第八章 植物基因的克隆原理与技术
植物基因定位与克隆技术
植物基因定位与克隆技术生命的基因组是由数以亿计的基因所组成，而每一个基因都拥有着许多重要的生物学功能。
在植物研究领域，基因定位与克隆技术被广泛应用于植物基因的分离、克隆和功能研究中，为科学家们提供了更深入的了解植物多样性和生命过程的机会。
植物基因定位技术是通过分析遗传连锁相连的遗传标记与感兴趣的基因间的关系来确定基因位置的一种方法。
这些遗传标记可以是单核苷酸多态性（SNP）、限制性片段长度多态性（RFLP）或微卫星标记（SSR）等。
定位分析过程需要建立一个遗传连锁图谱，并将基因的位置分配到该图谱中。
随着遗传标记和图谱的不断发展，越来越多的植物基因得以定位，这使得研究人员可以轻松地实现植物基因的图谱定位和深入研究。
植物克隆技术是一种通过DNA插入和选择筛选，使不含目标DNA片段的细菌自杀，从而获得含有目标基因DNA的单个细菌克隆的技术。
该技术的基本步骤包括DNA片段的制备、载体选择、DNA插入、转化和筛选。
利用克隆技术，科学家可以克隆任何感兴趣的植物基因，并进行进一步研究。
利用克隆技术，科学家们已经成功地枚举出了许多重要的植物基因。
植物基因定位和克隆技术的应用在植物育种和基因工程方面有着重要的地位。
研究植物基因定位可以提供植物多样性和特性的基本知识，帮助育种者选择最佳配对植物，促进多样性和适应性的提高。
另外，克隆技术提供了一个强有力的技术平台，使得研究者可以研究和使用各种巨大优势植物（比如转基因植物）来进行研究和创造。
植物基因定位和克隆技术在植物科学研究和开发中扮演着重要角色。
促进这些技术的进一步发展，将有助于进一步加强植物多样性、新型植物品种的开发和农业的发展。
我相信，我们只有更深入、更全面地了解植物基因定位与克隆技术的原理和应用，才能更好地掌握和运用这些技术。
植物生物技术-植物基因的克隆原理和技术
RPKM 不仅对测序深度作了归一化，而且对基因长度也作了归
一 化，使得不同长度的基因在不同测序深度下得到的基因表
达水 平估计值具有了可比性，是目前最常高通量测序在组学中的应用
RNA-Seq DGE
Small RNA 测序
基因组测序
Lister et al. 2009
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6
2. 三种高通量测序技术及其优
缺 点 平台和机型
Illumina/Solexa Roche/454 GS FLX ABI/SOLiD GA IIx
测序原理
边合成边测序
平均读长（ bp ） 数据量 (Gb/run) 准确率 主要错误类型 运行时间 优点 缺点
100 54-60 >=98 替换 4d 性价比最高 读长短
RPKM （ reads per kilobase per million reads ）是每百 万读段中来自于某基因每千碱基长度的读段数。其公式为 :
total exon reads 指映射到某个基因上的 reads 数， mapped reads 指 map 到所有基因的总的 reads 数。
新基因预测
有参考序列
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Outline
Omics High-throughput Sequencing RNA-Seq The strategies and application of DGE The strategies and application of Small RNA-seq
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电子表达谱测序（ Digital Gene Expression, DGE ）又称为基因表达标签测序（ mRNA tag profiling ），其原理是通过两种酶切作用对基 因中一段长度为 21nt 的序列标签进行测序。由 于其测序只针对表达的基因进行测序，产生的 数据量相对较小，是研究基因表达谱的经济而 快速的研究手段。 又称 Tag-SAGE DGE I DGE II
植物遗传工程中的基因克隆与转化技术
植物遗传工程中的基因克隆与转化技术植物遗传工程是指通过改变植物的遗传物质，以达到改良、改变或创新植物性状的目的。
其中基因克隆与转化技术是植物遗传工程中的关键技术之一。
基因克隆指的是通过将特定基因从一个生物体中分离并扩增形成DNA片段，使其能够在其他生物体中稳定表达。
转化技术则是将克隆的基因导入到目标植物体内，使其能够在植物表达并产生相应的功能。
一、基因克隆技术基因克隆技术是植物遗传工程中的关键环节。
首先需要从源生物体中分离出目标基因。
常用的方法有PCR扩增、限制酶切片段分离等。
通过PCR扩增技术，可以快速、高效地扩增目标基因，提供足够的DNA片段用于后续的克隆工作。
限制酶切片段分离则是利用特定的酶将目标基因从源DNA片段中切割出来。
接下来，克隆基因需要被插入到适当的载体中，常用的载体包括质粒和病毒等。
将基因插入载体后，需要通过转化技术将其导入目标植物体内。
二、转化技术转化技术是将克隆的基因导入到目标植物体内的关键步骤。
常见的转化技术主要有基因枪法、农杆菌介导法和化学法等。
基因枪法是通过将DNA微粒射入植物细胞，使基因得以导入的方法。
此方法简单、高效，对不同植物都适用，因此被广泛应用于植物遗传工程中。
农杆菌介导法则是利用农杆菌将目标基因导入植物细胞。
这种方法克服了基因枪法的一些限制，可以导入更长的DNA片段，但受适用植物种类的限制。
此外，化学法也是一种常用的转化技术，通过利用化学物质使植物细胞的细胞壁通透性增强，从而实现目标基因的导入。
三、应用前景与挑战基因克隆与转化技术在植物遗传工程中具有广阔的应用前景。
通过基因克隆和转化技术，可以实现对植物农艺性状的改良，提高植物的抗病虫害能力、耐逆性和产量，从而促进农业的可持续发展。
此外，利用基因克隆和转化技术还可以为植物生物制药、环境修复等领域提供解决方案。
然而，基因克隆与转化技术在应用过程中也面临一些挑战。
首先，对于目标基因的选择和定位仍然是一个复杂的问题。
植物生物技术-植物基因克隆的原理与技术
2. 连接方式：
相同粘性末端的连 接平头末端的连接
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ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
粘末端连接 法
若 DNA 插入片段与适当的载体存在同源粘性末端
相同内切酶产Th的粘末端连接得到的重组质粒能够保留 接合处的限制酶切位点，因此可以使用原来酶将插入 片 段从重组体上完整地重新切割下来。
不同酶产Th的粘性末端连接得到的重组质粒不能够保留 接合处的限制酶切位点，因此不可以使用原来酶将插 入 片段从重组体上完整地重新切割下来。
3` - C T T AA
G - 5`
重新连接后的序列：
5` - C A A T T C - 3` 3` - G T T A A G - 5`
同裂（工）酶（ isoschizomers)
指来源不同，但识别相同靶序列的核酸内切酶
同裂酶进行同样的切割，产Th同样的末
端 但有些同裂酶对甲基化位点的敏感性
不同
限靶时而
制 序酶 列中H一pa个Ⅱ5和- 甲M基sp胞Ⅰ嘧是啶一对同Hp裂aⅡ酶不(能CC进G行G)切，割当， MspⅠ 可
以
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3.III 型限制性内切 酶
也有专一的识别序列，但不是对称的回文序列 , 在识 别 序列旁边几个核苷酸对的固定位置上切割双链 这几个核苷酸对不是特异性的 切割后产Th的一定长度 DNA 片段，具有各种单链末 端 切割的不确定性，不能应用于基因克隆
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（ 2 ）常用 II 型限制性内切酶种类及特 性
Movie 1
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（ 3 ）切点出现的频率及片段大小
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（ 4 ）限制性内切酶的剪切方 式
➢ 平头末端 (blunt ends) ： 在同一位置上切割双 链 ，产Th平头末端
植物基因工程原理与技术
植物基因工程是指利用分子生物学和遗传学技术，通过对植物基因组的改变，实现对植物性状、生长发育、抗病性等特性的调控和改善。
以下是植物基因工程的原理和技术：
基因克隆：通过PCR扩增、基因文库筛选等技术，获得目标基因的DNA序列。
基因编辑：利用基因编辑工具，如CRISPR-Cas9技术，精确地对植物基因组进行切割和修复，实现基因组精准编辑。
基因表达：将目标基因克隆到植物表达载体中，通过基因转化技术将表达载体导入植物细胞中，实现目标基因在植物中的表达。
基因敲除：利用RNA干扰技术，针对目标基因设计合成RNA片段，通过RNA干扰作用，降低或抑制目标基因的表达。
转基因植物筛选和鉴定：通过PCR、Southern blotting、Northern blotting等技术，对转基因植物进行筛选和鉴定，确认目标基因在植物中的表达情况和遗传稳定性。
细胞培养：通过细胞培养技术，将植物组织或细胞培养在无菌条件下，控制营养和生理环境，实现外源基因转化和植物再生。
载体选择：选择合适的植物表达载体，如农杆菌介导的基因转移系统，利用载体将目标基因导入植物细胞，实现转基因植物的制备。
通过上述技术，可以实现植物基因组的改变和重构，从而达到改善植物性状、增强植物抗性、提高植物产量等目的。
植物基因克隆的策略及方法
植物基因克隆的策略及方法首先，PCR是植物基因克隆的重要策略之一、PCR（聚合酶链反应）是一种体外复制DNA片段的方法，可以在短时间内扩增大量的特定DNA序列。
通过PCR可以快速准确地克隆植物基因。
PCR的基本原理是利用DNA 聚合酶酶学合成原理，在DNA片段两侧设计引物，将其与DNA片段的两侧结合，在适当的条件下进行DNA的聚合酶链反应，从而扩增目标基因。
PCR方法主要包括加热解性、引物连接、扩增和酶切等步骤。
其次，限制性酶切也是植物基因克隆的重要方法。
限制性酶切是指利用特定的限制性酶将DNA分子切割成特定序列的片段。
通过限制性酶切，可以将目标基因从植物DNA中剪切出来，然后进行进一步处理。
限制性酶切的基本原理是将特定的限制性酶加入反应体系中，该酶能识别和切割DNA的特定序列，从而将目标基因从DNA中剪切出来。
限制性酶切方法主要包括选择合适的限制性酶、反应条件的优化、酶切产物的回收和检测等步骤。
连接是植物基因克隆的另一种重要方法。
连接是指将目标基因连接到特定的载体DNA上，以便在目标植物中稳定地表达。
连接方法主要包括两个步骤：首先，需要处理载体DNA和目标基因的末端，以便它们能够相互连接；其次，利用DNA连接酶将载体和目标基因连接起来。
连接步骤中的处理涉及到DNA末端的修饰和处理，可以通过多种方法如限制性内切酶切割、引物扩增、酶切等进行。
最后，转化是植物基因克隆的最后一步。
转化是指将连接好的目标基因插入到目标植物的基因组中，使其能够在植物体内稳定表达。
转化的方法有多种，包括农杆菌介导的转化、基因枪转化、电穿孔转化等。
其中，农杆菌介导的转化是最常用的方法之一、农杆菌介导的转化是利用农杆菌作为载体将外源DNA导入到目标植物细胞中，通过农杆菌的自然寄生习性以及在植物细胞中特定的植物基因的活性表达，实现目标基因的稳定表达。
总的来说，植物基因克隆的策略和方法包括PCR、限制性酶切、连接和转化。
通过这些方法，可以快速准确地克隆植物基因，实现对植物遗传特性的改变和优化，为农业生产和植物遗传研究提供有力的技术支持。
植物生物技术中的基因克隆与基因工程技术
植物生物技术中的基因克隆与基因工程技术植物生物技术的快速发展为人们改良和改造植物基因提供了广阔的空间。
基因克隆和基因工程技术成为植物生物技术中的两个重要方面。
本文将以“植物生物技术中的基因克隆与基因工程技术”为题，探讨这两个方面的内容。
一、基因克隆基因克隆是指通过复制和扩增DNA序列，从而制备大量相同DNA分子的过程。
基因克隆是植物生物技术中最早也是最常用的技术之一。
1. PCR技术PCR技术（聚合酶链反应）是一种能够扩增DNA片段的方法，它可以制备大量具有相同DNA序列的片段。
在基因克隆中，PCR技术被广泛应用于检测和扩增目标基因，为基因工程技术的开展提供了基础。
2. 限制性内切酶限制性内切酶是一类能够识别特定DNA序列并对其进行切割的酶。
基因克隆中，通过选择性地使用限制性内切酶来切割DNA，将目标基因从其它无关基因中分离出来，实现基因的纯化与提取。
3. DNA连接DNA连接是将经过切割的DNA分子重新连接起来的过程。
连接后的DNA可以通过转化等方法引导其进入植物细胞，实现外源基因的导入。
二、基因工程技术基因工程技术是通过直接改变植物基因组中的DNA序列，对植物基因进行修改和调控的技术。
它在改良植物性状、提高植物品质等方面具有广泛应用价值。
1. 基因转化基因转化是指将外源基因导入植物细胞并使其稳定表达的过程。
通过选择合适的基因载体和转化方法，将目标基因导入植物细胞的染色体中，实现基因的稳定遗传。
2. 基因编辑基因编辑是指直接对植物基因组中特定基因进行修改和编辑的技术。
通过CRISPR/Cas9等工具，可以对植物基因组中的目标位点进行特定的编辑，实现基因的精确调控。
3. 基因沉默基因沉默是通过RNA干扰等方法，对特定基因的转录或翻译进行抑制的过程。
通过基因沉默技术，可以实现对植物性状的精确调控，提高植物产量和抗病能力等。
三、植物生物技术的应用前景基因克隆和基因工程技术在植物生物技术中的应用前景巨大。
植物基因的克隆｜植物基因克隆的基本步骤
植物基因的克隆｜植物基因克隆的基本步骤植物基因的克隆08医用二班姚桂鹏0807508245简介克隆（clone）是指一个细胞或一个生物个体无性繁殖所产生的后代群体。
通常所说的基因克隆是指基于大肠埃希菌的DNA片段（或基因）的扩增，主要过程包括目标DNA的获取、重组载体的构建、受体细胞的转化以及重组细胞的筛选和繁殖等。
本文主要介绍植物基因的特点、基因克隆的载体、基因克隆的工具酶、基因克隆的策略以及植物目的基因的分离克隆方法等内容。
关键词植物基因基因克隆载体工具酶克隆策略分离克隆方法Plant gene cloningIntroductionCloning (clone) refers to a cell or an individual organisms asexual reproduction produced offspring. Usually said cloning genes meansbased on escherichia coli segment of DNA (or genes), including the main course target DNA, restructuring of the carrier, transformation of receptor cells and reorganization of screening and reproductive cells. This paper mainly introduces the characteristics of plant gene and gene cloning and carrier, gene clone tool enzyme, gene cloning and plant gene strategy of separation cloning method, etc. KeywordsPlant gene cloning tool enzyme gene cloning vector method of separation of cloning strategy一、植物基因的结构和功能基因（gene）是核酸分子中包含了遗传信息的遗传单位。
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• 内容 • 一．基因克隆所需要的酶和载体 • 二．植物转化载体的构建 • 三．基因克隆的方法
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基因克隆所需要的酶和载体
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一般认为 基因工程诞生于1973年 上世纪40年代——70年代初
分子生物学领域 理论上的三大发现和技术上的三大发明 对于基因工程的诞生起到了决定性的作用。
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Xma I Sma I
5’-C CCGGG -3’ 3’-GGGCC C-5’ 5’-CCC GGG-3’ 3’-GGG CCC-5’
同尾酶(isocaudamers):识别的靶序列不同，但能产生相同 粘性末端的一类限制性核酸内切酶。
注 意：由同尾酶产生的粘性末端序列很容易重新连接， 但是两种同尾酶消化产生的粘性末端重新连接形成的新片段 将不能被该两种酶的任一种所识别。
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同裂酶 (isoschizomers )：能识别和切割同样的核苷酸靶序 列的不同内切酶。
完全同裂酶 识别位点和切点完全相同
如Hind Ⅲ和Hsu I
不完全同裂酶 识别位点相同但切点不同
如Xma Байду номын сангаас 和 Sma I
Hind Ⅲ 5’-A AGCTT-3’ 3’-TTCGA A-5’
Hsu I 5’-A AGCTT-3’ 3’-TTCGA A-5’
4、以罗马数字表示分离出来的先后顺序 如Eco R I、 Hin d III
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限制性核酸内切酶的分类
限制性内切核酸酶类型： 目前鉴定出三种不同类型的限制性内切酶。
I 型限制性内切酶 II 类限制性内切酶 III类限制性内切酶
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不同类型核酸内切酶主要特性的比较分析
I型
II 型
III 型
限制-修饰活性
单一多功能的 酶
限制酶和修饰酶 分开
内切酶的蛋 白质结构 3种不同亚基
单一成分
活性辅助因子
甲基化位点 特异性切割 基因克隆中的
用途
ATP、Mg2+、 SAM
Mg2+
寄主特异性的位点
否
是
用途有限
十分广泛
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双功能酶
2种不同亚基 ATP、Mg2+、
SAM
否 用途有限
II型限制性核酸内切酶的3大特点
识别位点的特异性 识别序列的对称性 切割位点的规范性
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1-- DNA是遗传物质被证实
1944年，Avery O.T.肺炎双球菌转化实验
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2-- DNA双螺旋模型的提出
Watson 和Crick
1953年，James Watson 和Francis Crick提出 了DNA的双螺旋模型。 .
3– “中心法则”的提出
以Nireberg等为代表的一批科学家 确定了遗传信息以密码方式传递， 每三个核苷酸组成一个密码子，代 表一个氨基酸，到1966年，全部破 译了64个密码子，并提出了遗传信 息传递的“中心法则”。
这一年被定为基因工程诞生的元年。
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植物基因工程的基本流程
提取 目的DNA 酶切 DNA片段 载体
导入到细菌中
重组菌的筛选
序列分析和基因表达等研究
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基因克隆所需要的酶类
• 限制性内切核酸酶 • DNA连接酶 • DNA聚合酶 • DNA修饰酶 • 核酸外切酶 • 单链DNA内切酶
“
”
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限制性核酸内切酶
接活性。
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2– 反转录酶的发现和应用
1970年，Baltimore等和Temin等各自发现了反转录酶，完善 了中心法则，使单个真核基因的制备成为了可能。
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3– 载体的发现和应用
1972年，美国Stanford大学的P.Berg等首次成功地实 现了DNA的体外重组。
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3– 载体的发现和应用
1973年，Stanford大学的Cohen等成功地利用体外重组实 现了细菌间性状的转移。
类能够识别双链DNA分子中某种特定的核苷酸序列，并能精 确特异地切割双链DNA分子的核酸内切酶。已经从近300种 微生物中分离出了2300种，其中商品化的限制性核酸内切酶 500余种。
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限制性核酸内切酶的命名
1、寄主菌属名的第一个字母和种名的头两个字母组成3个斜 体字母的略语表示酶来源的菌种名称。
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与II型核酸内切酶有关的几个概念
粘性末端 ( cohesive ends )：因酶切位点在两条DNA单链上不同 （对称）酶切后形成的具有互补碱基的单链末端结构，酶切产 生的两个粘性末端很容易通过互补碱基的配对而重新连接起来。
5’端凸出（如EcoR I）
3’端凸出（如Pst I）
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平 末 端 (Blunt end)：因酶切位点在两条DNA单链上相同， 酶切后形成的平齐的末端结构，这种末端不易重新连接起 来。
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1– 工具酶的发现和应用
Werner Arber 1968年发现限制酶
Smith等分离并纯化了限制性核酸内切酶Hind II，
1972年，Boyer等相继发现了ＥcoR I 一类重要的限制性内
切酶。 .
1– 工具酶的发现和应用
1967年，世界上五个实验室几乎同时发现DNA连接酶，
特别是1970年Khorana等发现的T4 DNA连接酶具有更高的连
1、限制性核酸内切酶的发现 2、限制性核酸内切酶的命名和分类 3、II型限制性核酸内切酶的基本特性 4、限制性核酸内切酶的消化反应
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限制性内切核酸酶的发现 50年代发现了大肠杆菌具有对付噬菌体和外来DNA的限制 系统； 60年代后期证明了细菌的限制和修饰系统； 1968年，Meselson 和Yuan从大肠杆菌K和B中发现了I型限制 性核酸内切酶； 1970年，Smith和Wilcox从流感嗜血杆菌中分离纯化了第一 个II型限制性核酸内切酶Hind II，使得DNA分子的体外精确 切割成为可能。
如：大肠杆菌Escherichia coli 表示为Eco ；
属名
种名
流感嗜血菌Haemophilus influenzae 表示为Hin；
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2、修饰性酶用M表示，限制性酶用R表示 如 R. Hin M. Eco
3、用一个正体字母表示菌株的类型 如Escherichia coli RY13 Eco R
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限制（Restriction） 限制性内切酶将侵入细菌体内 的外源DNA切成小片断。
修饰（Modification）
细菌自身的DNA碱基被甲基化 酶甲基化修饰所保护，不能被 自身的限制性内切酶识别切割。
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限制性核酸限内制切性酶（核R酸es内tric切tio酶n e的ndo概nu念cleases）：是一