基因克隆及转基因方法
转基因技术常用技术
转基因技术常用技术
转基因技术是指通过人为手段将外源基因（即来自于不同物种的基因）导入到目标生物体内，并使其被目标生物体所识别和表达，从而改变目标生物的基因组成或表达状态的技术。
常用的转基因技术包括以下几种：
1. 基因克隆技术：通过PCR扩增技术和限制性内切酶切割技术，将需要进行转基因的基因分离和扩增出来；
2. 质粒载体构建技术：将目标基因插入到质粒载体中，将质粒载体导入到目标生物中，使目标生物体内的细胞能够表达目标基因；
3. 基因枪法：将目标基因直接射入到目标生物体内，使目标生物体内的细胞能够表达目标基因；
4. 细胞微注射技术：将目标基因和载体注入到目标生物体细胞中，使目标生物体内的细胞能够表达目标基因；
5. 向量病毒法：利用能够侵入生物细胞并将外源基因导入细胞核的病毒作为载体，将目标基因插入到病毒中，通过病毒感染将目标基因导入到目标生物体细胞中，使目标生物体内的细胞能够表达目标基因。
转基因动物与克隆动物的区别
转基因动物与克隆动物的区别：转基因，用人工方法将外源基因导入或整合到其基因组内，并能将此外源基因稳定的遗传给下一代的一类动物[1]。
由于转基因动物体系打破了自然繁殖中的种间隔离，使基因能在种系关系很远的机体间流动（有性繁殖）。
克隆，通常是一种生物技术，以人工诱导的无性生殖方式或者自然的无性生殖方式（例如：植物），产生与原个体有完全相同基因组之后代的过程。
一个克隆就是一个多细胞生物在遗传上与另外一种生物完全一样。
基因工程的内容，原理，步骤：是利用DNA重组技术，将目的基因与载体DNA在体外进行重组，然后把这种重组DNA分子引入受体细胞，并使之增殖和表达的技术[1]；取得符合人们要求的DNA片段，这种DNA片段被称为“目的基因”；构建基因的表达载体；将目的基因导入受体细胞；目的基因的检测与鉴定。
基因工程是人类根据一定的目的和设计,对DNA 分子进行体外加工操作,再引入受体生物,以改变后者的某些遗传性状,从而培育生物新类型或治疗遗传疾病的一种现代的、崭新的、分子水平的生物工程技术现代生物工程：现代生物技术包括基因工程、蛋白质工程、细胞工程、酶工程和发酵工程等五大工程技；可分为农业生物技术、医学生物技术、植物生物技术、动物生物技术、食品生物技术、环境生物技术等。
[1]生态系统(Ecosystem)是指在一个特定环境内，相互作用的所有生物和此一环境的统称。
此特定环境里的非生物因子（例如空气、水及土壤等）与其间的生物之间具交互作用[2]，不断地进行物质的交换和能量的传递，并借由物质流和能量流的连接，而形成一个整体，即称此为生态系统或生态系。
中国的环保策略：科学协调行业间关系，制定持续发展规划；实现森林资源的供需平衡，持续利用；建立自我调节的生态系统；提高人们的“绿色环保”意识；完善相关法律并严格执行；林业的可持续发展，城市的可持续发展公害public nuisance，凡由于人类活动污染和破坏环境，对公众的健康、安全、生命、公私财产及生活舒适性等造成的危害均为公害，由于大气污染、水体污染、噪声污染、振动、恶臭等所影响和侵害的是不特定的公众，所以由此产生的危害一般均称为公害。
基因的克隆方法大全
1.2.3 差异显示PCR〔DD RT-PCR〕
最先由Liang等于1992年报道,目前已广 泛在实验室使用.
主要LY〔A〕结构,在其3`端设计象5`-
T11GA样引物,该引物可与mRNA总数的
十二分之一结合,从而使这部分基因得到
逆转录,同时结合5`端的随机引物〔20条
染色体 T-DNA
染色体 目的基因野生株构建基因组 基因苗构建基因组文 库基因苗
阳性克隆
获得阳性克隆 目的基因
基因序列分析2，4 确定为基因
转座子标签法
转座子又称转座因子或者跳跃因 子,实际上也是DNA片段,它可以在生 物的染色体组中移动,从染色体的一个 位点跳到另一个位点,或从一条染色体 跳到另一条染色体上,引起基因功能的 改变.
8
已发展的相应基因克隆方法：
差减杂交〔SH〕 抑制性差减杂交〔SSH〕 差异显示PCR〔DD RT-PCR〕 DNA代表性差异分析〔DNA RDA〕 扩增限制性片段长度多样性〔AFLP〕 cDNA微阵列
9
差减杂交〔SH〕
最早由Lamar和Palmer于1984年提 出并用于雄鼠Y染色体的DNA研究.
10-mer〕,可m以RN使A不同长度的基因得到扩
增5. `
RP
A T C G
AAAAAAAA
A C
TTTTTTTTTT
G
3`
15
mRNA
5` RP
A T C G
AAAAAAAA
A C
TTTTTTTTTT
G
3`
AATTTTTTTT
ACTTTTTTTT
AGTTTTTTTT
TATTTTTTTT
TCTTTTTTTT
41
生物技术改良基因的关键技术方法
生物技术改良基因的关键技术方法基因改良是一种能够通过调整和修改生物体的基因组来改善其性状和特性的技术。
随着生物技术的发展，一系列关键技术方法被广泛应用于基因改良。
本文将介绍其中的几种重要技术方法。
一、基因克隆技术基因克隆技术是基因改良的关键方法之一。
通过基因克隆技术，可以获取特定目的基因的DNA片段，并进行进一步的研究和应用。
基因克隆的过程主要包括将目标基因从DNA源中提取，将其插入载体中，再将载体转化到宿主细胞中等。
最终通过筛选和鉴定，得到所需的基因克隆产物。
二、基因编辑技术基因编辑技术是近年来崭露头角的一种基因改良方法。
它通过对生物体中特定位点的基因进行精确的编辑和修饰，实现对遗传特性的准确改变。
基因编辑技术常用的工具包括CRISPR-Cas9系统和TALENs 等。
通过这些工具，可以实现基因的突变、插入或删除，从而改变生物的性状和特性。
三、转基因技术转基因技术是一种常用的基因改良方法，它将外源基因导入到目标生物的基因组中，使其表达并产生所需的性状或功能。
转基因技术的关键步骤包括筛选和获得目标基因、导入目标基因到宿主生物、确保目标基因在宿主生物中的稳定及高效表达。
转基因技术已经成功地应用于改良作物的抗病性、抗虫性以及增加产量等方面。
四、RNA干扰技术RNA干扰技术是一种基因沉默的方法，通过引导RNA分子识别和降解特定的RNA分子，从而抑制或阻断目标基因的表达。
RNA干扰技术可以通过转基因方式应用于生物体，也可以通过外源给予RNA分子进行基因沉默。
该技术在功能基因的研究以及病毒基因的治疗方面具有广泛的应用前景。
五、基因合成技术基因合成技术是一种通过化学方法合成指定序列的DNA片段的方法。
该技术可以用于合成目标基因的序列，进而进行基因改良的研究和应用。
基因合成技术可以人工合成大片段的基因，也可以合成人工序列的基因，从而为研究和改良基因提供了更大的灵活性和可操作性。
综上所述，基因改良的关键技术包括基因克隆技术、基因编辑技术、转基因技术、RNA干扰技术和基因合成技术等。
cdna基因克隆的基本原理和流程
一、CDNA基因克隆的基本原理CDNAplementary DNA）是DNA的互补序列，通过反转录酶将mRNA作为模板合成的一种DNA。
CDNA基因克隆是利用逆转录酶将mRNA逆转录合成cDNA，并通过PCR或其他方法将cDNA插入到质粒载体中，实现对目标基因的克隆。
二、CDNA基因克隆的流程1. RNA提取：首先需要从细胞中提取出总RNA，可以使用TRIzol等试剂进行RNA的提取纯化工作。
2. 反转录合成cDNA：将提取得到的RNA作为模版，利用逆转录酶进行cDNA的合成。
反转录反应通常包括RNA模版、随机引物、dNTPs、逆转录酶和缓冲液，并经过一系列温度循环反应，将mRNA 逆转录成cDNA。
3. cDNA纯化：为了避免反转录反应中产生的非特异性产物和杂质，需要对反转录反应产物进行纯化。
4. cDNA扩增：对cDNA进行PCR扩增，以获得目标基因的cDNA 片段。
PCR反应体系包括cDNA模板、引物、dNTPs、Taq聚合酶和缓冲液，通过一系列温度循环反应，扩增目标基因cDNA片段。
5. 酶切与连接：将PCR扩增得到的cDNA片段与质粒载体进行酶切，并在两者的黏端上连接。
6. 转化：将连接得到的质粒转化入大肠杆菌等细菌中，使其进行复制。
7. 筛选与鉴定：通过筛选和鉴定，选出携带目标基因cDNA片段的质粒，进行测序和分析，最终确定目标基因序列。
三、CDNA基因克隆的应用CDNA基因克隆技术已广泛应用于基因克隆、基因表达等多个领域。
在科研领域中，通过CDNA基因克隆技术可以方便快捷地获得目标基因的cDNA，实现对目标基因的研究和功能分析；在医药领域，CDNA基因克隆技术也被应用于基因治疗、蛋白表达等方面。
总结：CDNA基因克隆是一种重要的基因工程技术，通过反转录酶合成cDNA并将其插入到质粒中，可以方便地获取目标基因序列，具有广泛的应用前景。
掌握CDNA基因克隆的基本原理和流程对于开展相关实验研究具有重要意义。
植物转基因技术的原理和方法
植物转基因技术的原理和方法
1、植物转基因技术的原理
植物转基因技术是指将外源DNA片段插入到植物细胞的过程，从而改变植物的表型特征。
在植物转基因技术中，将外源DNA插入到植物细胞的过程包括以下几个步骤：
(1) DNA片段的生产和收集：DNA片段的生产和收集是通过一系列的生物技术手段来实现的，比如PCR扩增技术、染色体复制，等等。
(2)特異性克隆：特異性克隆是一种利用抗原受体系统的分子生物学技术，主要是通过聚合酶链反应的方法，将无菌的DNA片段植入到宿主细胞中，从而使改变细胞表型性状的抗原受体获得潜在的克隆特异来源。
(3) 载体特异性转染：载体特异性转染是将DNA片段植入到宿主细胞中的过程，它通常是利用哺乳动物质粒等载体将外源DNA片段植入到宿主细胞中。
(4) 转化：转化是植物细胞在受到DNA片段植入后，能够形成含有外源基因的植物的过程。
2、植物转基因技术的方法
(1) 诱导细胞抗性：植物转基因技术可以利用一些诱导剂，如多聚糖、双链RNA等，通过诱导植物细胞的自然抗性，让其增加免疫反应及抗外源性抗原的能力，从而提高转基因植物的转化效率。
(2) 共价结合技术：共价结合技术是一种利用化学方法将外源DNA植入植物细胞的技术，它通常利用某种活性稀释剂将DNA片段与
植物细胞表面形成稳定的共价结合，从而使外源DNA片段能够植入宿主细胞。
(3) 转化抗性：转化抗性是一种利用抗生素来抑制植物细胞的自然抗性，从而促进植物细胞内部外源DNA的转化。
一般常用的抗生素有青霉素和环丙沙星。
(4) 小麦内含体技术：小麦内含体技术是一种利用小麦内含体将外源DNA植入植物细胞的技术，它通常利用小麦内含体外质壁偶联（ECC）促进外源DNA的转化。
克隆和转基因关系的关系
克隆和转基因关系的关系
克隆和转基因是具有重要关系的分子生物学技术。
这两者均在生命科学领域有
重要应用。
从基因学层面来说，克隆技术涉及基因的复制，而转基因技术则是将基因转移到另一个非同源的表达体中。
因此可以说，克隆技术与转基因技术的根本区别在于基因的存储位置。
克隆技术是指通过改变或复制基因来影响生物体发育或功能的一系列技术。
在
该技术中，可以将一个细胞里的基因组复制给一个新的细胞（可能是大型有机体中的细胞或小型细胞，如细菌），从而获得相同基因组的繁殖体。
这种技术能够被用来创建新的种群（原为人工选择），或者用于获取具有某种基因表达的个体。
相比之下，转基因技术是一种基因工程的手段，用于改变一个生物的性状或行为。
它的操作原理是，先从一个物种中提取某个特定基因，再将其注入另一个物种，使其获得原物种所没有的某一特定能力。
转基因技术可以用来改变植物或动物的抗病虫性、抗药性和抗逆性，以及提高收获率和抵抗环境条件等性状。
例如，转基因技术可以用来生产保育型转基因植物，以增加农作物抗病虫性和耐旱性，减少农药的用量和污染。
从上述可以见，克隆技术主要对改变生物体的功能，而转基因技术则针对改变
某种特定性状，从而改变目标生物体的性状。
克隆是将一个细胞的基因复制到另一个细胞中，而转基因是将基因转移到非同源的表达体中，进而改变特定性状。
因此，克隆技术与转基因技术之间具有紧密的联系，但在研究和应用上又存在很大的差异。
它们在生物科学领域的应用十分广泛，在生物学和其他相关领域中都发挥了重要作用。
转基因的原理
转基因的原理转基因技术是一种通过改变生物体的遗传物质，使其获得特定的性状或功能的技术。
它是现代生物技术中的重要组成部分，被广泛应用于农业、医学和工业领域。
转基因的原理主要包括基因克隆、基因导入和基因表达等过程。
首先，基因克隆是转基因技术的第一步。
科学家们通过分子生物学技术，将感兴趣的基因从一个生物体中复制出来，这个过程涉及到DNA的定位、切割、连接和复制等操作。
通过基因克隆，科学家们可以获取到目标基因的大量复制品，为后续的基因导入和表达奠定了基础。
其次，基因导入是转基因技术的核心环节。
一旦获得了目标基因的复制品，科学家们就需要将其导入到目标生物体的染色体中。
这一过程通常通过基因枪、细菌介导转化、病毒介导转化等方法实现。
一旦目标基因成功导入到目标生物体中，它就会与其它基因一起参与到生物体的遗传调控网络中，从而表现出特定的性状或功能。
最后，基因表达是转基因技术的最终目的。
一旦目标基因成功导入到目标生物体中，它就会在特定的条件下被激活并表达出来。
这一过程涉及到DNA的转录、翻译和后续的蛋白质合成等生物学过程。
通过基因表达，目标基因所携带的性状或功能得以在目标生物体中得以表现，从而实现了转基因技术的应用目的。
总的来说，转基因的原理主要包括基因克隆、基因导入和基因表达三个过程。
通过这些过程，科学家们可以实现对生物体基因的精准操作，从而获得具有特定性状或功能的转基因生物体。
转基因技术的应用不仅在农业领域可以提高作物的产量和抗逆性，还可以为医学和工业领域提供更多的可能性。
随着生物技术的不断发展，相信转基因技术将会发挥越来越重要的作用。
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基因克隆及转基因
一、基因克隆及转基因过程
1、设计引物
软件是，用到里面的PrimerSelect和EditSeq。
一般原则：1、长度：18-25；
2、GC含量：40-60％，正反向引物相差不要大于5%；
3、Tm值：55以上（到65），实在不行50以上也可以，正反向引物相差不要大
于5；
4、3’端结尾最好是GC，其次是T，不要A；
5、正反向引物连续配对数小于4；
6、在NCBI上的Primer Blast上看引物特异性如何；
（如果克隆的话不能满足条件也没办法。
）
不是必须条件，但可以考虑：多个基因设计引物时，可尽量使Tm值相似，方便PCR。
步骤：
一、打开PrimerSelect和EditSeq。
二、在EditSeq中输入你的序列。
引物有一对F和R
1、对于F是从5’到3’，在序列的前部分选择长度为18-25bp的碱基，如果你是要验证就随便选，如果你是要克隆就在最开始选，不符合原则就只能在你选的后边增或减碱基。
2、将选择的F引物输入到PrimerSelect中，在File中选择Enter New Primer，复制，OK，然后可以看到引物的情况，看看长度、Tm、GC含量是不是符合标准，不符合就继续选。
3、对于R是从3’到5’，选中序列，在EditSeq的Goodies中选择第一个“反向互补”，此时序列已反向互补，按照前面F的方法搜索R的引物。
、
4、注意你想要的目的带的大小，比如序列是1000bp，你想PCR出来800大小的目的带，那
就要看看F和R之间的长度在你想要的范围内。
可以将R反向互补，在正向的序列中搜索R 在的位置，就是在EditSeq中选择Search，点击第一个Find，开始搜寻。
5、搜索完引物在PrimerSelec中的Report中选择前两个查看二聚体情况。
6、在NCBI上的Primer Blast上看引物特异性如何。
7、因为是克隆，所以引物要有酶切位点，酶切位点的加入主要考虑所用到的表达载体，在NEBcutter网站中输入总序列查看可用的酶切位点。
在引物上游加入酶切位点，注意加入时载体的表达的方向，前面的酶切位点在引物F上，后面的酶切位点在引物R上。
一般在引物上游还要加上两个保护碱基。
2、提取醋栗DNA
3、PCR扩增与目的基因回收
PCR先找合适的退火温度，找到后回收时就可以多PCR几管，一般我们用20ul的体系，PCR5管就可以回收，就是琼脂糖凝胶回收，将目的基因用刀片切下来，用试剂盒回收。
回收完可以再跑电泳检测一遍。
PCR：
20ul体系：灭菌水，若模板为质粒灭菌水；
；
10乘Taq ；
引物F、R各；
模板1ul；若为质粒就够；
最后加入Taq酶，Taq酶现用现拿。
过程：我们用的是预变性94℃3min；
然后进入循环（要进行克隆的话循环数最好不要超过30个），循环过程：变性94℃30s，退火退火温度下30s，延伸72℃时间根据目的基因长度和酶而定，一般Taq酶30s可以延伸1kb；
循环完成后，此时尚有正处于合成过程中的dna链,为了保证充分的得率,所以再增加7分钟的72℃延伸；
最后4℃保存待用。
4、双酶切
回收没问题就将回收的目的基因和表达载体质粒进行双酶切。
目的基因回收完可以直接用试剂盒提纯，因为就切下来很少的几个碱基，试剂盒柱上挂不住。
表达载体质粒酶切完要琼脂糖凝胶回收，回收大的片段。
回收完检测一遍。
4、连接
5、大肠杆菌转化
大肠杆菌感受态用的是DH5α。
步骤：
（1）打开42℃水浴锅。
（2）把感受态放在冰上化，不能放太久，，将质粒（连接产物）加感受态细胞50ul，指尖混匀。
（3）在冰上放30~40min。
（4）90s严格计时，放入水浴锅热激（42℃），之后立即放冰上1~2min，之后加入500ul 纯净LB液体培养基（37℃最好），混匀。
（5）放入37℃摇菌箱，45min~1h（180~200rpm）（这一步的目的是菌恢复活性）。
（6）离心（12000rpm，1min），然后只留100ul，用枪头吸打混匀，涂板（LB＋卡那抗生素的固体培养基）。
（7）放入37℃培养箱，倒置。
涂板、打开离心管和感受态离心管的过程都在超净工作台里进行。
7、挑菌及摇菌
长出单菌落后，超净工作台里挑菌，将菌挑在20ul的灭菌水中作为模板进行菌落PCR。
将检测没问题的菌进行摇菌。
摇菌步骤：把菌液分别倒入摇菌管中（10ml的摇菌管），再加入4mlLB液体培养基，加入4ul卡那（始浓度50mg/ml，终浓度50mg/L），放入摇床中（37℃）过夜摇菌。
8、保菌及提质粒
将摇的菌在超净工作台里分为三部分：
（1）保菌：500ul菌+500ul 50％甘油，混匀，放入-80℃超低温冰箱保存，备用；
（2）测序：1ml菌用于测序；
（3）提质粒：剩下的菌用试剂盒提质粒。
有时也送一部分提的质粒去测序。
9、农杆菌转化
没问题的质粒转入农杆菌感受态细胞（EHA105），步骤：
（1）打开37℃水浴锅；
（2）取2ul质粒+50ul或100ul感受态细胞，冰上放置30min；
（3）液氮中冷冻1min；
（4）37℃水浴溶化细胞；
（5）加500ul~1ml纯净LB液体培养基，混匀；28℃摇床培养2h（180~200rpm）；
（6）离心（12000rpm，1min），然后只留100ul，用枪头吸打混匀，涂板（LB＋卡那抗生素+Rif抗生素的固体培养基）。
（7）放入28℃培养箱，倒置，培养2~3天。
涂板、打开离心管和感受态离心管的过程都在超净工作台里进行。
10、挑菌及摇菌
挑菌及菌落PCR同7。
摇菌时加4ml LB液体培养基，4ul Kan，8ul Rif。
摇菌大约40多小时。
（此步为小摇）11、保菌
将摇的菌取500ul+500ul 50％的甘油保菌。
再用大三角瓶进行大摇，摇菌取1ml菌液+100ml LB液体培养基+100ul Kan+200ul Rif，过夜摇菌。
12、配侵染液
侵染步骤参考论文优化而来。
（1）配侵染液200ml：5％蔗糖，%L-77（有剧毒），有点难溶；
（2）大摇后的菌液测OD，要在~之间，高于这个值时死菌过多，侵染成功率低；
（3）将菌液倒入大点的离心管离心；
（4）倒掉上清，用枪把残余的上清吸净，加入少许（4、5ml）侵染液，用枪把菌打散打匀，倒入瓶中。
13、侵染
铁托盖上报纸，润湿，需用到黑塑料袋，戴上手套。
选择花骨朵多的拟南芥，不是花开的多的，要没开的多的拟南芥，用于侵染的拟南芥一般是四株长在一个小花盆中。
将所有花全泡到侵染液中，所有花均需沾湿，漏在外面的花用戴手套的手弄湿，泡2min 即可（注意不要沾到土，否则植物会死）。
然后将植株迅速平躺放到铁托中，用黑报纸盖住。
最后暗处理24h，第二天拿出来后正常培养。
注意：用于侵染的液体有菌和毒，避免碰到身上。
用于摇菌的瓶子，侵染的瓶子都要高温灭菌；用于装侵染液的瓶子最好用84消毒，要不用洗洁剂也行。
到这时就完成整个转基因过程了。
14、收种子
侵染后的植株看做T0代，侵染后1个月收种子，侵染后40天收第二批种子，但第一批最主要。
是将种子收到离心管中，晒干7~10d才能种。
15、筛选T1代
将种子铺到加入抗生素卡那和头孢的MS固体培养基中。
步骤：
（1）将种子放入中等EP管（10ml）中。
加满消毒液（%SDS，%NaClO3），手摇振荡15min。
（2）在超净工作台中倒掉消毒液，加满灭菌水，振荡洗涤，将种子完全打散。
（3）大离心机离心（3000g for 2min at 20℃），要用大摇菌离心管做载体，不然离心管盖会打开。
在超净工作台中倒掉无菌水，注意不要倒掉种子，这样共洗5次。
（4）加入琼脂糖悬浮种子，倒在或用枪打在板上，一个板3ml，涂匀，停几分钟，等水被板吸干后再封膜。
（5）暗处理春化3d。
每个板长的苗不一定多，有的可能就一两株活的，然后可以把活的苗在移到一个新的MS板上，长到可以时移到土中培养。