物处理程序进行处理。
7. 突发情况处理- 在突发情况下，如实验设备故障或突发火灾，请立即通知实验室负责人并按照应急处理程序进行处理。
- 紧急情况下，确保自身安全的前提下，尽量采取措施保护实验数据和实验设备。
以上即为细胞培养室的操作规程，请严格遵守，以保障实验安全和数据的准确性。
细胞培养室工作守则
细胞培养室工作守则一、入室基本规则1禁止私自带非本实验平台人员入室操作。
2.进细胞培养室必须穿专用工作衣（白大衣），换拖鞋或鞋套，不必需的物品勿携入室内。
3.严禁吸烟和饮食，保持安静和良好秩序，实验时要严肃认真。
4.当天要操作的使用者，实验开始前、结束后开操作间外紫外灯消毒细胞房15-30min;检查培养箱内水量是否足够；检查灭菌物品的储备情况，以便及时补充。
5.细胞培养室遵循预约原则。
预约时间和实际操作时间都要登记！备查！无预约者若要在他人预约时段内使用，需先征得预约者的同意，否则应无条件让出工作台，以免耽误他人实验。
6.试剂耗材都由实验人员自己准备，各自物品请写好名字，不能私自拿取他人试剂耗材或消毒物品，如紧急需要，则需征得本人同意后方可。
注：公用材料如枪头、离心管，配制消毒用75%的酒精，制作酒精棉球等遵从谁消耗谁补充，与人方便于己方便！耗材的使用秉持节约的原则，同一类耗材必须使用完才可以拆封新的耗材，同一类耗材快使用完的时候到徐老师处领取。
7.离开实验室前，脱去工作衣和拖鞋或鞋套。
若有垃圾堆积，请顺手扔掉, 更换垃圾袋。
关好水、电、门、窗，方可离开实验室。
8.定期1-2月清理冰箱里的个人物品。
9.新进细胞培养室进行实验的老师或同学，由负责该新进人员的指导教师进行细胞培养培训。
二、培养箱使用规则1从培养箱取放物品前"用酒精清洁双手（或手套），尽量缩短开门时间和减少开门次数。
注：培养箱中的空气是经过过滤的洁净空气。
长时间敞开或频繁开关培养箱,容易造成污染。
10培养瓶皿放入培养箱前，用酒精消毒瓶口位置，并稍等至酒精挥发后再放入，以免培养箱内滞留过多乙醇蒸气。
3.2-3人共用一层培养箱，按预定位置摆放培养器皿，方便查找，以免长时间敞开培养箱。
4.普通培养中的细胞，若非实验需要，每瓶/板细胞每天只需要观察生长状态一次，2人以上共用的细胞，可约好时间一起观察。
注：频繁将细胞拿出观察，容易给培养箱造成污染，同时也会影响细胞生长条件的恒定。
细胞培养室操作指南
细胞培养室操作指南---1. 引言细胞培养室是进行细胞培养的重要场所，严格的操作规范可以确保细胞培养的成功和细胞的活力。
本文档旨在提供明确的操作指南，以确保细胞培养室的操作规范和细胞培养的高质量。
2. 安全操作指南2.1 穿戴好实验室服进入细胞培养室前，必须穿戴好干净的实验室服，确保衣物无毛发、皮屑等污染物，并配戴好所需的防护用品：手套、口罩、护目镜等。
2.2 细胞培养室的清洁与消毒细胞培养室应保持干净整洁，并定期进行消毒。
在每次培养细胞前，使用酒精将培养台面、培养箱、培养器具等进行消毒处理，确保无细菌污染。
2.3 合理使用培养物料在细胞培养室内，严禁使用过期的培养物料和试剂。
新开封的培养物料和试剂，应经过质量控制检验，并按照使用要求进行存储。
3. 细胞培养操作指南3.1 培养细胞前的准备工作在培养细胞之前，确保准备充分，包括以下内容：- 清洁工作台和培养箱。
- 检查培养物料和培养基的储存情况。
- 保证所需的培养器具和设备可用。
3.2 细胞的传代和分离- 按照实验要求，选择适当的培养基和传代倍数。
- 去除细胞培养瓶的上清液，进行细胞的分离。
- 细胞的传代时，应注意传代倍数的控制，避免细胞老化和突变。
3.3 细胞的培养和存储- 将细胞分散均匀地添加到预先准备好的培养基中，根据要求添加适宜的生长因子和抗生素。
- 监测细胞的生长状态和数量，确保培养的成功。
- 细胞培养完成后，将培养瓶和细胞样品储存在恰当温度和湿度的培养箱中。
4. 实验结束后的注意事项- 清洗培养器具：将培养器具进行清洗和消毒处理，确保下一次使用时的无菌环境。
~- 处理废弃物：将用过的培养器具、培养材料等废弃物集中处理，按照实验室废物管理的要求进行处理。
~- 关闭培养箱、灭菌器等设备，确保实验室的安全和设备的长寿命。
---以上是细胞培养室操作指南的主要内容。
在操作过程中，务必保持专注和细心，按照操作规范进行操作，确保细胞培养的质量和实验室的安全。
细胞培养室操作规程
细胞培养室操作规程1. 引言在细胞培养室进行实验时，需要遵循一定的操作规程，以确保实验的顺利进行并保护实验人员和细胞的安全。
本文档旨在提供详细的细胞培养室操作规程。
2. 实验前准备在进行细胞培养室实验前，需要做好以下准备工作：- 穿戴实验室制定的个人防护装备，如实验服、手套、口罩和护目镜。
- 检查实验室设备和操作台的清洁度，并确保工作区域整洁无杂物。
- 准备实验所需的培养基、细胞培养物和实验器材，并进行必要的消毒处理。
- 检查培养器具和实验器材的完整性和干净程度。
3. 实验操作在进行细胞培养室实验时，需按照以下操作规程进行：- 打开细胞培养室的门时，先用消毒剂擦拭手部，然后使用洗手液洗手并彻底冲洗干净。
- 进入细胞培养室后，先进行操作台和培养器具的消毒处理，使用消毒剂彻底擦拭工作面和器具表面。
- 进行各项实验操作前，务必佩戴好手套，勿将裸露的手部接触培养物或实验器材。
- 操作过程中，避免发生剧烈动作和摇动，以防止细胞培养物的污染。
- 操作完成后，彻底清洁和消毒操作台、培养器具和实验器材，确保无残留。
4. 废弃物处理细胞培养室中产生的废弃物需按照以下要求进行处理：- 生物废弃物和污染物应放入专用的标有生物危险标志的中，严禁随意丢弃。
- 已消毒处理的实验器皿和培养器具应单独收集，放入装有消毒液的中浸泡，待处理完毕后进行干燥和垃圾分类处理。
5. 安全措施在细胞培养室实验中，请注意以下安全措施：- 不得在实验室内饮食、吸烟或使用化妆品。
- 注意保持良好的个人卫生，经常洗手、勤换手套，避免感染的交叉传播。
- 遇到实验室事故或异常情况时，应立即向负责人报告，并按照相关应急预案进行处理。
6. 总结细胞培养室操作规程的遵守对于实验的成功和细胞的安全至关重要。
在进行实验前准备、实验操作、废弃物处理和安全措施等方面都需要严格按照规程执行。
保持实验室整洁和个人卫生，是保证实验可靠性和重复性的基础。
细胞培养技术操作规范
细胞培养技术操作规范细胞培养是一项重要的实验技术，用于研究细胞的生物学特性及其在疾病治疗和药物开发中的应用。
为了确保实验结果的准确性和可重复性，需要遵循一系列的操作规范。
本文档旨在提供细胞培养技术的操作规范，以帮助研究人员顺利进行实验。
实验室准备- 实验室应保持干净整洁，设施设备应处于正常运行状态。
- 所有使用的试剂和培养物应检查保质期，并妥善存放在适当的温度下。
- 工作平台及工作台面应进行消毒处理，以防止细菌和真菌的污染。
- 所有使用的器械和培养罐应在使用前进行高压蒸汽灭菌。
细胞培养操作细胞培养器具的准备- 使用无菌操作进行所有操作，包括试剂和培养基的添加、培养器具的取用等。
- 使用带无菌手套的清洁无菌工作台进行操作。
- 细胞培养器具（如培养瓶、孔板等）在使用前应进行高压蒸汽灭菌处理，确保无菌状态。
培养基的准备- 准备培养基前应检查其成分和配比是否正确，确保培养基的质量。
- 使用无菌操作取出所需量的培养基，并避免直接接触细胞培养器具。
- 遵循培养基的配制方法和步骤，确保其与细胞的适应性。
细胞的分离与传代- 分离细胞时，使用胰酶等消化酶进行细胞的释放，并遵循操作步骤和浓度要求。
- 记录分离细胞的季度数，避免过度传代，以保持细胞的稳定性和特性。
- 合理设置细胞传代次数和细胞数量，避免细胞过早进入衰老状态。
培养条件和操作- 确保培养器具与细胞接触的表面无菌、干净，避免细胞污染或黏附的问题。
- 控制培养环境的温度、湿度和二氧化碳浓度，以满足不同类型细胞的生长要求。
- 定期更换培养基，确保细胞得到足够的营养物质和生长条件。
- 注意培养器具和试剂的使用方法和操作顺序，避免对细胞生长和健康产生负面影响。
细胞培养操作的记录与管理- 记录每次细胞培养的详细信息，包括培养时间、细胞密度、培养基配制方法等，以便于实验结果的追溯和分析。
- 管理细胞的库存，包括标识、记录和储存，以确保细胞的可追溯性和可重复性。
- 定期检查细胞的污染和变异情况，及时采取必要的措施防止实验结果的偏差。
生物实验室细胞培养和处理准则
生物实验室细胞培养和处理准则概述在生物实验室中，细胞培养和处理是进行生物学研究的重要一环。
为确保实验结果的准确性和可重复性，以及实验人员的安全，有必要遵循一定的细胞培养和处理准则。
本文将介绍生物实验室细胞培养和处理的基本原则和操作步骤。
1. 实验室准备在进行细胞培养和处理实验之前，实验室应准备好必要的设备和试剂。
应检查培养箱、显微镜、离心机等设备的工作状态，确保正常运转。
试剂应按照规定储存和标识，避免误用和交叉污染。
2. 消毒和清洗细胞培养和处理前，应对实验台面、仪器设备、培养皿和管道进行消毒和清洗。
常用的消毒方法包括使用75%酒精擦拭和高温高压灭菌。
清洗过程中要彻底清除污垢和残留的试剂，避免交叉污染。
3. 培养基的配制和储存培养基是细胞培养和处理的基础，应按照配方准确称取所需的试剂，并使用无菌技术进行制备。
制备好的培养基应在无菌条件下储存，避免接触空气和细菌，以保持其有效性。
4. 细胞种子的培养和传代细胞培养的首要任务是细胞种子的培养和传代。
在培养细胞种子之前，实验人员应佩戴好实验手套，并确保工作区域清洁无尘。
细胞种子应从液氮罐中快速取出，并迅速加入培养基，避免过多暴露在室温下。
培养细胞时应控制细胞密度，避免过度生长或过度稀释。
5. 细胞处理的操作技巧细胞处理是为了进行特定的实验目的而对细胞进行操作。
在进行细胞处理之前，应充分了解实验目的和操作步骤，并准备好所需的试剂和仪器。
操作时应注意操作技巧，避免对细胞产生损伤或污染。
6. 实验数据的记录和整理在进行细胞培养和处理实验时，应及时记录实验数据，包括培养时间、细胞密度、试剂用量等重要信息。
这样有助于实验结果的分析和复现。
实验数据应整理并安全储存，以便需要时能够方便查阅。
7. 实验后的处理实验结束后，应对实验区域进行清理和消毒，将实验产生的废液和废弃物妥善处理，避免对环境和他人的影响。
仪器设备应进行清洗和维护，以确保其正常运转和延长使用寿命。
结论细胞培养和处理在生物实验室中具有重要的地位，为生物学研究提供了重要的实验手段。
细胞培养实验室各室工作制度
细胞培养实验室各室工作制度为了确保实验室的安全和有序运行，细胞培养实验室制定了以下各室工作制度：1. 实验室入口和出口实验室的入口和出口由专门的工作人员负责管理，以控制实验室的进出。
所有进入实验室的人员都需要佩戴有效的实验室通行证，并在进入和离开时进行登记。
2. 实验室设备使用每位实验人员在使用实验室设备之前，必须经过相关培训，并获得使用设备的授权。
使用设备时，应按照操作手册的要求进行操作，并保持设备的清洁和良好状态。
3. 安全操作规范在实验室进行工作时，所有人员必须遵守安全操作规范，包括佩戴个人防护装备如实验手套、实验眼镜等。
禁止在实验室内吸烟、食物或饮料，以及进行其他与实验无关的行为。
4. 实验材料和废弃物管理所有实验材料和废弃物都必须按照规定进行储存和处理。
实验材料应按照分类进行储存，废弃物应正确分类并放置在相应的中。
禁止将实验材料和废弃物带出实验室。
5. 实验室清洁和维护实验室的清洁和维护是每个人的责任。
每日结束后，实验人员应将使用过的工具和设备进行清洁，并保持实验台面的整洁。
定期检查实验室设备和器具的完好性，并及时报告损坏的情况。
6. 紧急情况处理在发生紧急情况如火灾、泄漏等时，实验室人员应迅速采取适当的措施，并按照应急预案进行处理。
所有人员应熟悉应急设备的位置和使用方法，并定期进行演练。
以上为细胞培养实验室各室工作制度的主要内容。
每位实验人员应遵守并严格执行上述规定，共同维护实验室的安全和有序运行。
如有违反规定的行为，将按照实验室管理规定进行相应处理。
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细胞培养实验室操作准则任何首次准备开展细胞实验的人员必须首先认真阅读以下准则，然后在已经熟练掌握细胞培养操作技术人员的指导下开始进行细胞实验，并在以后的实验过程中严格遵守各项准则。
一、细胞实验准备1.进入细胞房前要换鞋，穿无菌服（干净实验工作服），戴手套，接触细胞前喷75%酒精消毒手套。
2.将所需实验用品：培养基（完全培养基、空白培养基）、胰酶（含ETTA）、枪头（1ml、200ul、10ul)、离心管，预先放置到超净工作台，打开紫外照射30min后开始细胞实验。
3.观察细胞前，用75%酒精纱布擦拭显微镜镜头及台面，进行消毒后方可开始观察细胞。
4.观察细胞主要包括：细胞数量（汇合度）、形态、分布情况（是否均匀）、有无漂浮的死细胞和污染等，观察完及时放回培养箱。
（如图，汇合度约90%，分布均匀）5.每次开始细胞实验前，需关闭紫外照射，打开超净台风机及灯。
用含75%酒精的纱布擦拭超净工作台。
超净台内物品放置情况：左侧（各式枪头，及可常温放置的试剂如PBS等），右侧（5ml枪头及镊子），废弃瓶位于右上角，尽可能远离操作区域，正前方为枪和酒精灯，培养基及胰酶放置左侧便于取用。
6.超净台在使用前后，都需用含75%酒精的纱布擦拭台面至纱布上看不到明显脏物为止，每天操作后废液缸需清洗用紫外照射，此外，从外面拿进超净台的东西都要喷75%酒精消毒。
7、每周四需更换培养箱中高压过的超纯水，每周五对超净台（包括风机）、细胞培养房卫生进行打扫，每月对培养箱进行消毒清洗，确保细胞不受污染。
8、检查培养箱的CO2含量是否正常，如出现异常及时联系细胞平台相关负责人。
9、5mL枪头清洗高压的流程:(1)用洗洁精将枪头超声一遍（2）更换干净的自来水超声清洗3遍（3）用超纯水超声清洗1遍（4）将枪头捞出后再用超纯水荡洗3遍（5）放入烘干箱烘干（6）装在铁盒中，注意枪头放置顺序一致，放入高压锅，选择橡胶类（7）高压后放入烘干箱烘干后方可拿入细胞房使用1ml、200ul、10ul装入枪盒后放入高压锅高压烘干后方可拿入细胞房使用二、细胞传代1.细胞传代前要观察细胞，细胞汇合度达到80%-90%时可以进行传代。
图片2.以25cm2培养瓶为例：打开培养瓶瓶盖，将盖子地面朝下放在超净台台面上，然后将培养瓶倾斜，用量程5ml的枪将旧培养基吸走，然后用量程1ml枪加1ml 空白培养基轻轻摇匀清洗，用5ml枪将清洗的培养基吸走。
注：75cm2加3ml空白培养基清洗3.加入胰酶（含EDTA）500ul；然后轻轻摇晃培养瓶，注意让所有细胞都要接触到胰酶，放入37度培养箱消化。
注：75㎡大瓶加1500ul胰酶、6孔板加300ul 胰酶、12孔板加200ul胰酶4.消化时间长短根据不同细胞有不同选择，镜下观察大部分细胞变圆，见大部分细胞脱落即可终止消化。
5.25cm2培养瓶加入2ml完全培养基终止消化。
注：75cm2培养瓶加5ml完全培养基终止消化、6孔板加1.5ml完全培养基终止消化、12孔板加1ml完全培养基终止消化。
6.用5ml枪头轻轻吹打细胞后，观察底部大部分细胞已脱落，然后倾斜培养瓶，将细胞混悬液转移到15ml离心管，800r/min条件下离心3min。
7.离心时，准备新的培养瓶，标记好细胞的名称、日期、代数。
8.离心结束后，弃上清液。
缓缓沿壁加入5ml新鲜的完全培养基，计数（方法参见后面）。
9.重悬细胞，用量程5ml枪，枪打到第一档，深入管底部，轻轻吸取离心管底部的整个沉淀的细胞团和培养基，然后沿管壁缓慢匀速打下，枪头随着液面的的上升而逐渐上提，这样可避免产生气泡。
按此方法反复几次，待细胞混匀后，吸取细胞混悬液，加入新培养瓶，按所需比例进行传代即可。
细胞传代的比例是根据所需细胞的数量以及时间来决定。
如需急用可用低的比例（1:2,1:3）传代，并每天换液，如时间充裕，不用时可适量加大传代比例（1:4,1:5），并3天换液，减少细胞的代数，暂时不用细胞只需留一小瓶培养即可。
10.进行十字型摇匀，有序放入培养箱中。
注意事项：1、需要进行细胞实验前，合理扩大培养，尽量安排在同一代数情况下做实验。
2、在进行细胞实验时，不可同时处理两种及以上细胞，避免交叉污染。
三、细胞计数：（计数前操作与传代相同）1、消化后的细胞充分混匀后，用10ul枪吸取l0ul细胞混悬液，再吸取10ul 台盼蓝，在1.5ml离心管中将两者混和均匀后，将20ul混合液注入计数板。
2、打开计数器，确认红色指示灯亮起，蓝色指示灯在第几格，一般为第一格，旋转选择正确区域。
3、打开计数软件“count star”,标明日期及细胞名称，选择比例1:1，细胞类型为，注意观察细胞分布，如果不均匀，应重新混匀后计数。
4、记录内容：细胞总数，死细胞数，细胞活力（一般活力在95%以上）及活细胞数。
（活细胞数用于计算接板所需的细胞量）5、将计数板及时从count star取出，关闭软件，计数完成。
四、细胞接种：1、细胞计数完后，正确计算所需的细胞量和培养基的量，取一洁净的皿，将细胞混悬液和完全培养基分别加入皿内。
2、混匀：先用5ml枪混匀，然后取排枪混匀后，先加一孔到96孔板中，去镜下观察分布是否均匀，如若不均匀需再次混匀，确保均匀后再加入。
避免产生气泡，如有少许气泡可用10ul枪头戳破。
每次吸取液体后需观察高度是否一致和准确。
3、对于接板的细胞，96孔板可先静置一会再放入培养箱，避免摇动，以免细胞集中在中央。
例如：需接一块96孔板，细胞密度为0.5*105，细胞计数----活细胞数为5*105个/ml需稀释的倍数为5*105除以0.5*105等于10倍，一块96孔板需要12ml，故需细胞悬液的体积为12ml除以稀释位数10等于1.2ml，其余的量用完全培养基补足。
注意事项：无论是接种在6孔板、12孔板、24孔板和96孔，培养皿或者培养瓶中，都需要先加入一孔、一个培养皿或一个培养瓶在镜下观察细胞悬液分布是否均匀，若发现细胞有抱团、成束现象需重新混匀后方可接种。
附不同板底面积五、细胞冻存：1、订购新细胞之前需查阅相关的文献，选择合适的细胞，并仔细阅读说明书（培养的条件包括培养基等），准备好细胞培养所需的相关试剂及耗材。
1、买来后传一个25cm2小瓶，记为第一代---P0，若细胞状态不好可每天换液，长满后1:3传3个小瓶，记为第一代P1，然后根据细胞的生长速度长满后按1:6传6个大瓶，记为P2，保种5大瓶，另一大瓶可开始用于实验，以此类推，详细记录细胞的代数。
冻存时写上细胞名称、冻存日期及细胞的代数。
2、细胞消化离心后，去掉上清液，快速加入冻存液，充分混匀后装入冻存管。
3、一般一瓶75cm2的瓶子可冻存3-4小管，标号细胞名称，冻存日期和细胞代数，用封口膜封口，放入程序性降温盒置于-80℃冰箱过夜，第二天置于液氮中保存。
4、放入液氮时，注意放入正确的位置，记录好冻存细胞的位置，顺序按时间先后排，时间前的放外面。
六、细胞复苏1、复苏前准备：将所需物品放入超净台，打开紫外照射约半小时，75%酒精擦拭台面。
2、准备15ml离心管，加入5ml培养基。
3、提前打开37℃水浴锅预热，从液氮容器中取出冻存管，直接浸入37℃温水中，并不时摇动令其全部融化，更换新手套。
4、用75%酒精喷洒冻存管后，擦拭台面，打开盖子，1ml枪头吸出细胞悬液，加到含培养基的离心管，充分混匀；5、离心，800r，3min；6、弃去上清液，重悬细胞，加入完全培养基到25cm2的小瓶子，在显微镜下观察细胞状态，然后放入37℃培养箱静置培养；7、注意观察细胞状态，及时换液。
8、细胞复苏后，根据细胞的特性，按适当的比例传到75cm2的大瓶子，每天换液，长满后立即保种，并记录细胞的代数，细胞状态稳定后方可开始实验。
8、复苏后观察细胞如果发现一小瓶有很多细胞，立即传到大瓶子七、细胞加药1、细胞加药前需在镜下观察细胞形态和数量，根据具体实验对细胞覆盖率的要求不同。
一般药物作用24h是在细胞长到50%-60%时加药。
2、计算好所需配置的量，准备离心管，配药可采用两种方法：（1)配置最高浓度，再进行倍比稀释配成所需各浓度。
（2）分别配置所需的各种浓度。
配完药后注意要上下混匀！3、加药时沿孔板壁加，避免产生气泡，加完后注意检查有无气泡，小气泡需用小枪头捅破，以免影响药物的均匀分布。
4、加药后，立即放入培养箱。
例如：1、一块96孔板加药，复方熊胆粉(FF)储存液浓度为500mg/ml（PBS配置），我们需要配置成0、1.25、2.5、5mg/ml的工作液各1ml，采用倍比稀释法，准备4个5ml的离心管，在0、1.25和2.5mg/ml的离心管中分别加入1mlDMEM完全培养基，然后将500mg/ml的工作液稀释成最高浓度5mg/ml，然后过滤，加入2ml到5mg/ml的离心管中。
混匀后加1ml0mg/ml 1.25mg/ml混匀后加1ml八、细胞污染处理1.我们实验室一般较少细胞污染，细胞污染时多出现不明游动物体、底部有连片黄色斑点、出现絮状或毛线状的菌落等，常伴有明显不适气味。
2、一经发现细胞污染，立刻上报不得隐瞒。
马上将被污染细胞移出培养箱（不要开盖，防止细胞交叉污染），在细胞房外向瓶内注入新洁尔灭，盖紧瓶口，扔进医疗垃圾桶。
3、将培养箱中的细胞，逐一在镜下观察是否已交叉污染，如发现已交叉污染做污染细胞处理，排除隐患后，将正常细胞移到另一培养箱中。
4、关闭污染培养箱的电源开关，将隔板取出，用新洁尔灭(1:1000-1:2000)擦拭，确保每个角落都擦到，后进行紫外照射2小时。
箱内除用洁尔灭擦拭外，还需用75%酒精擦拭，确保每个角落都不能遗漏。
5、将水槽清洗干净后用75%酒精擦拭，用新高压的超纯水换掉原先的水。
6、细胞移回的一周内，要细心观察是否污染的现象再次出现，一般污染为偶然事件，如再次出现就不是培养箱的问题，而是培养箱外部的问题如培养基、操作、外部带环境等。
十、常用试剂的配制及保存1、完全培养基的配置：空白培养基+1%双抗（Hyclone)+10%胎牛血清（目前使用的是Gibco 灭菌过滤过的，配置时无需过滤）例如：500ml 的DMEM 空白培养基+55mlFBS+5.5ml 双抗2ml(5mg/ml)1mlDMEM 1mlDMEM 1mlDMEM空白培养基：4℃保存。
双抗：-20℃保存，100ml/瓶，15ml离心管分装，用前解冻，避免反复冻融。
FBS：-20℃保存，500ml/瓶，50ml离心管分装，用前常温解冻，避免反复冻融。
胰酶（不含EDTA）：-20℃保存，500ml/瓶，50ml离心管分装，用前常温解冻，避免反复冻融。
冻存液2、MTT的配置：250mgMTT粉末+50mlPBS配置成5mg/ml的储存液，超声至完全溶解，分装100小管，每管500ul，标记好浓度和日期，用锡箔纸包好后放在-20℃避光保存，用时根据所需的量取用，用后不再放回。