基因克隆步骤
基因克隆过程及注意事项
以猪APOA2基因为例一．提取总RNATRIzol法提取RNATRIZOL试剂是直接从细胞或组织中提取总RNA的试剂。
它在破碎和溶解细胞时能保持RNA的完整性。
加入氯仿后离心，样品分成水样层和有机层。
RNA存在于水样层中。
收集上面的的水样层后，RNA可以通过异丙醇沉淀来还原。
在除去水样层后，样品中的DNA和总蛋白也能相继以沉淀的方式还原。
乙醇沉淀能析出中间层的DNA，在有机层中加入异丙醇能沉淀出蛋白。
共纯化DNA对于样品间标准化RNA的产量十分有用Trizol试剂可以快速提取人、动物、植物、细菌不同组织的总RNA，该方法对少量的组织(50-100 mg)和细胞(5×106)以及大量的组织(≥1 g)和细胞(>107)均有较好的分离效果。
TRIZOL试剂操作上的简单性允许同时处理多个的样品。
所有的操作可以在一小时内完成。
TRIZOL抽提的总RNA能够避免DNA和蛋白的污染。
故而能够作RNA 印迹分析、斑点杂交、poly(A)+ 选择、体外翻译、RNA酶保护分析和分子克隆。
如果是用于PCR，当两条引物位于单一外显子内时，建议用级联扩大的DNase I(Cat. No. 18068)来处理抽提的总RNA。
并且利用DNA、RNA和蛋白质在不同溶液中的溶解性质，可以通过分层分别将不同层中的RNA（上层）、DNA（中层）、蛋白质（下层）分离纯化出来，效率极好。
Trizol试剂能促进不同种属不同分子量大小的多种RNA的析出。
例如，从大鼠肝脏抽提的RNA琼脂糖凝胶电泳并用溴化乙啶染色，可见许多介于7 kb和15 kb之间不连续的高分子量条带，（mRNA和hnRNA成分）两条优势核糖体RNA条带位于~5 kb (28S)和~2 kb (18S)，低分子量RNA介于0.1 和 0.3 kb之间 (tRNA, 5S)。
当抽提的RNA用TE稀释时其A260/A280比值≥1.8使用TRIzol注意事项TRIzol对人体有害，使用时应戴一次性手套，注意防止溅出。
基因克隆(包括DNA提取技术步骤)
基因克隆DNA克隆是指在体外将目的基因或DNA片段同能够自我复制的载体DNA 连接，然后将其转入宿主细胞或受体生物进行表达或进一步研究的分子操作的过程，又称为重组DNA技术。
DNA克隆涉及一系列的分子生物学技术，如目的DNA片段的获得、载体的选择、各种工具酶的选用、体外重组、导入宿主细胞技术和重组子筛选技术等。
一 DNA的提取二目的DNA片段的获得（酶切）三体外重组1 LB培养基的配制2大肠杆菌感受态细胞的制备3载体的选择四导入受体细胞五重组子的筛选1插入失活法实验一DNA提取取0.5克以下的鱼类组织或20ul血液：1 准备1.5ml离心管，加入500ul裂解液，取组织放入离心管，破碎。
（常温操作）2 恒温箱裂解，55℃。
30min。
3 加等体积Tris饱和酚(酚：氯仿：异戊醇25：24：1)，先颠倒混匀后静置抽提10分钟，离心4度12000g 10分钟。
（注意酚在油层下面）4 取上清（把枪头去掉部分，注意液面。
蛋白质凝胶停留在水相及氯仿相中间，而DNA位于上层水相中），加入等体积CI(氯仿：异戊醇24：1)，先颠倒混匀后静置抽提10分钟，离心4度12000g 10分钟。
5 汇集上清，加2倍无水乙醇(-30度保存)，颠倒混匀可观察到絮状DNA。
在-30度冰箱沉淀30min。
离心4度12000g 10分钟。
6 弃去上清，75%乙醇洗涤，7500g离心5分钟。
7 重复一次上述操作。
7 在无菌台干燥半小时，乙醇挥发。
8 溶解于200ulddwater。
9 定量DNA。
裂解液的配制1ml体系200ul 0.5M EDTA（PH=8.0高压灭菌。
作用抑制酶的活性。
）螯合DNA酶发挥作用需要的金属离子。
50ul 10%SDS（蛋白质变性剂）10ul 1MTris-cl（PH=8.0高压灭菌）缓冲溶液5ul PK（消化）735ul 灭菌超纯水EDTA（0.5 M，pH8.0）将186.1 g 二水乙二胺四乙酸二钠（EDTA-Na.2H2O）加入800ml水中，在磁力搅拌器上剧烈搅拌。
ta克隆原理及方法
ta克隆原理及方法随着科学技术的不断发展和进步，人类对生命的认知也越来越深入，其中涉及到许多重要的科学原理和方法，其中就包括“ta克隆原理及方法”。
这里就为大家详细阐述一下这个重要的科学概念。
1. 什么是“ta克隆原理及方法”？“ta克隆原理及方法”是一种基因克隆的技术，是将原始DNA断链，利用限制酶切割成一段片段，然后加入外源DNA，将新的DNA片段复制进入宿主细胞。
这种克隆方法通常是用来研究基因的功能、生命的本质和疾病发生机制的。
2. 具体的克隆步骤是什么？具体的克隆步骤包括以下几个方面：（1）选择限制酶：将DNA与限制酶一起切割是克隆的第一步，该酶会特异性的切割DNA的某些骨架部位，形成一条DNA的断点。
（2）连接DNA：将要克隆的DNA与载体DNA连接，可以使用克隆载体或自制的克隆载体，具体的操作需要根据不同的目的和载体而定。
（3）转化DNA：将克隆DNA浸入到感受态细胞中，让它被细胞吞噬。
（4）筛选转化细胞：将转化细胞浸入含有抗生素的培养基中，因为克隆载体中含有抗性基因，所以仅荣获克隆载体的细胞才能生长和繁殖。
（5）检验DNA：检验克隆的有效性和准确性，这个步骤既可以通过理论预测，也可以通过实验结果来验证。
3. “ta克隆原理及方法”在生物医学领域中的应用生物医学在人类健康与生命保障方面发挥着极为重要的作用，而“ta 克隆原理及方法”则在生物医学领域中有着广泛的应用。
例如，在研究基因发育和生长方面，常常需要对基因进行克隆和研究；在疾病诊断和治疗方面，也可以使用克隆技术改变人体基因细胞而实现治疗目的；在生物技术研发方面，也可以利用克隆技术进行基因重组和疾病疫苗研发等等。
总之，“ta克隆原理及方法”在现化科技发展过程中，已经成为了生物学领域的重要技术，其重要性和应用前景是相当深远和广泛的。
未来，随着科学技术的不断进步，将会有更多的生命科学成果和应用产生，这也将为人类健康和生活产生更大的贡献。
大肠杆菌基因克隆的基本步骤
大肠杆菌基因克隆的基本步骤嘿，咱今儿个就来聊聊大肠杆菌基因克隆那些事儿！你可别小瞧这大肠杆菌，它在生物领域那可是有着相当重要的地位呢！要进行大肠杆菌基因克隆，第一步，得先找到咱要克隆的那个基因吧。
这就好比你要去一个陌生的地方，得先知道目的地在哪儿呀！得通过各种技术手段，像侦探破案似的，把那个特定的基因给揪出来。
然后呢，就该准备载体啦。
载体就像是一辆小货车，要把基因这个“宝贝”给装进去，拉到它该去的地方。
这小货车可得选好喽，得合适才行，不然基因在里面不舒服可不行。
接下来，把基因和载体连接到一块儿。
这就好像给基因找了个“家”，让它安稳地待在里面。
这连接的过程可得仔细着点儿，不能有一丁点儿差错。
之后，把连接好的载体导入大肠杆菌里。
这就好比把货物运进了仓库。
这导入的方法也有好几种呢，就看哪种适合咱啦。
导入之后，就得让大肠杆菌好好生长啦。
给它提供适宜的环境，就像咱人得住在舒服的房子里一样。
让大肠杆菌在里面开开心心地生活，把咱的基因好好复制。
这时候你可能会问啦，那怎么知道基因克隆成功没呀？嘿嘿，这就得检测啦。
就像考试要看看成绩一样，得知道自己做得对不对。
咱再想想，这基因克隆就像是搭积木，一块一块地搭起来，最后搭成一个漂亮的城堡。
每一步都得小心翼翼，不能马虎。
你说要是中间出了差错会咋样？那可就麻烦啦，就像搭积木搭错了一块，整个城堡可能就歪了或者倒了。
所以每一个步骤都得认真对待呀！你想想，通过这些步骤，咱就能把一个小小的基因复制好多好多份，这多神奇呀！这就是科学的魅力，能让不可能变成可能。
总之呢，大肠杆菌基因克隆虽然听起来挺复杂，但只要咱一步一步慢慢来，肯定能成功。
咱可不能怕困难，要像勇士一样勇往直前！咱要相信，通过咱的努力，一定能在这个领域做出一番大成就！。
基因克隆 操作步骤原理及注意事项
一：提质粒1：提取ml的菌液放到EP管中，12000r/s 30s离心，去除菌液，加入100微升的TE 振荡混匀后加入200微升裂解液二，轻轻混匀，是使细胞破碎，同时使蛋白变性和保持其高碱性，再加入150裂解液三轻轻混匀是鞋包裂解开（最佳的效果是上层是蛋白，下层是透明的液体），离心10min，将液体转移到另一个EP管中，加入等体积的异丙醇，静置10min或更长（一般以析出的DNA为主蛋白次之），离心10min 12000rpm/s ，除去上清液，加入400微升的70%的乙醇洗（去除里面的有机溶剂，同时使DNA 沉淀），去除乙醇，室温下开口放置5-10min或放到烘箱中使乙醇挥发干，再加入20微升的水，跑胶看浓度溶液I：Tris-Cl控制PH；葡萄糖后最大的好处只是悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部；EDTA，无非就是要把大肠杆菌细胞中的所有二价金属离子都螯合掉，抑制DNase的活性，和抑制微生物生长。
溶液II：NaOH裂解细胞的作用；SDS主要是变性蛋白，也有溶解细胞的作用。
溶液III：3 M 醋酸钾钾离子置换了SDS中的钠离子形成了不溶性的PDS，而高浓度的盐，使得沉淀更完全。
SDS专门喜欢和蛋白质结合，平均两个氨基酸上结合一个SDS分子，钾钠离子置换所产生的大量沉淀自然就将绝大部分蛋白质沉淀了，同时大肠杆菌的基因组DNA也一起被共沉淀了；2 M 醋酸中和NaOH，因为长时间的碱性条件会打断DNA，所以要中和之。
25/50酚+24/50氯仿+1/50异戊醇的作用：酚抽提蛋白的作用；氯仿后可以增加比重，使得酚/氯仿始终在下层，方便水相的回收；异戊醇的添加，其作用主要是为了让离心后上下层的界面更加清晰，也方便了水相的回收。
乙醇---100%沉淀质粒的作用；70%洗质粒去离子的作用；RNase水：消化所提质粒中的RNA。
2：消化补到50微升体系，再加入5微升的RNase 放入37℃ 2-3个小时3：抽提加入150微升的TE补到200微升体系加入100微升的氯仿 100微升的苯酚充分混匀 12000rpm/s 10min 离心将上层液体转到新EP管中再像其中加入200微升的氯仿充分混匀，12000rpm/s 离心，取上层液体到新EP管中，加入1/4体积的5mol/L的NaCl 两倍体积的无水乙醇，放入-20℃ 3小时沉降后离心 12000rpm/s 10min ，70%的乙醇洗干，再晾干或烘干加20微升的水跑胶检测补充：酚氯仿法提取DNA的原理用酚抽提细胞DNA时，有什么作用？使蛋白质变性，同时抑制了DNase的降解作用。
1.基因克隆的步骤
基因克隆的步骤一、RNA的提取1. 提取RNA前将洗净干燥的瓷研钵放入-70℃预冷10 min；2. 从液氮罐中取出样品组织放入预冷的研钵中，加液氮淹没后立即研磨，边研磨边加液氮，整个过程都不要使液氮挥干；3. 趁冷，将样品粉末50-80 mg加入1.5 mL离心管后再加入1 mL Trizol，样品体积应不超过所使用Trizol体积的10%，然后按照Trizol试剂盒说明操作；4. 室温静止5-15 min。
对于某些蛋白、多糖或脂含量很高的细胞或组织Trizol裂解后可能会有不溶物或油脂状漂浮物，需12000g、4℃离心10 min，然后吸取澄清的Trizol裂解产物至一新的离心管中；5. 每mL Trizol中加0.2 mL氯仿。
小心盖上离心管，剧烈地涡旋振荡15 sec，室温（24℃）静置3-5 min；（必需步骤）6. 12000 g、4℃离心15 min，此时混合物分成三部分：底层为苯酚-氯仿层，中间层，上层水相层，RNA完全存在水相中；7. 把小于80%的水相层（每mL Trizol约可吸0.5-0.55 mL）转移至一新的离心管中，并弃去下面的有机相（小心避免吸到中间层）。
往水相中加入异丙醇来沉淀RNA，每使用1 mL Trizol，便加500 uL的异丙醇，颠倒混匀，室温下孵育样品10 min；8. 4℃、12000 g离心样本10 min弃去上清，每mL Trizol加入1 mL 75%乙醇，涡旋混匀，室温沉淀10 min后，7500 g、4℃离心5 min，弃上清。
再用离心机甩一下（5000rpm，离心1 s）；9. 小心吸走乙醇，短暂地在室温下置2-5 min，让RNA团风干，不要用离心干燥装置或真空干燥装置，因为过度干燥会导致很难用水重新溶解RNA，然后在55-60℃温浴10 min，然后-70℃保存。
[RNA]（ng/uL）=A260×40×稀释倍数[DNA]（ng/uL）=A260×50×稀释倍数纯DNA：OD260/OD280≈1.8（＞1.9，表明有RNA污染；＜1.6，表明有蛋白质、酚等污染）纯RNA：1.7＜OD260/OD280＜2.0（＜1.7时表明有蛋白质或酚污染；＞2.0时表明可能有异硫氰酸残存）二、M-MLV RT反转录1. oligo dT 1 uL + dNTP（2.5 mM）4 uL + 1-5 ug total RNA + 水= 12 uLHeat mixture to 65℃ for 5 min and quick chill on ice；2. 上述12 uL液体+ 5×Buffer 4 uL + 0.1 M DTT 2 uL + RNase OUT 1 uLMix contents of the tube，incubate at 37℃for 2 min3. 上述19 uL液体加M-MLV RT 1 uLIncubate tube at 25℃for 10 min；Incubate 50 min at 37℃；70℃for 15 min。
基因工程的五个基本流程
基因工程的五个基本流程一、基因工程的概述基因工程是一种通过改变生物体遗传物质的结构和组成，从而达到改变其性状和功能的技术。
基因工程技术的应用范围广泛，包括农业、医药、工业等领域。
二、基因工程的五个基本流程1.选择目标基因选择目标基因是进行基因工程的第一步。
目标基因可以是已知的具有特定功能的基因，也可以是未知的探索性研究对象。
在选择目标基因时需要考虑多个方面，如所需功能、适用范围、安全性等。
2.克隆目标基因克隆目标基因是进行基因工程的关键步骤之一。
克隆目标基因需要进行以下几个步骤：（1）提取DNA：从生物体中提取DNA。
（2）切割DNA：使用限制性内切酶将DNA切割成特定长度。
（3）连接载体：将目标DNA片段与载体连接起来。
（4）转化宿主细胞：将连接好的载体转化到宿主细胞中。
3.构建重组表达载体构建重组表达载体是进行基因工程的另一个重要步骤。
重组表达载体是将目标基因嵌入到载体中，使其能够在宿主细胞中表达。
构建重组表达载体需要进行以下几个步骤：（1）选择合适的载体：选择合适的载体，如质粒、病毒等。
（2）插入目标基因：将克隆好的目标基因插入到载体中。
（3）调节表达：调节重组表达载体的启动子和终止子，以控制目标基因在宿主细胞中的表达。
4.转染宿主细胞转染宿主细胞是将构建好的重组表达载体转移到宿主细胞中，使其能够在宿主细胞中进行表达。
转染宿主细胞需要进行以下几个步骤：（1）选择合适的宿主细胞：选择合适的宿主细胞，如大肠杆菌、哺乳动物细胞等。
（2）转染重组表达载体：将构建好的重组表达载体转移到宿主细胞中。
（3）筛选阳性克隆：通过筛选阳性克隆来确定成功转移和表达目标基因的细胞。
5.分离和纯化目标蛋白分离和纯化目标蛋白是将表达出的目标基因转化为蛋白质，并对其进行分离和纯化的过程。
分离和纯化目标蛋白需要进行以下几个步骤：（1）破碎宿主细胞：将表达目标基因的宿主细胞破碎，释放出目标蛋白。
（2）分离目标蛋白：使用不同的技术对混合物进行分离，如层析、电泳等。
基因克隆的步骤
基因克隆的步骤嘿，咱今儿就来讲讲基因克隆那些事儿哈！你知道吗，基因克隆就像是一场神奇的魔法之旅。
首先呢，咱得找到那个我们想要克隆的基因，这就好比是在茫茫人海中找到那个特别的人。
怎么找呢？这可得有点技术和耐心啦！科学家们会用各种巧妙的方法，就像侦探在寻找线索一样，去把那个关键的基因给揪出来。
找到了基因，接下来就得给它找个“家”啦。
这“家”就是载体，就像是给这个基因找了个舒适的小房子，让它能安稳地待着。
然后呢，把基因和载体连接起来，让它们紧紧地结合在一起，就像好朋友手牵手一样。
再之后，就是把这个带着基因的载体送进细胞里啦。
这可不是随便找个细胞就行的哦，得找个合适的，就好像给这个基因找个最合适的“幼儿园”。
细胞就会把这个基因当成自己的一部分，开始按照基因的指令工作啦。
你想想，这多神奇啊！就这么一步步地，一个新的基因就被克隆出来啦。
这就好像我们自己动手搭积木，一块一块地搭起来，最后就变成了一个漂亮的城堡。
那为什么要做基因克隆呢？这用处可大了去啦！可以用来研究疾病的发生机制呀，说不定就能找到治疗那些疑难杂症的方法呢。
还可以用来生产药物，让那些救命的药变得更容易得到。
这就像给我们的健康上了一道保险一样，多让人安心啊！基因克隆可不是一件简单的事儿哦，得有专业的知识和技术，还得有耐心和细心。
就像厨师做菜一样，每一步都要恰到好处，不然味道可就不对啦。
所以说啊，基因克隆真的是一门高深又有趣的学问。
它让我们对生命的奥秘有了更深入的了解，也为我们的生活带来了很多的可能。
你说，这是不是很神奇呢？咱可不能小看了这基因克隆的步骤，每一步都有着它的重要意义呢！。
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实验一大肠杆菌感受态细胞的制备及转化[实验原理]（供参考，试剂盒的Solution SS成分未知）细菌处于容易吸收外源DNA的状态叫感受态。
转化是指质粒DNA 或以它为载体构建的重组子导入细菌的过程。
其原理是：在0℃下的CaCl2低渗溶液中，细菌细胞膨胀成球形。
转化缓冲液中的DNA形成不易被DNA酶所降解的羟基—钙磷酸复合物，此复合物粘附于细菌细胞表面。
42℃短时间热处理（热休克），可以促进细胞吸收DNA复合物。
将处理后的细菌放置在非选择性培养液中保温一段时间，促使在转化过程中获得的新的表型(如Amp抗性) 得到表达。
然后再涂布于含有氨苄青霉素的选择性平板上，37℃培养过夜，这样即可得到转化菌落。
[仪器、材料与试剂](一)仪器1．小型高速离心机2．恒温摇床3．恒温箱4．‐20℃冰箱5．恒温水浴器(二)材料1．氨苄青霉素2．大肠杆菌DH5a3．pUC194．1.5mL 离心管5．枪头、枪6．试管、培养皿(三)试剂1．快速感受态细菌制备试剂盒（申能博彩公司产品）2．LB 培养液在950mL去离子水中加入：胰蛋白胨(tryptone) 10g酵母提取物(yeast extract) 5g NaCl 10g摇动容器直至溶质完全溶解，用Na0H调节pH至7.0，加入去离子水至总体积为1L，121℃湿热灭菌20min。
3．氨苄青霉素(Amp)，用无菌水配制成100mg／mL 溶液，置‐20℃冰箱保存。
[实验步骤]1．从大肠杆菌DH5a平板上挑取一个单菌落接于2mL LB培养液的试管中，37℃振荡培养过夜。
2．取50mL菌液转接到一个含有5mL LB培养液锥形瓶中，37℃振荡培养2小时。
以下步骤按修改后的试剂盒说明书进行。
3．用灭菌的枪头取0.5mL的大肠杆菌培养物于1.5mL灭菌离心管中，冰上放置3分钟后，加入0.5mL预冷的Solution SS。
在冰上小心地用1mL 枪头将细胞悬浮起来。
注意：1mL的取液器设定在500mL。
悬浮细胞要轻，防止细胞进入枪内。
4．将上述细胞分装于1.5mL离心管(离心管要在放在冰上预冷) 中，每管0.1mL。
细胞可以立即使用或储存。
5．将感受态细胞迅速转移到‐20℃或更低的低温冰中。
注意：在转移过程中要防止温度升高，解决的办法之一是在塑料袋里装上低温冰块，将细胞迅速转移到塑料里，将整个塑料袋放到低温冰箱内。
转化：1．新鲜制备的或‐20℃下保存的100mL感受态细胞，置于冰上，完全解冰后轻轻地将细胞均匀悬浮。
2．加入5mL pUC19质粒，DNA浓度为10pg/mL，轻轻混匀。
3．冰上放置30分钟。
4．42℃水浴热激60秒。
5．冰上放置2分钟。
6．加400mL LB培养液，37℃ 250转／分振荡培养30分钟。
7．室温下4000rpm离心5分钟，用枪头吸掉400mL上清液，用剩余的培养液将细胞悬浮。
8．将细菌涂布在Amp/LB琼脂平板上。
9．平皿在37℃下正向放置1小时，待接种的液体吸收进琼脂后，将平皿倒置，培养过夜。
[实验结果]经37℃培养过夜的、在氨苄青霉素/LB琼脂平板上出现的菌落即为pUC19质粒转化的大肠杆菌。
计数菌落总数，计算制备的感受态菌的转化效率，以每mg 质粒DNA 转化的菌落数表示。
实验二质粒DNA的提取[实验原理]碱裂解法提取质粒利用的是共价闭合环状质粒DNA与线状的染色体DNA片段在拓扑学上的差异来分离它们。
在pH值介于12.0‐12.5这个狭窄的范围内，线状的DNA双螺旋结构解开变性，在这样的条件下，共价闭环质粒DNA的氢键虽然断裂，但两条互补链彼此依然相互盘绕而紧密地结合在一起。
当加入pH4.8的醋酸钾高盐缓冲液使pH降低后，共价闭合环状的质粒DNA的两条互补链迅速而准确地复性，而线状的染色体DNA的两条互补链彼此已完全分开，不能迅速而准确地复性，它们缠绕形成网状结构。
通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA、蛋白质‐SDS复合物等一起沉淀下来，而质粒DNA却留在上清液中。
[仪器、材料与试剂](一)仪器1．恒温培养箱2．恒温摇床3．小型高速离心机4．高压灭菌锅(二)材料1．带有pQE‐31质粒和pUC18‐CAT质粒的两株大肠杆菌2．1.5mL 离心管3．枪头、枪(三)试剂质粒小量制备试剂盒(3S Spin plasmid MIniprep Kit V3.1,申能博彩公司)试剂盒的参考配方:Solution I 50mmo1／L 葡萄糖，5mmo1／L 三羟甲基氨基甲烷(Tris)Tris·HCl(pH8.0)，1.0 mmo1／L 乙二胺四乙酸(EDTA)(pH8.0)，Solution II 0.4mo1／L Na0H，2％SDS(十二烷基硫酸钠)，用前等体积混合Solution II I5mo1／L 醋酸钾，60 mL冰乙酸11.5mL 水，28.5mL TE缓冲液，10mmo1／L Tris·HCl1mmo1／L EDTA(pH8.0)，胰RNA酶(RNA酶A)，将RNA酶溶于10mmo1／L Tris·HCl(pH7.5)、15mmo1／L NaCl中，配成10 mg／mL的浓度，于100℃加热15min，缓慢冷却至室温，保存于‐20℃。
[实验步骤](一)提取质粒将3mL含Apm的LB液体培养基加入到两支试管中，分别接入含pQE‐31质粒和pUC18‐CAT的大肠杆菌，37℃振荡培养过夜。
以下的操作按试剂盒的说明书进行。
(附试剂盒说明书)(二)质粒的琼脂糖凝胶电泳将5mL洗脱液与3mL的DNA样品缓冲液混合，加于1.2% Agarose 做凝胶电泳分析。
附：试剂盒说明书3S Spin Plasmid Miniprep Kit V 3．1上海申能博彩生物科技有限公司bbst＠shl63．net www．试剂盒组成：组成K1910（50次）K1920（100次）K1930（250次）Solution I(a) 5m1 10m1 25m1Solution II(b) 10m1 20m1 50mlSolution lll 20m1 50m1 2x50m1Wash Solution (c) 22m1 2x22m1 5x22m1TE(d) 5m1 10m1 40m13S Column 50支100支250支Co11ection tube 50支100支250根说明书1份1份l份注：a)Solution I内含RNaseA，每次实验结束后，4℃保存。
b)温度低时，Soluion II有白色沉淀析出，37度以下保温溶解，摇匀后使用。
c)首次使用前，必须在Wash Solution 瓶中加入50ml无水乙醇，充分混勾后使用。
每次使用后将瓶盖旋紧，以保持Wash Solution中的乙醇含量。
d)TE pH8．0或者水均可以用十洗脱，但是用水洗脱DNA，效率通常要低—些。
抽提测序用质粒需要用水洗脱。
主要特点：● 采用改良的碱裂解方法，质量稳定，重复性好。
● 经济快速，每个抽提可以在20分钟内完成。
● 无需酚抽提，无需乙醇沉淀，无需CsCl离心。
● 质粒纯度高，洗脱体积小，适合于DNA全白动荧光测序。
实验操作步骤(从细菌中抽提质粒)1．将过夜培养的2m1细菌，测序用质粒抽提请用5m1细胞，高速离心1分钟，彻底去除上清。
2．加入100ml solution I，用枪头或振荡器充分悬浮细菌。
注意：对于低拷贝数的质粒，请用5m1细胞；质粒如果用于全自动荧光测序分析，请用5ml细胞，无需提高SolutionI，II和III的用量。
3．加入200ml Solution II，立即上下颠倒或用手指弹管底，使细菌裂解，室温放置(2分钟左右)至溶液变成澄清。
4．加入400ml Solution III，立即上卜颠倒5—10次，使之充分中和，室温放置2分钟。
注意：步骤2和3在冰上操作效果更佳。
5．高速离心，15，000转／分钟，10分钟。
无需低温离心。
注意：提高离心速度，使沉淀更加紧密，步骤6操作取上清更为方便。
6．取出2m1样品收集管和3S柱，在管壁标上样品号，将步骤5中的上清全部转移到(吸或倒入)3S柱里。
盖上离心管盖子(盖子也可以不盖，但是如果您同时有很多样品，担心混淆或弄翻溶液，建议您盖上盖子)，室温放置2分钟(室温放置时间不重要，可长可短)；用台式离心机室温高速(12，000转／分钟)离心1分钟。
注意：转移上清时不要吸取沉淀，否则会出现Genomic DNA和蛋白质污染。
离心管盖子盖上时，柱子内压的增加，可能会使部分溶液从柱子底部流出，为正常现象。
7．取下3S柱，弃去掉收集管中的废液，将3S柱放入同一支收集管中，吸取700ml Wash Solution到3S柱，离心1分钟。
8．重复步骤7一次。
9．取下3S柱，弃去掉收集管中的废液，将3S柱放入同—支收集管中，高速离心2分钟。
10．将3S柱放入干净的1．5m1的离心管中，在3S柱子膜中央加50ml TE或水，不要盖上离心管盖, 室温下放置2分钟；盖上离心管盖，室温高速离心1分钟。
注意：将TE或水预热到50℃左右可以提高洗脱效率。
测序用质粒用30ml预热的水洗脱，浓度一般满足测序要求。
11．洗脱的质粒可以立即用于各种分子生物学操作或‐20℃保存备用。
lml过夜培养细胞，质粒如果用50ml水洗脱，通常情况下可以取10ml 洗实验三DNA的琼脂糖凝胶电泳[实验原理]DNA分子在高于等电点的pH 溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。
由于糖—磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量碱基的双链DNA 几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样的速度向正极方向移动。
在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子本身的大小和构型，具有不同分子量的DNA片段迁移速度不一样，迁移速度与DNA 分子量的对数值成反比关系。
凝胶电泳不仅可分离不同分子量的DNA，也可以分离分子量相同、但构型不同的DNA分子。
一般提取的质粒有3种构型：超螺旋的共价闭合环状DNA(covalently closed circular DNA，简称cccDNA)，开环DNA，即共价闭合环状质粒DNA有一条链断裂，(open circular DNA，简称ocDNA)，线状质粒DNA，即质粒DNA 在同一处两条链都发生断裂(linear DNA，简称LDNA)。
由于这3种构型的质粒DNA分子在凝胶电泳中的迁移率不同，因此通常抽提的质粒在电泳后往往出现3条带，其中超螺旋质粒DNA泳动最快，其次为线状DNA，最慢的为开环质粒DNA。
[仪器、材料与试剂](一)仪器1．恒温培养箱2．琼脂糖凝胶电泳系统3．小型高速离心机4．高压灭菌锅5．紫外核酸检测仪(二)材料1．pQE‐31和pUC18‐CAT质粒(三)试剂1．50xTAE(50倍体积的TAE贮存液)配1000mL 50xTAE：Tris 242 g冰醋酸57 mL0.5mol／L EDTA 200 mLpH 8.02．凝胶加样缓冲液(6x)溴酚蓝0.25％蔗糖40％3．琼脂糖4．溴化乙锭溶液(EB) 0.5µg／mL5．250bp DNA 分子量标准[实验步骤](一)制备琼脂糖凝胶根据被分离DNA的大小，决定凝胶中琼脂糖的百分含量。