植物基因克隆技术的发展与展望

植物基因克隆技术的发展与展望

摘要:基因克隆技术是生命科学技术领域里非常重要的部分，为了纵览植物基因克隆的理论和技术的发展创新历程．对各种技术体系、正向遗传学途径、反向遗传学途径(包含定位克隆和同源序列克隆及随后发展起来的电子克隆)进行了综述。随着后基因组时代的到来，植物基因克隆技术将发挥更加重要的作用。

关键词：基因克隆、定位克隆、转座子标簦法、基因芯片电子克隆

植物基因的克隆技术是生命科学研究的重要组成部分，是现代生命科学技术巾最核心的内容，它是随着20世纪70年代初DNA体外囊组技术的发明而发展起来的，其目标是识别和分离特异基因并获得基因完整序列，确定其在染色体上的位置，阐明其生化功能，并利用生物T程手段应用到生产实践巾去。一般来讲，基因克隆的策略町分为两种途径：正向遗传学途径和反向遗传学途径。现对在植物基因克隆过程巾运用的主要技术进行综述．以把握植物基因克隆技术的发展历程，并对未来的发展趋势进行展望。

1、定位克隆

定位克隆技术(positional cloning)又叫图位克隆(map—based cloning)．是枞据目标基因在染色体上的位置进行基因克隆的一种方法，适合于克隆编码产物未知的基因、其基本原理是根据功能基因在基因组巾存在相对较稳定的基因座，在利用分子标记技术对目的基因进行精确定位的基础上，用与目标基因两侧紧密连锁的分子标记筛选含有大的插入片段的基因组义库(如BAC和YAC)．用筛选到的阳性克隆构建目的基因区域的跨叠群，再通过染色体步行(chromosomewalking)逐步逼近候选区域或通过染色体登陆(chro—lnosolne landing)的方法获得含有目标基因的大片段克隆，将含有目标基因的大片段克隆进行亚克隆．或以大片段克隆作探针筛选cDNA义库：从而将目标基因确定在一个较小的DNA片段上并进行序列分析．通过遗传转化和功能互补试验分析，签定获得目的基因【1】。

植物巾运用图位克隆技术，从拟南芥、水稻、番茄、大麦、小麦、甜菜、马铃薯等植物巾分离了几十个重要的基因，并以抗病基因的克隆居多．如番茄的埘基因121．Hero基因；马铃薯的Cpa2基因⋯，拟南芥的RPW8基因⋯、PBSI基因⋯、Rppl3基因⋯和水稻的Pita、Xal、Pi —b等基因。随着比较基因组研究的兴起．利用同科异种植物问染色体的共线性进行比较作图．如以拟南芥、番茄和水稻为巾介来克隆其他十字花科、茄科和禾本科植物的基因，将成为一个新的发展方向

2、转座子标签法

转座子(Transposon)是口J从染色体的一个位置转移到另一位置的DNA片段，最早在玉米巾发现的．随后的研究表明，在生物界巾转座子是普遍存在的．并在生物的遗传进化方面有重要作用。转座子标签技术克隆基因的基本原理是．利用转座子插入到基因内部或邻近位点，会引起相火表型突变的特点．以转座子的已知序列为标签，克隆因转座子捕入而功能失活的基因，如果某基因的突变是巾于转座子插入而造成的，那么以转座子序列为探针就nr从变异株的基因组巾筛选出带有此转座子的部分基因．再以突变基因的部分序列作探针，即口J从野生型义库巾克隆m完整的基因，在植物中利用转座子的有玉米的Ac／Ds．En／Spm和金鱼草的Tn3等，其中应用最多的是AciDs双因子系统【2】。

利用转座子标记技术目前已克隆y-0的植物抗病基因有玉米抗网斑病基因Hml、Hm2“．番船抗叶霉病基因a之、a4d、cf巧、Cf-9、C}9B及cf一磁P型“。1⋯．烟草抗花叶病毒病基因

Ⅳ圳，亚麻抗锈病基因L6、M等2”a，该技术是目前分离克隆抗病基因有效T具之一．随着农杆菌介导转座子导入目标植物系统建成后，目前已在拟南芥、番笳、水稻巾有广泛的运用。同时，随着拟南芥、水稻等模式植物的基因组测序完成．研究的热点转向功能基因组，转座子标签技术己经成为构建植物突变体库，进行基因功能研究的核心技术【3】。

3、抑制性差减杂交

抑制消减杂交技术(SSIt)是1996年DiatehenkoL建立的以抑制性PCR为基础的DNA消减杂交片法∞I，其依据的技术主要有两点：①消减杂交；②抑制PCR。经抑制消减杂交后的eDNA 群体不仅富集了差异表达基因(目的基因)，而且目的基因问丰度的差异经过均等化作用已基本消除，使消减后的eDNA群体为丰度一致的目的基因群体，与其他差异表达基因克隆技术相比．SStl技术具有明显的优越性：①假阳性率大大降低．这是它的最大优点。这是巾它的两步消减杂交和两次抑制PCR所保证的。②高敏感性。在DDRT和cDNA—RDA巾．低丰度的mRNA 一般不易被检出，SSIt方法所做的均等化和目标片段的富集，保证了低丰度mRNA也丌『能被检出。③速度快，效率高。一次SSII反应nr以同时分离几十或成了T个差异表达基因。另外，此技术还具有背景低、直复性好的特点。

SSIt技术作为一种较为有效的分离差异表达基因的方法，已经被广泛用十豌豆对枯萎病的抗性机理研究”，马铃薯晚疫病抗病相火基因的分离研究唑大豆花叶病毒诱导特异表达基因的分离⋯．水稻幼穗发育早期特异表达基因的分离”I，胡萝h体细胞胚枞发育相父基因的分离”⋯，及玉米耐钔离子毒害基因的分离“等方面，显示了良好的应用前景【4】。

4、基因芯片技术

基因芯片又称DNA芯片、DNA微阵列(DNA ini—croarray)．是指将许多特定的寡核苷酸片段或基因片段作为探针．有规律地排列同定于支持物上，然后与待测的标记样品的基因按碱基配对原理进行杂交，再通过激光共聚焦荧光检测系统等对芯片进行扫捕，并配以计算机系统对每一探针上的荧光信号作m比较和检测．从而迅速得f+{所要的信息【5】。基因芯片具有高通晕、高信息_量、快速、并行检测、样品用晕少、用途广泛等优点．已经被广泛应用到基因表达检测、突变检测、基因组多态性分析和基因义库作图以及杂交测序等方面。

5、电子克隆

电子克隆，又称计算机杂交(computer hybridiza—tion)，是以数学算法为手段，以计算机和互联网为T具，利用现有的基因序列、表达序列标签(EST)、蛋白质序列和生物信息数据库发掘新基因，并通过生物学试验进行编码序列和功能验证而克隆基因的方法。电子克隆的理论基础是利用绝大部分功能基因的编码区比较保守．同源性较高的特点．采用生物信息学的手段，通过同源性分析延伸EST序列．以获得基因潜在的部分乃至全长的cDNA序列【6】。

电子克隆充分利用已有的生物信息资源，从ESTs序列人手、通过同源筛选，获得基因部分乃至全长cDNA序列，避免或减轻了构建与筛选cDNA义库等繁重、耗时的实验室T作，将大大加快基因克隆的方法。与传统的实验室克隆基因的繁杂、耗时、费用高、效率不高的方法相比，电子克隆更为简捷、快速、费用大大降低。随着多种模式生物的基因组测序T作的完成．以及各种生物的EST数据库的建立和充实，电子克隆必将在基因克隆的领域占有重要的一席之地．也必将加快新基因的发现与克隆的进程【7】。

6、趋势与展望

生物的基因是一片海洋，在基因克隆的领域，人类已经迈冉了l骚实的步伐，但要彻底破译生命的天书，基因克隆的研究仍任重而道远，基因克隆的进展依赖于基因克隆技术的发展与创新。

展望未来，基因克隆技术的发展将能有以下趋势。①高通量，高效率，经济快速的基因克隆技术将会领导潮流，如SSH、基因芯片等。生命科学的发展一日千里，效率低下、耗时耗力的克隆技术必将退出舞台。②全基因组测序将成为一种趋势。植物巾，随着拟南芥、水