基因克隆常用的方法
基因克隆的技巧
基因克隆的技巧
基因克隆是生物学研究中常用的技术之一，它可以将感兴趣的基因从一个生物体中复制到另一个生物体中。
以下是基因克隆的一些常见技巧：
1. DNA提取：从源生物体中提取目标基因的DNA。
常见的方法包括溶解细胞膜、蛋白质降解和碱解。
2. 剪切和黏贴：利用限制酶（也称为内切酶）剪切目标DNA，并在相应的酶切位点上黏合连接，形成重组DNA。
3. DNA扩增：通过聚合酶链式反应（PCR）或其他扩增方法，复制目标DNA 片段，以获得足够数量的DNA进行后续实验。
4. 重组载体构建：将目标DNA插入载体DNA，形成重组载体。
载体可以是质粒、噬菌体或其他类型的DNA。
常见的方法包括限制酶消化和连接、启动子和终止子的选择，以及DNA酶切和黏接。
5. 转化：将重组载体导入宿主细胞。
常见的方法包括化学法、电穿孔法和基因枪法。
6. 筛选：使用适当的筛选标记（例如抗生素抗性基因）鉴定并筛选成功转化的细胞。
7. 分离和培养：分离并培养选出的转化细胞，以获得包含目标基因的克隆。
这些技巧在基因克隆中被广泛使用，但具体的操作和条件可能会因实验需求和研究对象而有所不同。
DNA分子克隆技术(也称基因克隆技术)
DNA分子克隆技术（也称基因克隆技术）：在体外将DNA分子片段与载体DNA片段连接，转入细胞获得大量拷贝的过程中DNA分子克隆(或基因克隆)。
其基本步骤包括：制备目的基因→将目的基因与载体用限制性内切酶切割和连接，制成DNA重组→导入宿主细胞→筛选、鉴定→扩增和表达。
载体（vecors）在细胞内自我复制，并带动重组的分子片段共同增殖，从而产生大量的DNA分子片段。
主要目的是获得某一基因或NDA片段的大量拷贝，有了这些与亲本分子完全相同的分子克隆，就可以深入分析基因的结构与功能，随着引入的DNA片段不同，有两种DNA库，一种是基因组文库（genomic library）,另一种是cDNA库。
载体所谓载体是指携带靶DNA片段进入宿主细胞进行扩增和表达的工具。
细菌质粒是一种细菌染色体外小型双链环状结构的DNA，分子大小为1-20kb，对细菌的某些代谢活动和抗药性表型具有一定的作用。
质粒载体是在天然质粒的基础上人工改造拼接而成。
最常用的质粒是pBR322。
基因库的建造含有某种生物体全部基历的随机片段的重组DNA克隆群体，其含有感光趣的基因片段的重组子，可以通过标记探针与基因库中的重组子杂交等方法而筛选出来，所得到的克隆经过纯化和扩增，可用于进一步的研。
其主步骤包括：（1）构建基因库迅速的载体；(2)DNA片段的制备；（3）DNA片段与载体DNA 的连接；（4）包装和接种。
cDNA库的建造是指克隆的DNA片段，是由逆转录酶自mRNA制备的cDNA。
cDNA库包括某特定细胞的全部cDNA克隆的文库，不含内含子。
特异基因的筛选常用的方法有：（1）克隆筛选即探针筛选法；（2）抗体检测法，检测其分泌蛋白质来筛选目的基因；（3）放射免疫筛选法，查出分泌特异抗原的基因；（4）免疫沉淀法，进行特异基因的筛选。
核酸序列测定DNA的碱基序列决定着基因的特性，DNA序列分析（测序，sequencing）是分子生物学重要的基本技术。
基因的克隆方法大全
1.2.3 差异显示PCR〔DD RT-PCR〕
最先由Liang等于1992年报道,目前已广 泛在实验室使用.
主要LY〔A〕结构,在其3`端设计象5`-
T11GA样引物,该引物可与mRNA总数的
十二分之一结合,从而使这部分基因得到
逆转录,同时结合5`端的随机引物〔20条
染色体 T-DNA
染色体 目的基因野生株构建基因组 基因苗构建基因组文 库基因苗
阳性克隆
获得阳性克隆 目的基因
基因序列分析2，4 确定为基因
转座子标签法
转座子又称转座因子或者跳跃因 子,实际上也是DNA片段,它可以在生 物的染色体组中移动,从染色体的一个 位点跳到另一个位点,或从一条染色体 跳到另一条染色体上,引起基因功能的 改变.
8
已发展的相应基因克隆方法：
差减杂交〔SH〕 抑制性差减杂交〔SSH〕 差异显示PCR〔DD RT-PCR〕 DNA代表性差异分析〔DNA RDA〕 扩增限制性片段长度多样性〔AFLP〕 cDNA微阵列
9
差减杂交〔SH〕
最早由Lamar和Palmer于1984年提 出并用于雄鼠Y染色体的DNA研究.
10-mer〕,可m以RN使A不同长度的基因得到扩
增5. `
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15
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41
基因克隆与表达及功能鉴定研究
基因克隆与表达及功能鉴定研究在现代生命科学领域中，基因克隆与表达以及功能鉴定是非常重要的研究方向之一，它涉及到许多生物医学、农业、工业和环境等领域的研究和实际应用。
本文将从基因克隆与表达的基本原理、方法、技术和应用，以及功能鉴定的原理、方法、技术和应用等方面进行探讨。
一、基因克隆与表达基因克隆是指通过分子生物学技术，将含有某个或某些特定基因的DNA序列从一个大的DNA分子（如染色体）中分离出来，然后插入到特定的载体DNA中，形成重组DNA分子的过程。
基因表达是指基因信息的转录和翻译过程，将基因的DNA序列转录成RNA分子，然后翻译成蛋白质分子的过程。
基因表达是生物体形成和发展的基础，也是生命活动的重要表现形式。
1. 基因克隆原理基因克隆的主要原理是利用限制酶、DNA连接酶、DNA聚合酶以及质粒或噬菌体等DNA载体的特性，将特定DNA序列插入到载体DNA中，形成重组DNA分子。
限制酶是一种能够识别、切割DNA分子特定序列的酶，其识别序列具有一定的特异性。
DNA连接酶是一种能够连接两个DNA分子的酶，常用的有T4 DNA连接酶和快速连接酶等。
DNA聚合酶是一种能够在DNA模板上合成互补链的酶，其作用是在重组DNA分子中完成互补链的合成。
2. 基因克隆方法基因克隆的主要方法有限制性片段长度多态性（RFLP）分析、聚合酶链式反应（PCR）克隆、原核表达克隆和真核表达克隆等。
RFLP分析是一种利用限制酶对DNA序列进行切割，并根据不同的RFLP位点进行区分的方法，其主要应用于基因型鉴定和进化研究等领域。
PCR克隆是一种利用PCR技术扩增目标基因或DNA片段，并将扩增产物克隆到载体DNA中的方法，其主要应用于基因检测、DNA测序和分子克隆等领域。
原核表达克隆是一种利用质粒或噬菌体等原核生物作为DNA载体，将外源基因转入细菌或古细菌等原核生物细胞中，通过蛋白质表达实现基因功能研究的方法。
真核表达克隆是一种利用真核生物（如哺乳动物、鸟类、昆虫、线虫等）作为DNA载体，将外源基因转入具有表达能力的真核细胞中，通过蛋白质表达实现基因功能研究的方法。
cdna基因克隆的基本原理和流程
一、CDNA基因克隆的基本原理CDNAplementary DNA）是DNA的互补序列，通过反转录酶将mRNA作为模板合成的一种DNA。
CDNA基因克隆是利用逆转录酶将mRNA逆转录合成cDNA，并通过PCR或其他方法将cDNA插入到质粒载体中，实现对目标基因的克隆。
二、CDNA基因克隆的流程1. RNA提取：首先需要从细胞中提取出总RNA，可以使用TRIzol等试剂进行RNA的提取纯化工作。
2. 反转录合成cDNA：将提取得到的RNA作为模版，利用逆转录酶进行cDNA的合成。
反转录反应通常包括RNA模版、随机引物、dNTPs、逆转录酶和缓冲液，并经过一系列温度循环反应，将mRNA 逆转录成cDNA。
3. cDNA纯化：为了避免反转录反应中产生的非特异性产物和杂质，需要对反转录反应产物进行纯化。
4. cDNA扩增：对cDNA进行PCR扩增，以获得目标基因的cDNA 片段。
PCR反应体系包括cDNA模板、引物、dNTPs、Taq聚合酶和缓冲液，通过一系列温度循环反应，扩增目标基因cDNA片段。
5. 酶切与连接：将PCR扩增得到的cDNA片段与质粒载体进行酶切，并在两者的黏端上连接。
6. 转化：将连接得到的质粒转化入大肠杆菌等细菌中，使其进行复制。
7. 筛选与鉴定：通过筛选和鉴定，选出携带目标基因cDNA片段的质粒，进行测序和分析，最终确定目标基因序列。
三、CDNA基因克隆的应用CDNA基因克隆技术已广泛应用于基因克隆、基因表达等多个领域。
在科研领域中，通过CDNA基因克隆技术可以方便快捷地获得目标基因的cDNA，实现对目标基因的研究和功能分析；在医药领域，CDNA基因克隆技术也被应用于基因治疗、蛋白表达等方面。
总结：CDNA基因克隆是一种重要的基因工程技术，通过反转录酶合成cDNA并将其插入到质粒中，可以方便地获取目标基因序列，具有广泛的应用前景。
掌握CDNA基因克隆的基本原理和流程对于开展相关实验研究具有重要意义。
基因工程的基本步骤
基因工程的基本步骤
基因工程是一种利用生物技术手段来改变或调节生物体
自身基因表达的方法，从而达到改善生物体性状的目的。
其基本步骤可以概括为以下几个方面：
1. 基因克隆
基因克隆是基因工程学的基础技术之一。
首先要从生物
体的DNA中选取目标基因，并将其放入载体中，然后进行转化，使其进入宿主细胞中并被表达出来。
常用的克隆方法是PCR、
限制酶切和连接等。
2. 基因转染
基因转染是指将已构建好的目标基因载体导入到目标细
胞中，使其发生基因表达和突变。
目前常用的转染方式有病毒介导转染、转染剂克服细胞膜屏障、电穿孔和微射流等。
3. 基因突变
基因突变是一种常用的基因工程手段。
通过改变基因的
序列或结构，使其在生物体内表达的蛋白质产生变异，从而实现对生物体性状的改变。
突变方法包括化学诱变、定向突变等。
4. 基因表达
基因表达是指将生物体中的目标基因导入到宿主细胞中，并使其在细胞中高效表达的过程。
通过各种方式（如新增启动子序列、加强mRNA稳定性、引入信号肽等）来提高基因表达
效率。
5. 基因分析
基因工程完成后，需要进行基因的分析和检验，以确保
目标基因已成功表达且维持了稳定性。
常用的基因分析方法包括PCR、南方杂交、Western blot和质谱分析等。
总之，基因工程是一种综合使用多种生物技术手段的专业技术，它可以很好地提升生物体的性状和生命活力，为人类的健康和福祉做出贡献。
基因工程操作技术及原理之基因克隆
基因工程操作技术及原理之基因克隆1．克隆已知序列的基因根据已知基因的序列设计引物(primer)，利用PCR方法克隆基因。
即使不同种属之间，基因编码区序列的同源性高于非编码区的序列。
在某种植物的同源基因被克隆的条件下，可先构建eDNA文库或基因组文库，然后以该基因(或部分序列)为探针来筛选目的基因的克隆。
2．功能克隆根据基因的产物蛋白质克隆基因，利用这种方法分离基因，首先应根据已知的生化缺陷或特征确认与该功能有关的蛋白质，再分离纯化这一蛋白并制备相应抗体；或测定其氨基酸序列，推测可能的mRNA序列，根据mRNA序列设计相应的核苷酸探针或寡核苷酸引物。
利用抗体或核苷酸探针筛选基因组DNA文库或cDNA文库，也可利用寡核苷酸引物对核D NA或cDNA进行PCR扩增。
通过对阳性克隆或PCR扩增产物的序列分析鉴定分离基因。
3．作图克隆作图克隆又称图位克隆，是随着分子标记图谱的建立而发展起来的基因克隆技术。
根据连锁图谱定位的基因来克隆目的基因。
作图克隆是从连锁标记出发，通过大片段克隆(BA C库或YAC库)的染色体步移(chromommewalking)到达靶基因。
4．表型差异克隆利用表型差异或组织器官特异表达产生的差异来克隆基因，对于有些植物的性状，既不了解它们的基因产物也没有对它们进行基因定位，但已知它们的表型存在差异，利用这些差异，用下述方法也可克隆植物基因。
(1)消减杂交法即消减杂交法(subtractive hybridization)是通过鉴定两个mRNA间差异而分离基因的方法。
其基本方法是：提取两种差异细胞或组织的DNA后，反转录合成c DNA，并用限制性内切核酸酶切割成小片段。
将其中一个样品的酶切产物分成两份，分别连接不同的含有特定酶切位点的40bp左右的寡核苷酸接头，作为检测者(tester)。
用另外一个样品过量的酶切产物作为驱动者(driver)与带有不同接头的tester进行第一次杂交。
DNA分子克隆技术(也称基因克隆技术)
DNA分子克隆技术（也称基因克隆技术）：在体外将DNA分子片段与载体DNA片段连接，转入细胞获得大量拷贝的过程中DNA分子克隆(或基因克隆)。
其基本步骤包括：制备目的基因→将目的基因与载体用限制性内切酶切割和连接，制成DNA重组→导入宿主细胞→筛选、鉴定→扩增和表达。
载体（vecors）在细胞内自我复制，并带动重组的分子片段共同增殖，从而产生大量的DNA分子片段。
主要目的是获得某一基因或NDA片段的大量拷贝，有了这些与亲本分子完全相同的分子克隆，就可以深入分析基因的结构与功能，随着引入的DNA片段不同，有两种DNA库，一种是基因组文库（genomic library）,另一种是cDNA库。
载体所谓载体是指携带靶DNA片段进入宿主细胞进行扩增和表达的工具。
细菌质粒是一种细菌染色体外小型双链环状结构的DNA，分子大小为1-20kb，对细菌的某些代谢活动和抗药性表型具有一定的作用。
质粒载体是在天然质粒的基础上人工改造拼接而成。
最常用的质粒是pBR322。
基因库的建造含有某种生物体全部基历的随机片段的重组DNA克隆群体，其含有感光趣的基因片段的重组子，可以通过标记探针与基因库中的重组子杂交等方法而筛选出来，所得到的克隆经过纯化和扩增，可用于进一步的研。
其主步骤包括：（1）构建基因库迅速的载体；(2)DNA片段的制备；（3）DNA片段与载体DNA 的连接；（4）包装和接种。
cDNA库的建造是指克隆的DNA片段，是由逆转录酶自mRNA制备的cDNA。
cDNA库包括某特定细胞的全部cDNA克隆的文库，不含内含子。
特异基因的筛选常用的方法有：（1）克隆筛选即探针筛选法；（2）抗体检测法，检测其分泌蛋白质来筛选目的基因；（3）放射免疫筛选法，查出分泌特异抗原的基因；（4）免疫沉淀法，进行特异基因的筛选。
核酸序列测定DNA的碱基序列决定着基因的特性，DNA序列分析（测序，sequencing）是分子生物学重要的基本技术。
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3.2 Differential display PCR(DD-PCR) PCR(DDDD-PCR是在AP-PCR基础上发明的一种RTDD-PCR是在AP-PCR基础上发明的一种RTPCR方法,主要用于2 PCR方法,主要用于2种或多种类似生物个体在基因 表达上的差异分析。其基本原理是: 表达上的差异分析。其基本原理是:所有真核生物 的成熟mRNA都含有不同长度的poly+(A)尾部序列, 的成熟mRNA都含有不同长度的poly+(A)尾部序列, 根据poly+(A)内部的2个核苷酸排列的不同, 根据poly+(A)内部的2个核苷酸排列的不同,可以将 所有的mRNA分子分为12类 见图3)。 所有的mRNA分子分为12类(见图3)。
PCR反应模式图： 反应模式图： 反应模式图
Nested PCR反应模式图 反应模式图
根据蛋白质序列也可或cDNA 序列。如蛋白质序列是自己测定的,那么需要设计至少1 序列。如蛋白质序列是自己测定的,那么需要设计至少1对简并引 物(degen做序列测定才能鉴别所扩增产物的特异性。
另外,在基因克隆之后,如还要进一步做表达研究, 另外,在基因克隆之后,如还要进一步做表达研究,所使用的 PCR酶最好不用Taq DNA聚合酶,而采用其他有自我检测(reading PCR酶最好不用Taq DNA聚合酶,而采用其他有自我检测(reading proof)功能的酶, pfu。这样可以避免由于扩增过程中出现的点 proof)功能的酶,如pfu。这样可以避免由于扩增过程中出现的点 突变或终止密码子而导致整个研究结论的错误。
图３真核生物12种mRNA的序列特点
根据这12种mRNA序列可合成12种相应的反转录引物，即 根据这12种mRNA序列可合成12种相应的反转录引物，即 M’N’TTTTTTTT……,用其分别进行反转录,即可将所有mRNA分类合成 M’N’TTTTTTTT……,用其分别进行反转录,即可将所有mRNA分类合成 12种cDNA(于12个试管内)，然后再用随机引物,以这12种cDNA分别做 12种cDNA(于12个试管内)，然后再用随机引物,以这12种cDNA分别做 模板进行PCR扩增(见图1和图4)，那么与表型相关的mRNA就很容易被 模板进行PCR扩增(见图1和图4)，那么与表型相关的mRNA就很容易被 发现并克隆出来。但不论AP-PCR还是DD-PCR,都适用于2 发现并克隆出来。但不论AP-PCR还是DD-PCR,都适用于2种种源近似生 物或不同发育阶段的同一个体之间的比较。因而, PCR的模板必须是 物或不同发育阶段的同一个体之间的比较。因而,其PCR的模板必须是 来自2个生物或同一生物的不同发育阶段的mRNA。DD-PCR的优点是快 来自2个生物或同一生物的不同发育阶段的mRNA。DD-PCR的优点是快 速、方便,可以检测表达量极低的mRNA，但其技术条件要求较高，所 速、方便,可以检测表达量极低的mRNA，但其技术条件要求较高，所 扩增的mRNA的质量不能有差异, mRNA不应降解。目前这一方法已广 扩增的mRNA的质量不能有差异,即mRNA不应降解。目前这一方法已广 泛应用于生物表型相关基因的克隆及比较研究。
图1 应用AP-PCR法进行2种或多种表型特征类似的个体间指纹图谱分析或表型相关基因克隆 箭头所指扩增带为特异于个体(Ⅱ)的扩增产物
AP-PCR的操作一般采用两步法,即前10个循环多以较低的退火温度 AP-PCR的操作一般采用两步法,即前10个循环多以较低的退火温度 (annealing temperature)进行扩增,后20个循环则采用较高的退火温度扩增。APtemperature)进行扩增, 20个循环则采用较高的退火温度扩增。APPCR产物多较短,一般需高浓度的琼脂糖凝胶检测, PCR产物多较短,一般需高浓度的琼脂糖凝胶检测,也可用聚丙烯酰胺凝胶检测。 如扩增的模板为mRNA,通过比较扩增产物的强度,可以得知该基因在2 如扩增的模板为mRNA,通过比较扩增产物的强度,可以得知该基因在2种生物 或同一生物不同发育阶段的表达强度。另外, AP-PCR检测到与某一表型相关 或同一生物不同发育阶段的表达强度。另外,在AP-PCR检测到与某一表型相关 的基因或基因产物(mRNA)以后,下一步工作就是克隆出整个基因或mRNA。主 的基因或基因产物(mRNA)以后,下一步工作就是克隆出整个基因或mRNA。主 要操作程序为:(1)AP-PCR产物的提取、克隆及序列测定。首先将AP-PCR检测 要操作程序为:(1)AP-PCR产物的提取、克隆及序列测定。首先将AP-PCR检测 到的特定片段从凝胶中切下,提取DNA克隆到适宜的载体内( TA载体),再测定 到的特定片段从凝胶中切下,提取DNA克隆到适宜的载体内(如TA载体),再测定 其核苷酸组成。根据其核苷酸组成设计2个方向相反的引物(P-1,P-2,见图2)。引 其核苷酸组成。根据其核苷酸组成设计2个方向相反的引物(P-1,P-2,见图2)。引 物长度多在20 nt以上；退火温度在60℃以上；(2)将基因组DNA做适当酶切, 物长度多在20 nt以上；退火温度在60℃以上；(2)将基因组DNA做适当酶切,然 后在其两端连接上相同的接头(见图2,这种接头可从生物制品公司购买) 后在其两端连接上相同的接头(见图2,这种接头可从生物制品公司购买)。
3 未知序列的基因打靶
根据已知序列进行基因克隆, 根据已知序列进行基因克隆,多数是重复 别人的工作, 别人的工作,或者是在别人工作的基础上继 续自己的工作, 续自己的工作,因而不存在新基因的克隆过 程。对未知序列的基因克隆才是真正的创 造性研究。
3．1 随机引物法克隆未知序列基因
随机引物PCR(arbitrarily 随机引物PCR(arbitrarily primed PCR,AP-PCR)首先被用于基因组DNA或 PCR,AP-PCR)首先被用于基因组DNA或 RNA的指纹图谱(finger print)分析, RNA的指纹图谱(finger print)分析,后来也有人将这种方法用于克隆与表型相 关的基因或mRNA。该方法的理论依据是:表型受基因支配, 关的基因或mRNA。该方法的理论依据是:表型受基因支配,在一个生物体发 生了表型变化后,其基因组DNA很可能发生变化或出现不同基因的激活或关 生了表型变化后,其基因组DNA很可能发生变化或出现不同基因的激活或关 闭等;另一方面,如在寄生虫的发育过程中, 闭等;另一方面,如在寄生虫的发育过程中,不同发育阶段的虫体所表达的基因 很可能不同,如将不同发育阶段的虫体mRNA提取出来,用单一引物(随机引物, 很可能不同,如将不同发育阶段的虫体mRNA提取出来,用单一引物(随机引物, 其长度不超过16 nt)对不同时期的虫体mRNA进行扩增比较, 其长度不超过16 nt)对不同时期的虫体mRNA进行扩增比较,即可找出导致表 型变异的遗传学依据。这种方法是一种比较PCR,它要求至少有2 型变异的遗传学依据。这种方法是一种比较PCR,它要求至少有2种来自不同 表型但又很类似的基因组DNA或mRNA。AP-PCR扩增后的产物必须99%是一 表型但又很类似的基因组DNA或mRNA。AP-PCR扩增后的产物必须99%是一 致的, 致的,只有个别特异的产物出现在特异的表型个体中。该方法对表型或种源关 系相差甚远的生物个体之间没有比较意义(见图1)。 系相差甚远的生物个体之间没有比较意义(见图1)。
基因克隆的几种常用法
根据已知序列克隆基因 未知序列的基因打靶 根据已知探针克隆基因 用特异抗体克隆基因 特异基因的功能克隆
1、根据已知序列克隆基因
对已知序列的基因克隆是基因克隆方法中最为简便的一种。获取基因 序列多从文献中查取, 序列多从文献中查取,即将别人报道的基因序列直接作为自己克隆的依据。 目前,世界上主要的基因库有: 目前,世界上主要的基因库有: (1)EMBL 为设在欧洲分子生物学实验室的基因库, (1)EMBL,为设在欧洲分子生物学实验室的基因库, EMBL, 其网上地址为:/ebi-home.html; 其网上地址为:/ebi-home.html; (2)Genbank 为设在美国国家卫生研究院(NIH)的基因库, (2)Genbank,为设在美国国家卫生研究院(NIH)的基因库, Genbank, 其网上地址为:/web/search/index.html; 其网上地址为:/web/search/index.html; (3)Swissport TREMBL,Swissport是一蛋白质序列库, (3)Swissport和TREMBL,Swissport是一蛋白质序列库,其所含序列的准确 Swissport和 度比较高, 度比较高,而 TREMBL只含有从EMBL TREMBL只含有从EMBL库中翻译过来的序列。 EMBL库中翻译过来的序列。
2
根据已知探针克隆基因
这也是基因克隆的一种较直接的方法。首先将探针作放 射性或非放射性标记, 射性或非放射性标记,再将其与用不同内切酶处理的基因组 DNA杂交, DNA杂交,最后将所识别的片段从胶中切下来，克隆到特定 的载体(质粒、噬菌体或病毒) 的载体(质粒、噬菌体或病毒)中作序列测定或功能分析。这 种方法不但可以将基因克隆出来, 种方法不但可以将基因克隆出来,还能同时观察该基因在基 因组中的拷贝数。但在探针杂交后,要注意高强度(high 因组中的拷贝数。但在探针杂交后,要注意高强度(high stringent)漂洗,以避免干扰信号,即保证克隆的特异性, stringent)漂洗,以避免干扰信号,即保证克隆的特异性,同时节 省时间。
图４DD-PCR示意图 箭头所示为特异扩增产物
3.3 Representative difference (RDAanalysis PCR (RDA-PCR)
这是一种差减杂交 (subtractive hybridization) 与PCR相结合的技术，其整个操作程序完全不同于AP-PCR PCR相结合的技术，其整个操作程序完全不同于AP和DD-PCR。前2种方法是将两模板DNA或cDNA分别进行PCR DD-PCR。前2种方法是将两模板DNA或cDNA分别进行PCR 扩增,最后通过扩增产物的差异,分离和克隆特异扩增带, 扩增,最后通过扩增产物的差异,分离和克隆特异扩增带, 其缺点是需要将特异扩增产物从胶中切下来,提取DNA,再 其缺点是需要将特异扩增产物从胶中切下来,提取DNA,再 扩增后才能克隆。RDA-PCR只扩增区别于某一表型的特异 扩增后才能克隆。RDA-PCR只扩增区别于某一表型的特异 基因，因而更便于扩增产物的克隆与分析(见图5)。 基因，因而更便于扩增产物的克隆与分析(见图5)。