分子克隆及细胞培养基本实验方法
分子克隆实验流程
分子克隆实验流程一、引物的稀释1、引物干粉冻存于-20℃，用前12000rpm离心1min；2、按引物管上的nmol数稀释，nmol=4.92，加49.2µL ddH2O至100µM；3、稀释至10µM（5µL引物F+5µL引物R+40µL ddH2O）二、目的基因的扩增实验前准备：生物安全柜紫外照射30min，模板DNA、水、引物、buffer，dNTP提前10min拿出解冻，用75%酒精擦拭移液器及台面。
扩增体系：Reagent 25µL 50µL10xbuffer (含Mg2+) 2.5µL 5µLdNTP (10mM) 0.5µL 1µLrT aq酶0.25μL0.5μLprimer (10μM) 1.25μL 2.5μLTemplate DNA 2μL4μLddH2O 18.5µL 37µL反应程序：（延伸时间按目的片段大小进行调整）95℃预变性3min（95℃变性30 s，60℃退火30s，72℃延伸45s）x3572℃后延伸7min4℃保持电泳：120V，加2µLloading buffer，上样5µL，1000bp marker 5µL小胶：2%，0.6g琼脂糖，30ml 1xTAE中胶：2%，1g琼脂糖，50ml 1xTAE大胶：2%，2g琼脂糖，100ml 1xTAE三、目的产物切胶回收（试剂盒）四、连接实验前准备：SolutionI在冰上融化连接体系：Reagent 10µL胶回收DNA(50ng/μL)4µLPDM-18T载体1µLSolution I 5µL反应条件：16℃，4h（PCR仪，热盖105℃）/ 4℃过夜五、转化实验前准备：开启42℃水浴锅实验步骤：样品+阴性对照（无质粒）+阳性对照（感受态带的质粒）1、把感受态细胞TOP10从-80℃冰箱拿出并放置于冰上解冻；2、每管分装30 - 50μL感受态细胞（冰浴）；3、向感受态细胞中加入5μL连接产物，冰浴30min。
常用分子克隆实验方法
常用分子克隆实验方法I一、植物总DNA的小量提取方法1：提取吸附法。
无须巯基乙醇、氯仿等有毒物质，产物无须Rnase处理。
(1)充分研磨。
称取约0.2克植物组织，加入液氮充分研磨3-5min，稍后加约1ml溶液A，继续研磨至略粘稠的组织匀浆，用大口1ml吸头将所有溶液移至1.5ml离心管中，55℃水浴30min；(2) 高速离心去杂质。
10,000rpm离心5min，取约600ul上清至新1.5ml离心管；(3) 核酸吸附。
往上清液中加入1倍的异丙醇，轻轻混匀，再加入总体积1/4已混匀的溶液B，静置3min;(4) 低速离心沉淀。
5000rpm离心1min，轻轻倒掉上清，并用吸水纸轻吸离心管口，再用移液枪吸走大部分残余液体；(5) 75%乙醇清洗。
加入1ml75%乙醇，5000rpm离心30s，轻轻倒掉上清，用吸水纸稍吸离心管口。
重复该步骤一次，再5000rpm离心30s，然后用移液枪吸走管底的残液，晾干5min；(6) 核酸洗脱。
加入约55ul TE（PH8.0）至管底，轻轻重悬硅土，静置3min，10,000rpm离心1min，用小枪头轻轻吸取出50ul管底溶液，冷藏。
方法2：CTAB法，此为在经典方法基础上，经过摸索改进，提高了得率，减少了污染。
(1)充分研磨。
称取约0.2克植物组织，加入液氮充分研磨3-5min，稍后加约1ml CTAB提取液，继续研磨至略粘稠的组织匀浆，用大口1ml吸头移至1.5ml离心管，65℃水浴30-60min。
(2) 氯仿抽提。
10,000rpm离心3min，取约600ul上清。
加入1倍的氯仿，轻轻混匀，10,000rpm离心3min，取上清再抽提1遍。
(3) 核酸沉淀。
加入预冷的1倍异丙醇或2倍乙醇，轻混匀，6000rpm离心3min，弃上清。
(4) 清洗沉淀。
轻加入1ml 75%乙醇，再吸掉上清，重复一次，倒置于吸水纸或横放于离心管架上晾干5min。
(5) 溶解DNA。
分子克隆实验标准步骤
分⼦克隆实验标准步骤分⼦克隆实验标准步骤⼀、常规分⼦克隆实验流程：⼆、分⼦克隆实验标准步骤（含实验编号）：1. PCR 扩增⽬的基因（编号Clone SOP-1）以本实验室常⽤酶KOD-Plus-Neo （TOYOBO ）为例体系（50ul ）：10×KOD buf 5uldNTP(2mM) 5ulMg 2+ 3ulPrimer1 1ulPrimer2 1ulTemplate50-200ngKOD0.5ulddH 2O up to 50ul程序：95℃2min98℃10s58℃30s 35cycle68℃2kb/min68℃7min12℃∞2.PCR产物的琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶的制备（编号Clone SOP-2）琼脂糖溶液的制备：称取琼脂糖，置于三⾓瓶中，按1%-1.5%的浓度加⼊相应体积的TBE或TAE缓液，将该三⾓瓶置于微波炉加热⾄琼脂糖溶解。
胶板的制备：①取有机玻璃内槽，洗净、晾⼲；②将有机玻璃内槽置于⼀⽔平位置模具上，安好挡板，放好梳⼦。
在距离底板上放置梳⼦，以便加⼊琼脂糖后可以形成完好的加样孔。
③将温热琼脂糖溶液倒⼊胶膜中，使胶液缓慢地展开，直到在整个有机玻璃板表⾯形成均匀的胶层。
④室温下静置30min左右，待凝固完全后，轻轻拔出梳⼦，在胶板上即形成相互隔开的上样孔。
制好胶后将铺胶的有机玻璃内槽放在含有0.5～1×TAE（Tris-⼄酸）或TBE（Tris-硼酸）⼯作液的电泳槽中使⽤，没过胶⾯1mm以上。
3.试剂盒回收DNA⽚段（编号Clone SOP-3）以本实验室常⽤DNA凝胶回收试剂盒（天根）为例使⽤前请先在漂洗液PW中加⼊⽆⽔⼄醇，加⼊体积请参照瓶上的标签。
①柱平衡步骤：向吸附柱CA2中（吸附柱放⼊收集管中）加⼊500µl平衡液BL，12,000rpm(~13,400×g)离⼼1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
（请使⽤当天处理过的柱⼦）②将单⼀的⽬的DNA条带从琼脂糖凝胶中切下（尽量切除多余部分）放⼊⼲净的离⼼管中，称取重量。
分子克隆技术实验指导
分子克隆技术DNA重组技术是在分子水平对基因进行体外操作，因而也称为分子克隆（Molecular Cloning）或基因克隆，是在体外对DNA分子按照既定的目的进行人工重组，并导入到合适的受体细胞中，使其在细胞中扩增和繁殖，以获得DNA 分子大量复制，并使受体细胞获得新的遗传特征的过程。
其基本原理是：将编码某一多肽或蛋白质的基因（外源基因）经过特定限制性酶切割以及与目标载体连接，组装到细菌质粒（质粒是细菌染色体外的双链环状DNA分子）中，再将这种质粒（重组质粒）转入大肠杆菌体内，这样重组质粒就随大肠杆菌的增殖而复制，从而表达出外源基因编码的相应多肽或蛋白质，并且来源于一个菌株的质粒是一个分子克隆，而随质粒复制出的外源基因也就是一个分子克隆。
分子克隆技术的成就对于工业、农牧业和医学产生深远影响，并将为解决世界面临的能源、食品和环保三大危机开拓一条新的出路。
实验前准备实验开始前，需准备好所需的试剂，如PCR扩增及酶切，连接所需酶类试剂及相应的buffer，均为TaKaRa产品分装，Buffer、dNTP、引物试剂等需要从-20℃取出至室温融化、涡旋震荡混匀离心后使用，酶类试剂从-20℃取出瞬时离心（小于4000 rpm）放置冰浴中备用。
还有各项实验所需的药品（如琼脂糖），以及配置好培养基，抽提质粒用的溶液一、二、三等试剂。
本次实验所涉及的常规仪器及耗材有：Thermo Scientific Arktik PCR仪，水平电泳槽，超净工作台，恒温水浴锅，紫外照胶仪，赛默飞公司提供的F1，F2和F3一系列量程的单道移液器等仪器，1.5ml离心管，玻璃试管，赛默飞公司提供的QSP盒装吸头及15ml离心管等。
接下来进入实验部分，本实验操作流程为：首先在GenBank中查询目的基因序列，然后根据得到的序列进行酶切位点分析及引物的设计，通过RT-PCR获取目的基因，酶切以及与载体连接，转化进入宿主菌中，针对得到的菌落进行菌落PCR快速筛选，得到初步的阳性克隆，最后通过质粒提取及鉴定，得到的阳性克隆，测序分析及得到正确的重组质粒。
分子克隆基本流程及技术原理
分子克隆基本流程及技术原理分子克隆是一种重要的实验技术，可用于制备大量的DNA和蛋白质，探索基因功能，研究生物学过程等。
其基本流程包括DNA片段选择、PCR 扩增、限制性内切酶切割、连接、转化和筛选等步骤。
以下将详细介绍分子克隆的基本流程及技术原理。
PCR扩增：接下来，使用聚合酶链反应（PCR）技术扩增DNA片段。
PCR是一种有效的DNA扩增方法，它通过反复复制DNA模板，生成大量的DNA片段。
PCR反应基本包括三个步骤：变性、引物结合和扩增。
-变性：将DNA模板加热至95°C，使其两个链分离，得到单链DNA。
-引物结合：将反应体系温度下调到适宜的引物结合温度，引物与DNA模板的互补序列结合，形成DNA-DNA复合物。
-扩增：在一定的温度下，聚合酶通过DNA-DNA复合物进行扩增。
扩增过程包括DNA链合成、DNA链延长、DNA链分离和DNA链结合。
多次循环后，可以得到大量的目标DNA片段。
限制性内切酶切割：在PCR扩增后，可选用特定的限制性内切酶切割目标DNA片段。
内切酶是一种具有特异性的酶，它能够在特定的DNA序列上切割产生特定的片段。
通过切割，可以克隆所需的片段，并在连接过程中提供黏性末端。
连接：将目标DNA片段与载体DNA（如质粒）连接起来。
连接可采用多种方法，如T4DNA连接酶方法、PCR重叠延伸法等。
连接时，需要确保目标DNA片段与载体DNA能够互补配对，并生成稳定的连接。
转化：将连接后的混合物转化到宿主细胞中。
转化可通过化学方法（如钙离子转化法）或生物方法（如细菌电穿孔法）实现。
转化后，将细胞培养在含有适当选择压力（如抗生素）的培养基中，这样只有转化成功的细胞才能存活。
筛选：根据实验目的选择合适的筛选方法。
通常，使用抗生素抗性标记和荧光蛋白等进行筛选，以识别并纯化所需克隆产物。
技术原理：-PCR技术：PCR技术是通过DNA聚合酶的模板依赖性合成，将DNA片段按特定序列进行扩增。
分子克隆部分实验报告
一、实验目的1. 学习分子克隆的基本原理和方法；2. 掌握质粒的提取、纯化、线性化及目的基因的插入等实验操作；3. 熟悉DNA的纯化、鉴定及重组载体的构建等实验技术。
二、实验原理分子克隆是指将目的基因片段从基因组DNA中分离出来，并在宿主细胞中复制和扩增的过程。
实验过程中，利用限制性内切酶切割目的基因和载体，通过连接酶将二者连接形成重组载体，然后转化宿主细胞，筛选出含有目的基因的克隆。
三、实验材料1. 质粒：pET-28a2. 目的基因：EGFP3. 限制性内切酶：BamHI、EcoRI4. DNA连接酶：T4 DNA连接酶5. DNA分子量标准：DL20006. DNA纯化试剂盒7. 转化宿主细胞：大肠杆菌DH5α8. LB培养基、氨苄青霉素9. 等等四、实验步骤1. 质粒提取与纯化（1）按照试剂盒说明书提取质粒DNA；（2）用DNA纯化试剂盒纯化质粒DNA；（3）检测质粒浓度和纯度。
2. 目的基因的线性化（1）用BamHI和EcoRI双酶切目的基因片段和载体；（2）用DNA纯化试剂盒纯化酶切产物；（3）检测酶切产物浓度和纯度。
3. DNA连接（1）将纯化的目的基因片段和载体进行连接反应；（2）将连接产物转化大肠杆菌DH5α；（3）在含有氨苄青霉素的LB培养基中培养转化菌。
4. 阳性克隆的筛选（1）提取转化菌的DNA；（2）用BamHI和EcoRI双酶切提取的DNA；（3）电泳检测酶切产物，筛选出与预期大小相符的重组质粒；（4）将重组质粒进行测序验证。
五、实验结果与分析1. 质粒提取与纯化：质粒浓度约为50ng/μl，纯度大于0.8。
2. 目的基因的线性化：酶切产物浓度约为10ng/μl，纯度大于0.8。
3. DNA连接：转化菌在含有氨苄青霉素的LB培养基中生长良好。
4. 阳性克隆的筛选：电泳结果显示，重组质粒大小与预期相符。
5. 重组质粒测序验证：测序结果与预期序列一致，表明目的基因已成功插入载体。
分子克隆的实验报告(3篇)
第1篇一、实验目的本实验旨在学习分子克隆技术的基本原理和操作步骤，掌握目的基因的扩增、克隆及表达，为后续相关研究奠定基础。
二、实验原理分子克隆技术是指将目的DNA片段从供体细胞中分离出来，通过体外重组、转化和转导等方法，将其插入到克隆载体中，再将其引入宿主细胞进行复制和扩增。
本实验采用无缝克隆技术，通过T5核酸外切酶、DNA聚合酶和DNA连接酶三种酶的共同作用，实现单片段或多片段与载体连接。
三、实验材料1. 试剂：限制性内切酶、DNA连接酶、T5核酸外切酶、DNA聚合酶、dNTPs、Taq DNA聚合酶、PCR引物、载体DNA、目的基因DNA、质粒提取试剂盒、琼脂糖凝胶电泳试剂盒等。
2. 仪器：PCR仪、凝胶成像仪、电泳仪、紫外灯、超净工作台、离心机、恒温水浴锅、移液器等。
四、实验步骤1. 目的基因扩增（1）设计引物：根据目的基因的序列设计特异性引物，引物长度一般在18-25bp，5'端添加限制酶切位点。
（2）PCR反应：配制PCR反应体系，加入引物、模板DNA、dNTPs、Taq DNA聚合酶等，进行PCR反应。
2. 载体线性化（1）酶切：使用限制性内切酶对载体DNA进行酶切，获得线性化的载体。
（2）去磷酸化：对单酶切得到的线性化载体进行去磷酸化处理。
3. 目的基因与载体连接（1）同源臂连接：将目的基因PCR产物和线性化载体进行同源臂连接，确保目的基因正确插入载体。
（2）连接反应：配制连接反应体系，加入目的基因PCR产物、线性化载体、DNA连接酶等，进行连接反应。
4. 转化与筛选（1）转化：将连接产物转化至宿主细胞中。
（2）筛选：通过抗生素筛选、酶切鉴定和测序等方法筛选出含有目的基因的克隆。
5. 目的基因表达（1）重组质粒提取：从筛选出的阳性克隆中提取重组质粒。
（2）重组质粒转化：将重组质粒转化至表达宿主细胞中。
（3）表达产物检测：通过Western blot、ELISA等方法检测目的蛋白的表达水平。
生物研究方法
生物研究方法生物学作为自然科学的一个重要分支，主要研究生命体的结构、功能、进化等方面的问题。
在开展生物学研究过程中，合理选择和应用适宜的研究方法至关重要。
本文将介绍10种常见的生物学研究方法，并对其进行详细描述。
1. 细胞培养法细胞培养法是一种通过体外维持活的细胞的方法。
在细胞培养中，细胞被置于含有营养物质的培养基中，维持其生长繁殖，并可用于观察和控制细胞的过程。
此方法广泛应用于生命科学及医学领域，被广泛应用于药物筛选、细胞生物学、免疫学、分子生物学等方面的研究中。
2. 分子克隆法分子克隆法是一种通过构建基因工程技术进行分子重组的方法。
该方法通过重复操作，将特定的基因分离、扩增、重组到载体中，构建到表达系统中，从而进行相关研究。
分子克隆技术具有重要的生物学研究应用价值，如基因挖掘、蛋白结构解析、基因组学及药物研发等方面。
3. 蛋白质分离与纯化法蛋白质分离与纯化法是一种将混合的蛋白质物质分离开来，并提高纯度的方法。
这种方法可以通过物理和化学方法，如凝胶电泳、电子显微镜、柱层析等，分离目标蛋白质，并提高其纯度。
该技术广泛应用于生命科学及医学领域，如药物制剂、蛋白质互作定位、酶催化机理研究以及研制治疗性蛋白质等方面。
4. 免疫印迹法免疫印迹法是一种检测、鉴定特定蛋白质的方法。
该方法主要通过对蛋白溶液进行电泳分离，并用对应的抗体进行检测，为研究某些蛋白质的分子机制、生物学功能、结构与功能等方面提供了重要的方法。
5. 定量PCR法定量PCR法是一种重要的分子生物学实验方法，其主要办法是利用荧光探针，通过定量分析模板DNA的扩增速率和PCR产物的含量，来确定DNA、RNA等模板分子在混合物中的相对数量。
该技术被广泛应用于基因表达、基因副本数检测、微生物检测以及病毒载量监测等方面。
6. 数据挖掘法数据挖掘法是一种用于提取生物学数据背后的统计信息和模式的方法。
通过使用机器学习技术，如神经网络、支持向量机、随机森林等，对数据进行分析和模式识别，可以得到特殊的生物学功能，例如鉴定蛋白质功能相关性、预测靶标物分子等方面。
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分子克隆及细胞培养基本实验方法1.载体构建实用操作技术1.1菌种的保存—20%甘油菌2体积菌液与1体积70%的甘油混合后，储存于-20℃或-70℃备用。
（甘油菌中甘油的浓度为20-30%均可）1.2甘油菌复苏、培养方法一、挑取甘油菌一环，接种在含100ug/ml Amp的LB固体培养基上（活化菌种），37℃培养过夜（约16小时）；挑取一个菌落转接在含100ug/ml Amp的LB液体培养基中，37℃振荡过夜（约12~16小时）。
方法二、直接吸取10~20ul甘油菌，接种在含100ug/ml Amp的LB液体培养基中，37℃振荡过夜（约12~16小时）。
1.3小规模制备质粒DNA（QIA miniprep kit ）适于从1~5ml 菌液中制备20ug高拷贝质粒⑴收集菌液，离心1000rpm，１分，弃上清⑵以250ul P1重悬细菌（P1中已加RNase）⑶加入250ul P2，颠倒4~6次轻混，约2~3分（轻混以免剪切基因组DNA，并免长时间消化）⑷加入350ul N3，迅速颠倒4~6次轻混；离心10分，13 000rpm⑸上清入QIAprep柱，离心30~60秒，滤液弃之⑹加入0.5ml PB洗，离心30~60秒⑺加入0.75ml PE洗，离心30~60秒，弃滤液，再离心1分⑻换新管，加入50ul EB，静置1分（EB 37℃预热），离心1分。
1.4酶切反应⑴体系构成（反应体系尽可能小！）pGEM3ZF-huCTLA4-Ig（ul）pAdTrack-CMV（ul）①dd.H2O 17 17②10×NEbuff 2 3 3③10×BSA 3 3④底物DNA 5 5⑤内切酶HindⅢ 1 1XbaⅠ 1 1Total : 30 ul 30ul⑵37℃水浴1~2小时，必要时延长酶切时间至12小时⑶酶切2小时后，取5-10ul 电泳观察酶解是否完全⑷65℃灭活内切酶⑸-20℃保存备用1.5回收目的片段（QIAquick Gel extraction Protocol）⑴胶，尽可能去除多余的胶，称重；⑵加入适量buff QG（300ul QG /100mg胶）；>2%的胶，应加大QG用量（600ulQG /100mg）；⑶水浴50℃，10min，每2-3min混匀一次，使胶完全溶解！必要时延长水浴时间，胶完全溶解后混合物颜色应为黄色，与buff QG 相似；⑷当DNA片段在<500bp或>4kb时，应加入异戊醇100ul/100mg胶，以提高产物量。
此步不离心。
DNA片段在500bp~4kb时，加入异戊醇并不能提高产量；⑸结合：将混合物转入QIAquick柱，离心13000rpm，1min；（柱容量800ul/次）；⑹洗：0.75ml buff PE，离心13000rpm，1min；（DNA用于盐敏感操作时，如平端连接、直接测序，加入PE后静置2-5min）；弃离心液，再离心13000rpm，1min，以去除剩余的乙醇；⑺将QIAquick柱置于一清洁的1.5ml Ep管，加入30~50ul buff EB或H2O （滴于QIAquick 膜上！），静置1min，离心15000rpm，1min；⑻-20℃保存备用。
1.6连接反应⑴体系构成（反应体系20ul，载体：目的片段=1：3-5，摩尔数比）反应组份数量（ul）①dd.H2O 8②T4 10×buff 2③载体ＤＮＡ（ul） 1目的片段（ul）8④T4DNA连接酶 1Total : 20 ul⑵16℃水浴12-16小时（过夜）⑶直接用于转化或-20℃保存备用1.7感受态细胞的制备⑴菌种10-20ul入5ml LB液体培养基（不加Amp），37℃振摇4-6 hr，至中对数期；⑵菌液冰浴10min，分装2管，离心（4℃，4 000-6 000rpm）收菌；⑶弃上清，将菌体悬浮于800ul 0.1M CaCl2（冰预冷）中，冰浴10min，离心（4℃，4000-6000rpm）；⑷再将菌体悬浮于200ul 0.1M CaCl2（冰预冷）中，冰浴，12-24hr可用。
菌体沉淀时，重悬操作要轻。
1.8转化⑴新鲜感受态细胞200ul，加入2-10ul连接产物，轻轻旋转混合，冰浴30-60min；⑵42℃热休克90sec，勿摇动试管，再冰浴2min；⑶加入液体LB培养基（无抗生素）800ul，37℃温和振摇45-60min；⑷离心4000-6000rpm，2min，弃去900ul上清；⑸剩余物重悬细菌，铺Amp板，平放20min，倒置培养10-14hr。
1.9鉴定重组子常规PCR法鉴定重组子（25ul反应体系，1ul菌液）或抽提质粒DNA酶切鉴定。
⑴PCR反应体系：试剂数量终浓度①dd.H2O 17.5 ul②10×PCR缓冲液 2.5 ul 1×③MgCl2（25mM） 1.5 1.5 mM④dNTPmix(2.5mM) 1 ul 50uM⑤上游引物（25pmol/ul）0.5 ul 0.5uM下游引物（25pmol/ul）0.5 ul 0.5uM⑥TaqDNA聚合酶(3U/ul) 0.5 ul 0.06U/ul⑦模板（菌液）1ul终体积25ul⑵PCR反应参数：94℃，5min；“94℃，30sec、50℃，30sec、72℃，1min”×20-30循环；72℃，6min；4℃，保存备用；⑶电泳鉴定，以挑选阳性重组子，注意阳性、阴性对照的设立。
2.大规模制备质粒DNA（QIAGEN Plasmid Maxi Protocol ）适于从100~250ml 菌液中制备100-200 ug高拷贝质粒⑴涂板挑取单克隆菌落，入LB选择性培养基，37℃振摇8hr后，取适量菌液（1/500-1/1000）入100-250ml LB选择性培养基（高拷贝100-250ml LB，低拷贝500ml LB），37℃振摇12-16hr；⑵收获菌液，4℃离心6 000rpm（6 000g）１5min，弃尽上清；注意：在此步可将菌（离心沉淀）冻存于-20℃，留待以后操作。
⑶以10ml P1重悬细菌（P1中已加RNase）；⑷加入10ml P2，颠倒4~6次轻混，室温放置5min（轻混以免剪切基因组DNA，并免长时间消化）；⑸加入冰预冷10ml P3，迅速颠倒4~6次轻混，冰上放置20min，以促进沉淀形成；⑹4℃离心13 000rpm（20 000g以上）30min（离心前，应再次混合样品）；上清入新管，再次离心13 000rpm（20 000g以上）15min；⑺第二次离心的同时，用10ml QBT缓冲液平衡QIAGEN柱，不需离心（重力引流）；⑻结合：快速移上清（第二次离心）入QIAGEN柱，使其在重力引流下进入树脂（resin）；⑼清洗：30ml QC洗2次（重力引流）；⑽洗脱：15ml QF缓冲液洗脱结合的DNA，将洗脱液收集入新管（可将洗脱液暂时存放于4℃数小时）；⑾沉淀：加入10.5ml 异丙醇（室温，以免增加盐沉淀），混匀，立刻于4℃离心9 500rpm（15 000g）30min（离心前在管底作好标记，此步重要！），小心缓慢地倒出上清（以免弃去DNA沉淀）；注意：此步如果DNA沉淀不可见，可以1.5ml 75%乙醇冲洗管底标记处，然后转移至1.5ml离心管，15 000 rpm（20 000g）30min，此时沉淀往往可见，可重复此步骤1次，以收集尽可能多的质粒DNA⑿再清洗：5ml 70%乙醇（室温，以免增加盐沉淀）洗，离心9 500rpm（15 000g）10min，小心缓慢地倒出上清；⒀空气中干燥沉淀5-10min ，以适当体积的TE,pH8.0 或10mM Tris-Cl, pH8.5 溶解DNA沉淀（注意冲洗管壁，过度吹打会剪切DNA应避免）；⒁琼脂糖凝胶电泳分析；⒂质粒DNA浓度测定（紫外分光光度仪），OD260/OD280=1.6~1.8。
3.细胞培养常规方法3.1 293细胞常规复苏、培养、传代及冻存⑴培养液配制：DMEM，加入NaHCO2 3.7g/L，庆大霉素8万u，调pH至7.0-7.2（比细胞生长所需终末pH低0.2-0.3），定容至1L，0.22um过滤分装即可；⑵293生长要求：DMEM，含2-10%的FBS（按不同实验对细胞生长速度要求的不同而不同）；⑶293细胞的复苏：取液氮中冻存的细胞1管，迅速置37℃水浴1-3min融化；转移至10ml离心管加入8ml DMEM 10%，轻轻吹打混匀，低速离心1000rpm，5min；弃上清，加入8ml DMEM 10%重悬细胞；转入25ml 培养瓶补足培养液，置CO2孵箱37℃、5% CO2培养；⑷293细胞的培养：DMEM 10%；⑸293细胞的传代（1：2-3）：弃培养液，NS或无血清培养液洗1-2次，加入适量（数滴，或1-3ml；按培养的293细胞代数而定，代数低时，胰酶适当多加，反之，可能数滴即可）0.25%胰酶消化液，37℃消化1-3min，镜下观察消化情况，待细胞变圆、脱离瓶壁时，轻轻拍打瓶壁，使细胞完全脱离，加入适量培养液轻轻吹打使之分散；转入10ml 离心管，低速离心1000rpm，2-5min；弃上清，加入适量DMEM 10%重悬细胞；转入适当大小培养瓶（1：2-3）并补足培养液，置CO2孵箱37℃、5% CO2培养；⑹293细胞的冻存：取生长对数期的培养细胞，常规消化、离心，细胞沉淀以1-2mlDMEM 10%重悬，计数；重悬细胞10% DMSO、40% FBS，以DMEM 10%补足体积，细胞终浓度为1×106/ml；转入冻存管1.5ml/Tube，封口膜封口，置-80℃冰箱24hr；次日将细胞转入液氮，长期保存。
3.2 L-O2细胞的培养⑴L-O2细胞生长要求：DMEM/1640（1：1）混合培养液，含5-10%的FBS（按不同实验对细胞生长速度要求的不同而不同）；⑵L-O2细胞的传代：比例1：3-5；⑶余基本同293细胞。
3.3细胞计数法⑴染色：常规消化、离心，弃上清，加入1或2ml培养液，轻轻吹打重悬细胞，吸20ul细胞悬液，加入760ul NS，加入20ul台盼蓝，混匀，置2-3min；⑵计数板：用96%酒精冲洗计数板后，用擦镜纸擦净，另擦净盖玻片1张，把盖片覆在计数板上，使之微微移向一侧，露出计数板台面少许，以便滴加细胞悬液；⑶加稀释液：滴加1-2滴已染色的细胞悬液，使之充满计数板和盖片间空隙中；⑷镜检：计算四大方格内细胞数，压中线者只计算左线和上线者；⑸计算公式：细胞数=4大格细胞总数/4×10 000×稀释倍数；本法：细胞数=4大格细胞总数×105；⑹按培养要求接种培养。