植物基因克隆方法
植物基因定位与克隆技术
植物基因定位与克隆技术生命的基因组是由数以亿计的基因所组成，而每一个基因都拥有着许多重要的生物学功能。
在植物研究领域，基因定位与克隆技术被广泛应用于植物基因的分离、克隆和功能研究中，为科学家们提供了更深入的了解植物多样性和生命过程的机会。
植物基因定位技术是通过分析遗传连锁相连的遗传标记与感兴趣的基因间的关系来确定基因位置的一种方法。
这些遗传标记可以是单核苷酸多态性（SNP）、限制性片段长度多态性（RFLP）或微卫星标记（SSR）等。
定位分析过程需要建立一个遗传连锁图谱，并将基因的位置分配到该图谱中。
随着遗传标记和图谱的不断发展，越来越多的植物基因得以定位，这使得研究人员可以轻松地实现植物基因的图谱定位和深入研究。
植物克隆技术是一种通过DNA插入和选择筛选，使不含目标DNA片段的细菌自杀，从而获得含有目标基因DNA的单个细菌克隆的技术。
该技术的基本步骤包括DNA片段的制备、载体选择、DNA插入、转化和筛选。
利用克隆技术，科学家可以克隆任何感兴趣的植物基因，并进行进一步研究。
利用克隆技术，科学家们已经成功地枚举出了许多重要的植物基因。
植物基因定位和克隆技术的应用在植物育种和基因工程方面有着重要的地位。
研究植物基因定位可以提供植物多样性和特性的基本知识，帮助育种者选择最佳配对植物，促进多样性和适应性的提高。
另外，克隆技术提供了一个强有力的技术平台，使得研究者可以研究和使用各种巨大优势植物（比如转基因植物）来进行研究和创造。
植物基因定位和克隆技术在植物科学研究和开发中扮演着重要角色。
促进这些技术的进一步发展，将有助于进一步加强植物多样性、新型植物品种的开发和农业的发展。
我相信，我们只有更深入、更全面地了解植物基因定位与克隆技术的原理和应用，才能更好地掌握和运用这些技术。
植物遗传工程中的基因克隆与转化技术
植物遗传工程中的基因克隆与转化技术植物遗传工程是指通过改变植物的遗传物质，以达到改良、改变或创新植物性状的目的。
其中基因克隆与转化技术是植物遗传工程中的关键技术之一。
基因克隆指的是通过将特定基因从一个生物体中分离并扩增形成DNA片段，使其能够在其他生物体中稳定表达。
转化技术则是将克隆的基因导入到目标植物体内，使其能够在植物表达并产生相应的功能。
一、基因克隆技术基因克隆技术是植物遗传工程中的关键环节。
首先需要从源生物体中分离出目标基因。
常用的方法有PCR扩增、限制酶切片段分离等。
通过PCR扩增技术，可以快速、高效地扩增目标基因，提供足够的DNA片段用于后续的克隆工作。
限制酶切片段分离则是利用特定的酶将目标基因从源DNA片段中切割出来。
接下来，克隆基因需要被插入到适当的载体中，常用的载体包括质粒和病毒等。
将基因插入载体后，需要通过转化技术将其导入目标植物体内。
二、转化技术转化技术是将克隆的基因导入到目标植物体内的关键步骤。
常见的转化技术主要有基因枪法、农杆菌介导法和化学法等。
基因枪法是通过将DNA微粒射入植物细胞，使基因得以导入的方法。
此方法简单、高效，对不同植物都适用，因此被广泛应用于植物遗传工程中。
农杆菌介导法则是利用农杆菌将目标基因导入植物细胞。
这种方法克服了基因枪法的一些限制，可以导入更长的DNA片段，但受适用植物种类的限制。
此外，化学法也是一种常用的转化技术，通过利用化学物质使植物细胞的细胞壁通透性增强，从而实现目标基因的导入。
三、应用前景与挑战基因克隆与转化技术在植物遗传工程中具有广阔的应用前景。
通过基因克隆和转化技术，可以实现对植物农艺性状的改良，提高植物的抗病虫害能力、耐逆性和产量，从而促进农业的可持续发展。
此外，利用基因克隆和转化技术还可以为植物生物制药、环境修复等领域提供解决方案。
然而，基因克隆与转化技术在应用过程中也面临一些挑战。
首先，对于目标基因的选择和定位仍然是一个复杂的问题。
克隆基因的操作流程
克隆基因的操作流程
克隆基因是一种基因工程技术，它可以将感兴趣的基因从一个生物体中复制到另一个生物体中。
克隆基因的操作流程包括以下几个步骤：
1. 选择目标基因：首先需要确定感兴趣的基因，这个基因可以是任何生物体中的基因，如人类、动物、植物等，也可以是一种人工设计的基因。
2. 剪切DNA：通过限制性内切酶，将目标基因从DNA分子中切割出来。
这些切割出来的DNA片段被称为限制性内切片段。
3. 连接载体：将目标基因插入到载体DNA中。
载体是一种DNA 分子，可以承载基因并将其引入到目标生物体中。
在这个步骤中，需要使用一种酶来将目标基因和载体DNA连接起来。
这个过程被称为“重组”。
4. 转化宿主细胞：将重组后的载体DNA转化到宿主细胞中，使宿主细胞能够表达目标基因。
5. 筛选：筛选出表达目标基因的宿主细胞。
这个步骤可以通过一些特定的实验方法来实现，如PCR、Southern blotting等。
6. 验证：验证目标基因是否被正确地插入到宿主细胞中，并且是否表达出来。
通过这些步骤，就可以成功地克隆基因了。
克隆基因技术在医学、农业、工业等领域中有着广泛的应用，可以用来生产新药、改良农作物品种、生产高效酶等。
植物基因克隆的策略及方法
植物基因克隆的策略及方法首先，PCR是植物基因克隆的重要策略之一、PCR（聚合酶链反应）是一种体外复制DNA片段的方法，可以在短时间内扩增大量的特定DNA序列。
通过PCR可以快速准确地克隆植物基因。
PCR的基本原理是利用DNA 聚合酶酶学合成原理，在DNA片段两侧设计引物，将其与DNA片段的两侧结合，在适当的条件下进行DNA的聚合酶链反应，从而扩增目标基因。
PCR方法主要包括加热解性、引物连接、扩增和酶切等步骤。
其次，限制性酶切也是植物基因克隆的重要方法。
限制性酶切是指利用特定的限制性酶将DNA分子切割成特定序列的片段。
通过限制性酶切，可以将目标基因从植物DNA中剪切出来，然后进行进一步处理。
限制性酶切的基本原理是将特定的限制性酶加入反应体系中，该酶能识别和切割DNA的特定序列，从而将目标基因从DNA中剪切出来。
限制性酶切方法主要包括选择合适的限制性酶、反应条件的优化、酶切产物的回收和检测等步骤。
连接是植物基因克隆的另一种重要方法。
连接是指将目标基因连接到特定的载体DNA上，以便在目标植物中稳定地表达。
连接方法主要包括两个步骤：首先，需要处理载体DNA和目标基因的末端，以便它们能够相互连接；其次，利用DNA连接酶将载体和目标基因连接起来。
连接步骤中的处理涉及到DNA末端的修饰和处理，可以通过多种方法如限制性内切酶切割、引物扩增、酶切等进行。
最后，转化是植物基因克隆的最后一步。
转化是指将连接好的目标基因插入到目标植物的基因组中，使其能够在植物体内稳定表达。
转化的方法有多种，包括农杆菌介导的转化、基因枪转化、电穿孔转化等。
其中，农杆菌介导的转化是最常用的方法之一、农杆菌介导的转化是利用农杆菌作为载体将外源DNA导入到目标植物细胞中，通过农杆菌的自然寄生习性以及在植物细胞中特定的植物基因的活性表达，实现目标基因的稳定表达。
总的来说，植物基因克隆的策略和方法包括PCR、限制性酶切、连接和转化。
通过这些方法，可以快速准确地克隆植物基因，实现对植物遗传特性的改变和优化，为农业生产和植物遗传研究提供有力的技术支持。
植物生物技术中的基因克隆与基因工程技术
植物生物技术中的基因克隆与基因工程技术植物生物技术的快速发展为人们改良和改造植物基因提供了广阔的空间。
基因克隆和基因工程技术成为植物生物技术中的两个重要方面。
本文将以“植物生物技术中的基因克隆与基因工程技术”为题，探讨这两个方面的内容。
一、基因克隆基因克隆是指通过复制和扩增DNA序列，从而制备大量相同DNA分子的过程。
基因克隆是植物生物技术中最早也是最常用的技术之一。
1. PCR技术PCR技术（聚合酶链反应）是一种能够扩增DNA片段的方法，它可以制备大量具有相同DNA序列的片段。
在基因克隆中，PCR技术被广泛应用于检测和扩增目标基因，为基因工程技术的开展提供了基础。
2. 限制性内切酶限制性内切酶是一类能够识别特定DNA序列并对其进行切割的酶。
基因克隆中，通过选择性地使用限制性内切酶来切割DNA，将目标基因从其它无关基因中分离出来，实现基因的纯化与提取。
3. DNA连接DNA连接是将经过切割的DNA分子重新连接起来的过程。
连接后的DNA可以通过转化等方法引导其进入植物细胞，实现外源基因的导入。
二、基因工程技术基因工程技术是通过直接改变植物基因组中的DNA序列，对植物基因进行修改和调控的技术。
它在改良植物性状、提高植物品质等方面具有广泛应用价值。
1. 基因转化基因转化是指将外源基因导入植物细胞并使其稳定表达的过程。
通过选择合适的基因载体和转化方法，将目标基因导入植物细胞的染色体中，实现基因的稳定遗传。
2. 基因编辑基因编辑是指直接对植物基因组中特定基因进行修改和编辑的技术。
通过CRISPR/Cas9等工具，可以对植物基因组中的目标位点进行特定的编辑，实现基因的精确调控。
3. 基因沉默基因沉默是通过RNA干扰等方法，对特定基因的转录或翻译进行抑制的过程。
通过基因沉默技术，可以实现对植物性状的精确调控，提高植物产量和抗病能力等。
三、植物生物技术的应用前景基因克隆和基因工程技术在植物生物技术中的应用前景巨大。
克隆技术原理及其应用
克隆技术原理及其应用克隆技术，简称为克隆，是一种生物技术，旨在复制出完全一模一样的生物体或组织。
这种技术应用广泛，它不仅可以用来复制植物和动物的基因，还可以用来扩大种群数量、繁殖珍贵稀有物种，甚至用来治疗疾病。
本文将展开介绍克隆技术原理和其应用方式。
一、克隆技术原理克隆技术分为两种方法：一是生殖细胞核移植法，这种方法通俗理解即为“克隆”，而是同源染色体转移法。
1. 生殖细胞核移植法生殖细胞核移植法是现实中普遍运用的一种技术。
简单的讲，生殖细胞核移植法主要分三个步骤：第一步: 先从体细胞中获取细胞核。
第二步: 从一只已经发育成熟的生殖细胞（即卵细胞）中除去自身的细胞核，再将已经获取到的细胞核植入其中。
第三步: 将重组好的卵细胞植入一只“代孕母牛”体内，让其发育变成一只成熟的生殖体，从而完成了克隆的过程。
2. 同源染色体转移法同源染色体转移法通常运用在细菌基因工程等领域。
这种方法主要是将自由状态的脱氧核糖核酸（DNA）插入到宿主的染色体上，从而实现了新的表达。
同时，这种方法也一定程度上旨在和探究細胞自身的基因调查。
二、克隆技术的应用克隆技术作为一种新兴技术，应用的范围非常广阔，以下是一些克隆技术的应用场景：1. 种群扩大方式珍稀物种的保护已经成为当代社会关注的热点。
例如，在繁殖熊猫方面，现在应用比较普遍的就是克隆技术。
利用动物体细胞核移植完成动物体的克隆，可扩大珍稀物种的数量。
2. 农业领域在农业领域中，应用的场景也是非常丰富多彩的，比如克隆技术可以帮助种植业提高商品作物和食物的产量。
克隆技术还可以改良牛、猪、鸡等经济动物，进一步提高农业产品的质量和生产效率。
3. 神经退行性疾病治疗克隆技术的应用还可以解决许多人类疾病的预防和治疗，如心脏病、糖尿病、神经退行性疾病等更为严重的疾病。
一些实验结果显示，利用病人自己的细胞进行进行植入操作，可以显著地改善这些疾病。
4. 基因工程克隆技术还可以在基因工程领域裡作出贡献。
第6章目的基因的分离克隆(植物基因工程)课件
12
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14(2) 如何从cDNA中找到所需要的基因？15转录水平上的基因克隆方法
l 差别杂交筛选 l 扣除杂交 l 代表性差别分析 l 差异显示 l cDNA阵列杂交 l 基因表达系列分析 l 抑制差减杂交
筛选目的基因(核酸探针法、免疫结合法)因库应当能包括全部的基因组序 列。如果每一个克隆包括的DNA片段大，则总 克隆数目少，常选择能接受较大片段的载体。 令检测是否包括一个完整的基因组序列的公式：
令例:人类基因组3.0x106kb, 以λEMBL作载体， 插入片段的平均长度为17kb ，p为99%时, 基因 库应有8.1x105 个 重组噬菌体。
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n基于EST信息的基因克隆
EST
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由杨树EST库获得基因序列
PCNA
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克隆的核酸酶
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2、基因组水平上的克隆
将ry) ：将某种生物的基因组DNA切割成 一定大小的片段，并与合适的载体重组后导入宿主细胞，进 行克隆。这些存在于所有重组
➢差别杂交筛选
含有表达 目的基因
不含有表 达目的基因cDNA 铺平板转膜 转膜提取分离 mRNA
cDNA 探针
提取分离 mRNA
cDNA 探针
比较 分析
用对照样品cDNA作探 针杂交的X光片中没有 而在检测样品cDNA作 探针杂交的X光片中有 的印斑，可对照X光片 从原平板挑出菌落进行 鉴定是否含有目的基因
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菌落杂交技术寻找目标DNA克隆
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文 库 的 抗 体 筛 选
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(2) T-DNA标签克隆基因
植物基因克隆的方法
阳性克些候选基因，再进行别离，时空表达
特点，同源性比较等分析确定目的基因。
1. 序列克隆 利用目标基因的近等基因系或别离群体分组分析法〔BSA〕进行连锁分析，筛选目标基因所在局部区域的分子标记。
4、目的区域的精细作图 的标记和通过转座子在染色体上
植物基因克隆的方法
基因：为RNA或蛋白质编码的核苷酸序 列。
基因克隆：利用体外重组技术，将特定 基因
体中。
和其它DNA顺序插入到载
克隆目标：识别、别离特异基因并获得 基因
的完整全序列，确定染色
植物基因克隆的方法
能的mRNA序列,据此合成寡核苷酸探针从文
抑制性扣除杂交〔suppression subtractive
人工合成并克隆基因
方法：根据的氨基酸或核苷酸序列，采 用植物偏爱的密码子，人工合成并
克 隆该基因。〔可对基因进行改造〕
例子：根据蜘蛛毒素的氨基酸序列，人பைடு நூலகம் 合
成并克隆了此肽的基因。
表 型 克 隆〔phonetypical cloning〕
方法：利用植物的表型差异或组织器官特 异 表达产生的差异来克隆植物基因。此方法 试图把表型与基因结构或基因表达联系起 来，从而别离特定表型相关基因。不必事 先知道基因的生化功能或图谱定位，根据 基因的表达效应就直接别离该基因。
3、构建目的基因区域跨叠克隆〔contig〕
测所测序列或氨基酸序列与序列是否同 定位克隆的优点和局限性
通过转座子上的标记基因〔如抗药性等〕就可以检测出突变基因的位置和克隆出突变基因来。
源→发 不必事先知道基因的生化功能或图谱定位，根据基因的表达效应就直接别离
方法二: 利用Velculescu等建立的基因 表达
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Probe (oligonucleotides) Primer (degenerated primer)
(b) Oligonucleotide probes or generated primers for genes whose translation products have been characterized
（1）复制为半不连续复制，而PCR两条链的合成都是连续的 （2）复制时引物是由引发酶或引发体合成的，而PCR引物是在
反应前加到反应体系中 （3）复制需要在特定的复制原点起始，并且有终止点，而PCR
在有特异引物存在时在任何序列都可起始，并且没有终止点 （4）复制时两条模板链是在解旋酶的作用下局部打开双链，而
利用一种植物的一段DNA序列作探针，从其它 植物中克隆同源基因
注意：有的基因在不同物种间同源性很高，有的则很低。
2、利用protein信息分离基因 前提是所研究的protein可以从植物中分离纯化
Antibody production Construction of Expression Library
DNA 重组
目的DNA （target fragment）
重组DNA （recombinant DNA ）
转化
宿主（host）
筛选、扩增 克隆（clone）
用何种方法取决于基因产物（Gene products）的 丰度以及gene的相关背景知识，
如 gene or its protein 的表达模式及初级结构等
（一）已知 基因产物 的基因分离 （二）未知 基因产物 的基因分离
（一）已知 Gene products 的基库
● 同源(homologous)DNA探针
为了克隆一个完整基因结构或研究调节序列。
● 异源(Heterologous)DNA探针
（2）两者都需要引物 （3）两者都需要依赖DNA的DNA聚合酶 （4）两者的底物都是dNTP （5）DNA合成时都是在DNA聚合酶作用下按碱基配对
原则往3’-OH上加dNTP，形成3’，5’磷酸二酯键 （6）两者新合成链延伸的方向都是5’to3’ （7）两者DNA合成的保真度（精确性）都较高
PCR和细胞内DNA复制的不同点：
算Tm值比所有真正的退火温度实际会高些或低些。 9）富含GC的模板
建议解决方法： 对于GC含量＞50％的模板，使用PCRx
Enhancer Solution。
问题2：在琼脂糖凝胶分析中观察到非预期条带。 原因： 1）引物和模板非特异性退火
建议解决方法：
以2℃到5℃间隔增加退火温度，减少退火时间。 在开始几个循环使用较高的退火温度，然后使用较低的退 火温度。 使用Platinum Taq DNA进行自动热启动PCR。 2）引物设计较差 避免在引物3‘端含有2到3个dG或dC。
6）PCR引物设计较差
建议解决方法： 避免在引物3‘端含有互补序列。避免可以形
成内部发卡结构的序列。设计Tm类似的引物。 7）镁离子浓度太低
建议解决方法： 从1mM到3mM，间隔0.5mM进行一系列反应
，确定对于每个模板和引物对的最佳镁离子浓度。
8）பைடு நூலகம்火温度太高
建议解决方法： 把退火温度设定为低于Tm 5℃。因为公式估
RT-PCR实验中的常见问题与对策
问题1：在琼脂糖凝胶分析中看到少量或没有RT-PCR产物。 原因： 1）RNA被降解
建议解决方法：利用无污染技术分离RNA； 如果使用RNase抑
制剂，不要加热超过45℃或pH超过8.0。 2）RNA中包含逆转录抑制剂
建议解决方法： 通过乙醇沉淀RNA除去抑制剂。用70％（v/v）
• 一、基因克隆（分子克隆molecular cloning） 通过体外重组技术,将一段目的DNA经切割、
连接插入适当载体，并导入受体细胞，扩增形 成大量子代分子的过程。
• 二、基因克隆的核心---体外重组 (Recombination) 人工将一段目的DNA插入一 个载体的过程。
基因克隆的路线
载体DNA （vector）
建议解决方法： 将RNA和引物在不含盐及缓冲液条件下变
性/退火. 提高逆转录反应温度，对SuperScriptⅡ可以到50℃ ，对ThermoScript可以到65℃。
注意：不要在＞60℃时使用oligo(dT)引物，选择一个在反应 温度可以退火的GSP。对于＞1kb的RT-PCR产物，保持反应 温度≤65℃。 注意：不要在高于37℃时使用M-MLV。 如果不需要全长cDNA，在第一链反应中使用随机引物。
乙醇对RNA沉淀进行清洗。 逆转录抑制剂包括：SDS，EDTA，甘油，焦磷酸钠，甲酰胺
和胍盐。
3）多糖同RNA共沉淀
建议解决方法： 使用氯化锂沉淀RNA以除去多糖。
4）起始RNA量不够
建议解决方法：增加RNA量。 对于＜50ng的RNA样品，可
以在第一链cDNA合成中使用0.1μg到0.5μg乙酰BSA。 5）RNA模板二级结构太多
3）RNA中沾染了基因组DNA 4）镁离子浓度太高
建议解决方法： 优化镁离子浓度。
5）因为扩增复杂模板导致引物错误起始
建议解决方法： 使用巢式PCR或递减PCR。
RACE PCR
PCR和细胞内DNA复制的相同点：
（1）两者都符合半保留复制模型，即两条链都可作为 模板，子代链中一条链来自于亲代链，另一条链 是新合成的
PCR两条模板链通过变性完全打开双链 （5）复制时两条链的合成是同步进行的，而PCR两条链的合成
可能不同步 （6）PCR的DNA聚合酶为耐热的DNA聚合酶，而复制的聚合
Trp-Asp-Glu-Asn-Asn-Met 1 2 22 2 1
(16 species)
p176
Ser-Glu-Try-Leu-Thr-Asn 6 2 26 42
(1152 species)
RT-PCR and RACE PCR
Reverse Transcription,
Rapid Amplification of cDNA Ends