1 植物基因克隆方法
植物遗传工程中的基因克隆与转化技术
植物遗传工程中的基因克隆与转化技术植物遗传工程是指通过改变植物的遗传物质，以达到改良、改变或创新植物性状的目的。
其中基因克隆与转化技术是植物遗传工程中的关键技术之一。
基因克隆指的是通过将特定基因从一个生物体中分离并扩增形成DNA片段，使其能够在其他生物体中稳定表达。
转化技术则是将克隆的基因导入到目标植物体内，使其能够在植物表达并产生相应的功能。
一、基因克隆技术基因克隆技术是植物遗传工程中的关键环节。
首先需要从源生物体中分离出目标基因。
常用的方法有PCR扩增、限制酶切片段分离等。
通过PCR扩增技术，可以快速、高效地扩增目标基因，提供足够的DNA片段用于后续的克隆工作。
限制酶切片段分离则是利用特定的酶将目标基因从源DNA片段中切割出来。
接下来，克隆基因需要被插入到适当的载体中，常用的载体包括质粒和病毒等。
将基因插入载体后，需要通过转化技术将其导入目标植物体内。
二、转化技术转化技术是将克隆的基因导入到目标植物体内的关键步骤。
常见的转化技术主要有基因枪法、农杆菌介导法和化学法等。
基因枪法是通过将DNA微粒射入植物细胞，使基因得以导入的方法。
此方法简单、高效，对不同植物都适用，因此被广泛应用于植物遗传工程中。
农杆菌介导法则是利用农杆菌将目标基因导入植物细胞。
这种方法克服了基因枪法的一些限制，可以导入更长的DNA片段，但受适用植物种类的限制。
此外，化学法也是一种常用的转化技术，通过利用化学物质使植物细胞的细胞壁通透性增强，从而实现目标基因的导入。
三、应用前景与挑战基因克隆与转化技术在植物遗传工程中具有广阔的应用前景。
通过基因克隆和转化技术，可以实现对植物农艺性状的改良，提高植物的抗病虫害能力、耐逆性和产量，从而促进农业的可持续发展。
此外，利用基因克隆和转化技术还可以为植物生物制药、环境修复等领域提供解决方案。
然而，基因克隆与转化技术在应用过程中也面临一些挑战。
首先，对于目标基因的选择和定位仍然是一个复杂的问题。
植物基因克隆方法
RT-PCR实验中的常见问题与对策
问题1：在琼脂糖凝胶分析中看到少量或没有RT-PCR产物。 原因：
1）RNA被降解
建议解决方法：利用无污染技术分离RNA； 如果使用RNase抑制剂，不要
加热超过45℃或pH超过8.0。
2）RNA中包含逆转录抑制剂 建议解决方法： 通过乙醇沉淀RNA除去抑制剂。用70％（白质具有抗原性及 生物活性，所以除核酸探针外，还可以用核酸类探针筛选的 目的基因的分离。
第22页，共46页。
1、差异杂交筛选（differential hybridization screening） 2、mRNA 差异显示( differential display)
（4）复制时两条模板链是在解旋酶的作用下局部打开双链，而PCR两 条模板链通过变性完全打开双链
（5）复制时两条链的合成是同步进行的，而PCR两条链的合成可能不 同步
（6）PCR的DNA聚合酶为耐热的DNA聚合酶，而复制的聚合酶一般不 耐热
（7）复制一般为双向复制，而PCR反应中DNA合成是单向的
（8）复制时由多种蛋白因子参与，而PCR只有DNA聚合酶参与
淀进行清洗。 逆转录抑制剂包括：SDS，EDTA，甘油，焦磷酸钠，甲酰胺和胍盐。
第10页，共46页。
3）多糖同RNA共沉淀
建议解决方法： 使用氯化锂沉淀RNA以除去多糖。
4）起始RNA量不够
建议解决方法：增加RNA量。 对于＜50ng的RNA样品，可以在第一链
cDNA合成中使用0.1μg到0.5μg乙酰BSA。 5）RNA模板二级结构太多
• 目前认为真核生物的转录起始需要转录因子的参与。这些转录因子 通常由一个DNA结合域（BD)和一个或多个与其他调控蛋白相互作 用的转录激活域（AD）组成。用于酵母单杂交系统的酵母GAL4蛋 白即是一种典型的转录因子。
植物基因克隆的策略及方法
植物基因克隆的策略及方法首先，PCR是植物基因克隆的重要策略之一、PCR（聚合酶链反应）是一种体外复制DNA片段的方法，可以在短时间内扩增大量的特定DNA序列。
通过PCR可以快速准确地克隆植物基因。
PCR的基本原理是利用DNA 聚合酶酶学合成原理，在DNA片段两侧设计引物，将其与DNA片段的两侧结合，在适当的条件下进行DNA的聚合酶链反应，从而扩增目标基因。
PCR方法主要包括加热解性、引物连接、扩增和酶切等步骤。
其次，限制性酶切也是植物基因克隆的重要方法。
限制性酶切是指利用特定的限制性酶将DNA分子切割成特定序列的片段。
通过限制性酶切，可以将目标基因从植物DNA中剪切出来，然后进行进一步处理。
限制性酶切的基本原理是将特定的限制性酶加入反应体系中，该酶能识别和切割DNA的特定序列，从而将目标基因从DNA中剪切出来。
限制性酶切方法主要包括选择合适的限制性酶、反应条件的优化、酶切产物的回收和检测等步骤。
连接是植物基因克隆的另一种重要方法。
连接是指将目标基因连接到特定的载体DNA上，以便在目标植物中稳定地表达。
连接方法主要包括两个步骤：首先，需要处理载体DNA和目标基因的末端，以便它们能够相互连接；其次，利用DNA连接酶将载体和目标基因连接起来。
连接步骤中的处理涉及到DNA末端的修饰和处理，可以通过多种方法如限制性内切酶切割、引物扩增、酶切等进行。
最后，转化是植物基因克隆的最后一步。
转化是指将连接好的目标基因插入到目标植物的基因组中，使其能够在植物体内稳定表达。
转化的方法有多种，包括农杆菌介导的转化、基因枪转化、电穿孔转化等。
其中，农杆菌介导的转化是最常用的方法之一、农杆菌介导的转化是利用农杆菌作为载体将外源DNA导入到目标植物细胞中，通过农杆菌的自然寄生习性以及在植物细胞中特定的植物基因的活性表达，实现目标基因的稳定表达。
总的来说，植物基因克隆的策略和方法包括PCR、限制性酶切、连接和转化。
通过这些方法，可以快速准确地克隆植物基因，实现对植物遗传特性的改变和优化，为农业生产和植物遗传研究提供有力的技术支持。
植物生物技术中的基因克隆与基因工程技术
植物生物技术中的基因克隆与基因工程技术植物生物技术的快速发展为人们改良和改造植物基因提供了广阔的空间。
基因克隆和基因工程技术成为植物生物技术中的两个重要方面。
本文将以“植物生物技术中的基因克隆与基因工程技术”为题，探讨这两个方面的内容。
一、基因克隆基因克隆是指通过复制和扩增DNA序列，从而制备大量相同DNA分子的过程。
基因克隆是植物生物技术中最早也是最常用的技术之一。
1. PCR技术PCR技术（聚合酶链反应）是一种能够扩增DNA片段的方法，它可以制备大量具有相同DNA序列的片段。
在基因克隆中，PCR技术被广泛应用于检测和扩增目标基因，为基因工程技术的开展提供了基础。
2. 限制性内切酶限制性内切酶是一类能够识别特定DNA序列并对其进行切割的酶。
基因克隆中，通过选择性地使用限制性内切酶来切割DNA，将目标基因从其它无关基因中分离出来，实现基因的纯化与提取。
3. DNA连接DNA连接是将经过切割的DNA分子重新连接起来的过程。
连接后的DNA可以通过转化等方法引导其进入植物细胞，实现外源基因的导入。
二、基因工程技术基因工程技术是通过直接改变植物基因组中的DNA序列，对植物基因进行修改和调控的技术。
它在改良植物性状、提高植物品质等方面具有广泛应用价值。
1. 基因转化基因转化是指将外源基因导入植物细胞并使其稳定表达的过程。
通过选择合适的基因载体和转化方法，将目标基因导入植物细胞的染色体中，实现基因的稳定遗传。
2. 基因编辑基因编辑是指直接对植物基因组中特定基因进行修改和编辑的技术。
通过CRISPR/Cas9等工具，可以对植物基因组中的目标位点进行特定的编辑，实现基因的精确调控。
3. 基因沉默基因沉默是通过RNA干扰等方法，对特定基因的转录或翻译进行抑制的过程。
通过基因沉默技术，可以实现对植物性状的精确调控，提高植物产量和抗病能力等。
三、植物生物技术的应用前景基因克隆和基因工程技术在植物生物技术中的应用前景巨大。
植物基因的克隆｜植物基因克隆的基本步骤
植物基因的克隆｜植物基因克隆的基本步骤植物基因的克隆08医用二班姚桂鹏0807508245简介克隆（clone）是指一个细胞或一个生物个体无性繁殖所产生的后代群体。
通常所说的基因克隆是指基于大肠埃希菌的DNA片段（或基因）的扩增，主要过程包括目标DNA的获取、重组载体的构建、受体细胞的转化以及重组细胞的筛选和繁殖等。
本文主要介绍植物基因的特点、基因克隆的载体、基因克隆的工具酶、基因克隆的策略以及植物目的基因的分离克隆方法等内容。
关键词植物基因基因克隆载体工具酶克隆策略分离克隆方法Plant gene cloningIntroductionCloning (clone) refers to a cell or an individual organisms asexual reproduction produced offspring. Usually said cloning genes meansbased on escherichia coli segment of DNA (or genes), including the main course target DNA, restructuring of the carrier, transformation of receptor cells and reorganization of screening and reproductive cells. This paper mainly introduces the characteristics of plant gene and gene cloning and carrier, gene clone tool enzyme, gene cloning and plant gene strategy of separation cloning method, etc. KeywordsPlant gene cloning tool enzyme gene cloning vector method of separation of cloning strategy一、植物基因的结构和功能基因（gene）是核酸分子中包含了遗传信息的遗传单位。
基因工程 植物基因的克隆与转化_1_植物基因克隆的方法简介
科技知识讲座植物基因的克隆与转化(1)植物基因克隆的方法简介李成云 (云南省农业科学院生物技术研究所,昆明 650223)生物技术是世界新技术革命的主要内容之一。
它是以生物科学为基础,利用生物体(或是生物组织、细胞及其组分如酶)的特征和功能,用分子生物学的手段,改造生物特性、培育新品种甚至设计构建具有预期性状的新物种,与工程原理相结合进行加工生产,为社会提供商品和服务的一个综合性技术体系。
它包括医药生物技术、农业生物技术、海洋生物技术和环境生物技术等领域。
作为生物技术领域的先导技术 基因工程近年来发展迅猛,农业上的转基因动植物研究和开发取得了一系列的突破性进展,对于解决人类面临的资源短缺、环境污染、效益衰减等问题显示出巨大的作用。
随着生物技术产业化进程的加快,正逐渐形成一批新兴的生物技术产业。
它将成为世界经济新的增长点,对于21世纪农业生产乃至人类社会生产、生活的各个方面产生全面而深刻的影响。
基因工程育种不仅能够把各种来源的基因转化到农作物中,还可以重绘许多作物的遗传蓝图,并改变代谢途径或方向。
基因工程育种的前提和条件是必需克隆大量可供利用的功能基因。
基因的克隆就是利用DNA体外重组技术,将特定的基因从染色体上分离出来,插入到载体分子中。
基因克隆的主要目标是识别、分离特异基因并获得基因的完整序列,确定该基因在染色体上的位置,进一步研究该基因的生化功能,明确其对特定性状的遗传控制关系。
由于植物的基因组非常巨大,在遗传背景不很清楚的情况下,要从庞大的基因群体中分离出目的基因不是一件容易的事。
近年来,由于生物化学、酶学、分子遗传等学科的迅速发展,为基因的分离奠定了良好的基础,并提供了有效的手段。
在农业生物技术领域,人们利用以前掌握的大量有关植物优良性状基因的生物学和遗传学知识,已经从植物、动物、微生物中克隆出了与植物抗病、抗虫、抗除草剂、抗逆境、育性、淀粉、蛋白质、脂肪及与植物生长发育有关的许多基因。
植物的克隆与繁殖方式
植物的克隆与繁殖方式植物的克隆与繁殖方式是植物生命力的表现，也是植物生物学中的重要研究领域。
通过克隆与繁殖，植物可以迅速繁衍后代，适应环境变化，增强种群的竞争力和适应性。
本文将从植物克隆的定义、克隆的基本原理、植物的主要克隆方式以及植物的其他繁殖方式等方面进行探讨。
一、植物克隆的定义植物克隆是指通过非性别繁殖产生的新个体与母体具有相同的基因组合，并且不依赖于花粉和卵细胞的结合。
克隆可分为无性生殖和有性生殖两类。
无性生殖是指植物通过无性生殖器官繁殖，如植物的根茎、克隆体和萌芽等；有性生殖是指植物通过有性生殖器官如花粉和卵细胞结合繁殖。
二、克隆的基本原理植物克隆的基本原理是植物体内存在具有分裂能力的组织细胞，通过细胞分裂和器官发生的过程，可以形成独立的个体。
这些组织细胞具有相同的遗传信息，随着细胞的分裂，新的个体逐渐形成。
三、植物的主要克隆方式1.根茎克隆：根茎克隆是指植物的根部发育成为具有克隆能力的结构，从而形成新的个体。
例如，竹子的地下茎是一种常见的根茎克隆结构，它们能够长时间地存活并产生新的竹笋。
2.萌芽克隆：萌芽克隆是指植物通过侧芽或顶芽的发育形成新的个体。
例如，土豆植物的根茎部分会产生新的侧芽，这些侧芽可以长成新的土豆植株。
3.离体培养：离体培养是一种人工的植物克隆方法，通过将植物的组织切割并培养在适宜的培养基上，可以形成新的植株。
这种克隆方式常用于研究和生产中，例如繁殖珍贵的植物品种或进行基因工程实验等。
四、植物的其他繁殖方式除了克隆方式，植物还可以通过其他的繁殖方式进行生殖。
这些方式包括：1.有性生殖：有性生殖是指植物通过花粉和卵细胞的结合形成种子。
这种方式包括传粉、授粉和花粉管的生长等过程。
有性生殖能够产生具有遗传多样性的后代，提高物种的适应性。
2.孢子繁殖：孢子繁殖是植物通过孢子产生新个体的繁殖方式。
植物的孢子是通过间接发育形成新的个体，例如苔藓植物的孢子会发育成为新的苔藓植株。
五、总结植物的克隆与繁殖方式是植物生物学的重要研究内容，也是植物生存和适应环境变化的一种重要方式。
植物基因克隆的方法
植 物 基 因 克 隆 的 方 法
王 丽媛 ， 徐 明怡 ， 倪 红伟 ，
张 玉， 冷 海 南
（ 黑龙 江省科 学 院 自然与 生态研究 所 湿地与 生态保育 国家地 方联合 工程 实验室 ， 哈 尔滨 １ ５ ０ ０ ４ ０ ）
摘要： 基 因 克 隆技 术 是 挖 掘 新 基 因 、 分 离控 制 植 物 重 要 性 状 基
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
建议解决方法： 优化镁离子浓度。
5）因为扩增复杂模板导致引物错误起始
建议解决方法： 使用巢式PCR或递减PCR。
RACE PCR
PCR和细胞内DNA复制的相同点：
（1）两者都符合半保留复制模型，即两条链都可作为 模板，子代链中一条链来自于亲代链，另一条链 是新合成的
1、差异杂交筛选（differential hybridization screening） 2、mRNA 差异显示( differenti 4、 DNA 结合蛋白基因的分离
a
b
建库法
cDNA Library
• 传统mRNA差异显示技术（DDRT-PCR）是根据绝大多数真 核细胞mRNA3’端具有的多聚腺苷酸尾（polyA）结构，因 此可用含oligo（dT）的寡聚核苷酸为引物将不同的mRNA 反转录成cDNA。
• 该方法的创始人Liang P和Pardee A根据Poly A序列起点前2 个碱基除AA外只有12种可能性的特征，设计合成了12种下游 引物，称3’-锚定引物，其通式为5’-T11MN；同时为扩增出 polyA上游500bp以内所有可能性的mRNA序列，在5′端又 设计了20种10bp长的随机引物。这样构成的引物对进行PCR 扩增能产生出20000条左右的DNA条带，其中每一条都代表 一种特定mRNA种，这一数字大体涵盖了在一定发育阶段某 种细胞类型 structure
Promoter region Core promoter
● -75 -25 0 ATG
DNA 结合蛋白
转录因子的两个主要结构域：
a. DNA结合域 -DNA binding domain，简称DNA-BD，它可
识别效应基因上游的一段特定的区段， 即上游激活序列 (up-stream activating sequence, UAS)，并与之结合。
Trp-Asp-Glu-Asn-Asn-Met 1 2 22 2 1
(16 species)
p176
Ser-Glu-Try-Leu-Thr-Asn 6 2 26 42
(1152 species)
RT-PCR and RACE PCR
Reverse Transcription,
Rapid Amplification of cDNA Ends
建议解决方法： 将RNA和引物在不含盐及缓冲液条件下变
性/退火. 提高逆转录反应温度，对SuperScriptⅡ可以到50℃ ，对ThermoScript可以到65℃。
注意：不要在＞60℃时使用oligo(dT)引物，选择一个在反应 温度可以退火的GSP。对于＞1kb的RT-PCR产物，保持反应 温度≤65℃。 注意：不要在高于37℃时使用M-MLV。 如果不需要全长cDNA，在第一链反应中使用随机引物。
1、差异杂交筛选（differential hybridization screening） 2、mRNA 差异显示( differenti 4、 DNA 结合蛋白基因的分离
5、信号传递蛋白基因的分离 6、图位克隆技术（Map-based cloning）
利用一种植物的一段DNA序列作探针，从其它 植物中克隆同源基因
注意：有的基因在不同物种间同源性很高，有的则很低。
2、利用protein信息分离基因 前提是所研究的protein可以从植物中分离纯化
Antibody production Construction of Expression Library
算Tm值比所有真正的退火温度实际会高些或低些。 9）富含GC的模板
建议解决方法： 对于GC含量＞50％的模板，使用PCRx
Enhancer Solution。
问题2：在琼脂糖凝胶分析中观察到非预期条带。 原因： 1）引物和模板非特异性退火
建议解决方法：
以2℃到5℃间隔增加退火温度，减少退火时间。 在开始几个循环使用较高的退火温度，然后使用较低的退 火温度。 使用Platinum Taq DNA进行自动热启动PCR。 2）引物设计较差 避免在引物3‘端含有2到3个dG或dC。
• 目前认为真核生物的转录起始需要转录因子的参与。这些转 录因子通常由一个DNA结合域（BD)和一个或多个与其他调 控蛋白相互作用的转录激活域（AD）组成。用于酵母单杂 交系统的酵母GAL4蛋白即是一种典型的转录因子。
• GAL4的DNA结合域靠近羧基端,含有几个锌指结构,可激活酵母半乳 糖苷酶的上游激活位点(UAS);而转录激活结构域可与RNA聚合酶或 转录因子TFIID相互作用，提高RNA聚合酶的活性.在这一过程中， DNA结合结构域和转录激活结构域可完全独立地发挥作用.据此，我 们可将GAL4的DNA结合结构域置换为其他蛋白，只要他能与我们 想要了解的目的基因相互作用，就照样可以通过其转录激活结构域 激活RNA聚合酶，从而启动对下游报告基因的转录。
● 利用protein测序的氨基酸信息
Probe (oligonucleotides) Primer (degenerated primer)
(b) Oligonucleotide probes or generated primers for genes whose translation products have been characterized
6）PCR引物设计较差
建议解决方法： 避免在引物3‘端含有互补序列。避免可以形
成内部发卡结构的序列。设计Tm类似的引物。 7）镁离子浓度太低
建议解决方法： 从1mM到3mM，间隔0.5mM进行一系列反应
，确定对于每个模板和引物对的最佳镁离子浓度。
8）退火温度太高
建议解决方法： 把退火温度设定为低于Tm 5℃。因为公式估
（2）两者都需要引物 （3）两者都需要依赖DNA的DNA聚合酶 （4）两者的底物都是dNTP （5）DNA合成时都是在DNA聚合酶作用下按碱基配对
原则往3’-OH上加dNTP，形成3’，5’磷酸二酯键 （6）两者新合成链延伸的方向都是5’to3’ （7）两者DNA合成的保真度（精确性）都较高
PCR和细胞内DNA复制的不同点：• 从基因的功能上看可分为克隆及表达。
• 克隆由克隆载体构建。载体中具复制子、多克隆位点及选择 标记，可通过细菌具有控 制基因表达的序列(如启动子、SD序列、ATG、终止子等)，可在 宿主细胞中表达出克隆片段的编码产物。表达载体又有融合蛋白 表达载体及天然蛋白表达载体之分。
• 正是基于这一理的报告质粒。
• 首先将报告质粒整合入酵母基因半不连续复制，而PCR两条链的合成都是连续的 （2）复制时引物是由引发酶或引发体合成的，而PCR引物是在
反应前加到反应体系中 （3）复制需要在特定的复制原点起始，并且有终止点，而PCR
在有特异引物存在时在任何序列都可起始，并且没有终止点 （4）复制时两条模板链是在解旋酶的作用下局部打开双链，而
b. 转录激活域 -Transcriptional activation domain，简称AD，
它通过同转录机(transcription machinery)中的其它成分 的结合作用，启动UAS下游的基因进行转录。
酵母单杂交 Yeast one-hybrid system
• 酵母单杂交(yeast one hybrid)技术是体外分析DNA与细 胞内蛋白质相互作用的一种方法，通过对酵母细胞内报告基 因表达状况的分析，来鉴别DNA结合位点并发现潜在的结 合蛋白基因，或对DNA结合位点进行分析. 运用此技术，能 筛复杂的蛋白质分离纯化 操作 。
植物基因克隆方法
隋娜 山东师范大学生命科学学院
• 一、基因克隆（分子克隆molecular cloning） 通过体外重组技术,将一段目的DNA经切割、
连接插入适当载体，并导入受体细胞，扩增形 成大量子代分子的过程。
• 二、基因克隆的核心---体外重组 (Recombination) 人工将一段目的DNA插入一 个载体的过程。
（二）未知 Gene products 的基因分离
1、差异杂交筛选（differential hybridization screening） 2、mRNA 差异显示( differenti 4、 DNA 结合蛋白基因的分离 5、信号传递蛋白基因的分离 6、图位克隆技术（Map-based cloning）
• 将 差 别 表 达 条 带 中 的 DNA 回 收 ， 扩 增 至 所 需 含 量 ， 进 行 Southernblot或Northernblot或直接测序，从而对差异条 带鉴定分析，以便最终获得差异表达的目的基因 。
mRNA 差异显示 ( differential display)
表 达 文 库 法
PCR两条模板链通过变性完全打开双链 （5）复制时两条链的合成是同步进行的，而PCR两条链的合成
可能不同步 （6）PCR的DNA聚合酶为耐热的DNA聚合酶，而复制的聚合
酶一般不耐热 （7）复制一般为双向复制，而PCR反应中DNA合成是单向的 （8）复制时由多种蛋白因子参与，而PCR只有DNA聚合酶参与
（一）已知 基因产物ห้องสมุดไป่ตู้的基因分离 （二）未知 基因产物 的基因分离
（一）已知 Gene products 的基库
● 同源(homologous)DNA探针
为了克隆一个完整基因结构或研究调节序列。
● 异源(Heterologous)DNA探针
基因克隆的路线
载体DNA （vector）
DNA 重组
目的DNA （target fragment）
重组DNA （recombinant DNA ）
转化
宿主（host）
筛选、扩增 克隆（clone）
用何种方法取决于基因产物（Gene products）的 丰度以及gene的相关背景知识，
如 gene or its protein 的表达模式及初级结构等