基因克隆的几种常见方法
克隆基因的方法
克隆基因的方法随着生物技术的不断发展，克隆基因的方法已经成为分子生物学和基因工程领域中不可或缺的工具。
克隆基因的方法可以用来研究基因的结构、功能和调控机制，也可以用来制备重组蛋白、疫苗和基因治疗药物等。
本文将介绍克隆基因的方法，并探讨其在生物学和医学领域中的应用。
一、克隆基因的方法克隆基因的方法包括以下步骤：1. DNA提取：从目标生物体中提取DNA，可以使用化学方法或商业化的DNA提取试剂盒。
2. PCR扩增：使用聚合酶链式反应（PCR）扩增目标基因序列。
PCR是一种体外DNA合成技术，可以在短时间内扩增目标序列，具有高灵敏度和高特异性。
3. 限制性内切酶切割：使用限制性内切酶切割PCR产物，得到两端具有粘性末端的DNA片段。
限制性内切酶是一种特异性的DNA酶，可以切割DNA的特定序列，从而产生具有特定末端的DNA片段。
4. 连接：将两端具有粘性末端的DNA片段连接起来，形成重组DNA分子。
连接可以使用DNA连接酶或T4DNA连接酶等酶催化的反应。
5. 转化：将重组DNA分子导入到宿主细胞中，使其在宿主细胞中复制和表达。
转化可以使用化学方法或电穿孔法等。
6. 筛选：筛选带有目标基因的克隆。
筛选可以使用选择性培养基、荧光标记、PCR等方法。
二、克隆基因的应用1. 基因研究克隆基因的方法可以用来研究基因的结构、功能和调控机制。
例如，可以克隆和表达目标基因蛋白，研究其生物学功能和相互作用关系。
还可以使用基因敲除和转基因技术，研究基因在生物体发育、代谢和疾病等方面的作用。
2. 蛋白制备克隆基因的方法可以用来制备重组蛋白。
例如，可以克隆并表达具有生物活性的蛋白，如生长因子、激素、抗体等。
重组蛋白可以用于药物研发、生物制剂生产和科学研究等方面。
3. 疫苗研究克隆基因的方法可以用来研制和生产疫苗。
例如，可以克隆和表达病原体的抗原蛋白，制备亚单位疫苗或基因工程疫苗。
基因工程疫苗具有高效、安全、经济等优点，已经成为疫苗研究和生产的重要手段。
基因克隆的技巧
基因克隆的技巧
基因克隆是生物学研究中常用的技术之一，它可以将感兴趣的基因从一个生物体中复制到另一个生物体中。
以下是基因克隆的一些常见技巧：
1. DNA提取：从源生物体中提取目标基因的DNA。
常见的方法包括溶解细胞膜、蛋白质降解和碱解。
2. 剪切和黏贴：利用限制酶（也称为内切酶）剪切目标DNA，并在相应的酶切位点上黏合连接，形成重组DNA。
3. DNA扩增：通过聚合酶链式反应（PCR）或其他扩增方法，复制目标DNA 片段，以获得足够数量的DNA进行后续实验。
4. 重组载体构建：将目标DNA插入载体DNA，形成重组载体。
载体可以是质粒、噬菌体或其他类型的DNA。
常见的方法包括限制酶消化和连接、启动子和终止子的选择，以及DNA酶切和黏接。
5. 转化：将重组载体导入宿主细胞。
常见的方法包括化学法、电穿孔法和基因枪法。
6. 筛选：使用适当的筛选标记（例如抗生素抗性基因）鉴定并筛选成功转化的细胞。
7. 分离和培养：分离并培养选出的转化细胞，以获得包含目标基因的克隆。
这些技巧在基因克隆中被广泛使用，但具体的操作和条件可能会因实验需求和研究对象而有所不同。
基因的克隆方法大全
1.2.3 差异显示PCR〔DD RT-PCR〕
最先由Liang等于1992年报道,目前已广 泛在实验室使用.
主要LY〔A〕结构,在其3`端设计象5`-
T11GA样引物,该引物可与mRNA总数的
十二分之一结合,从而使这部分基因得到
逆转录,同时结合5`端的随机引物〔20条
染色体 T-DNA
染色体 目的基因野生株构建基因组 基因苗构建基因组文 库基因苗
阳性克隆
获得阳性克隆 目的基因
基因序列分析2，4 确定为基因
转座子标签法
转座子又称转座因子或者跳跃因 子,实际上也是DNA片段,它可以在生 物的染色体组中移动,从染色体的一个 位点跳到另一个位点,或从一条染色体 跳到另一条染色体上,引起基因功能的 改变.
8
已发展的相应基因克隆方法：
差减杂交〔SH〕 抑制性差减杂交〔SSH〕 差异显示PCR〔DD RT-PCR〕 DNA代表性差异分析〔DNA RDA〕 扩增限制性片段长度多样性〔AFLP〕 cDNA微阵列
9
差减杂交〔SH〕
最早由Lamar和Palmer于1984年提 出并用于雄鼠Y染色体的DNA研究.
10-mer〕,可m以RN使A不同长度的基因得到扩
增5. `
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A T C G
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A C
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15
mRNA
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41
基因克隆与表达
基因克隆与表达基因克隆与表达是生物学领域中重要的技术手段和研究方法。
通过基因克隆和表达，科学家能够研究特定基因的功能、调控机制以及其在生物体内的作用，这对于深入了解生物体的生理过程和疾病发生机制具有重要意义。
本文将介绍基因克隆与表达的原理、方法以及应用。
一、基因克隆基因克隆是将特定基因从一个生物体中分离并复制到另一个载体中的过程。
这个过程主要涉及DNA的分离、复制和连接。
常用的基因克隆技术包括PCR、限制性内切酶切割、琼脂糖凝胶电泳和基因插入等。
1. PCR聚合酶链反应（PCR）是一种强大的基因扩增技术。
它通过不断地重复某一特定区域的DNA序列，使其得以大规模复制。
PCR可以在短时间内合成大量目标DNA片段，为基因克隆提供了充足的材料。
2. 限制性内切酶切割限制性内切酶可以识别并切割特定的DNA序列。
通过选择合适的限制性内切酶，可以实现将目标基因从源DNA中切割下来，为下一步的基因克隆做好准备。
3. 琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳是一种常用的DNA分离技术。
通过将DNA样品加入琼脂糖凝胶槽中，并施加电场，DNA片段会根据其大小在凝胶中迁移。
凝胶电泳可以帮助科学家分离和纯化目标基因。
4. 基因插入基因插入是将目标基因连接到载体上的过程。
载体可以是质粒、病毒或者人工染色体等。
通过连接酶的作用，目标基因与载体可以稳定地结合在一起。
二、基因表达基因表达指特定基因通过转录和翻译过程转化为蛋白质的过程。
从基因克隆到基因表达，可以分为以下几个步骤：转染或转化、筛选和检测。
1. 转染或转化转染是指将外源DNA导入到动物细胞中的过程，而转化是将外源DNA导入到细菌细胞中的过程。
转染和转化可以通过多种方法实现，如化学法、电穿孔法和基因枪法等。
2. 筛选筛选是为了确定是否成功将目标基因表达在宿主细胞中而进行的步骤。
常见的筛选方法包括荧光筛选和克隆筛选。
荧光筛选利用荧光蛋白标记目标基因，观察细胞是否出现荧光信号。
克隆筛选则利用选择性培养基，筛选出含有目标基因的克隆。
基因克隆的几种常见方法
基因克隆的几种常见方法基因(gene）是遗传物质的最基本单位,也是所有生命活动的基础.不论要揭示某个基因的功能，还是要改变某个基因的功能,都必须首先将所要研究的基因克隆出来。
特定基因的克隆是整个基因工程或分子生物学的起点。
本文就基因克隆的几种常用方法介绍如下。
1 根据已知序列克隆基因对已知序列的基因克隆是基因克隆方法中最为简便的一种。
获取基因序列多从文献中查取,即将别人报道的基因序列直接作为自己克隆的依据.现在国际上公开发行的杂志一般都不登载整个基因序列，而要求作者在投稿之前将文章中所涉及的基因序列在基因库中注册,拟发表的文章中仅提供该基因在基因库中的注册号(accession number)，以便别人参考和查询。
目前,世界上主要的基因库有1)EMBL,为设在欧洲分子生物学实验室的基因库,其网上地址为http：//www.ebi。
/ebi—home。
html;（2）Genbank，为设在美国国家卫生研究院（NIH）的基因库,其网上地址为http：//www。
/web/search/index。
html;（3)Swissport和TREMBL,Swissport是一蛋白质序列库,其所含序列的准确度比较高,而TREMBL只含有从EMBL库中翻译过来的序列。
目前，以Genbank的应用最频繁。
这些基因库是相互联系的，在Genbank注册的基因序列,也可能在Swissport注册。
要克隆某个基因可首先通过Internet查询一下该基因或相关基因是否已经在基因库中注存。
查询所有基因文库都是免费的,因而极易将所感兴趣的基因从库中拿出来,根据整个基因序列设计特异的引物,通过PCR从基因组中克隆该基因,也可以通过RT—PCR克隆cDNA。
值得注意的是，由于物种和分离株之间的差异，为了保证PCR扩增的准确性，有必要采用两步扩增法，即nested PCR。
根据蛋白质序列也可以将编码该蛋白质的基因扩增出来。
在基因文库中注册的蛋白质序列都可以找到相应的DNA或cDNA序列。
植物基因克隆的策略及方法
植物基因克隆的策略及方法首先，PCR是植物基因克隆的重要策略之一、PCR（聚合酶链反应）是一种体外复制DNA片段的方法，可以在短时间内扩增大量的特定DNA序列。
通过PCR可以快速准确地克隆植物基因。
PCR的基本原理是利用DNA 聚合酶酶学合成原理，在DNA片段两侧设计引物，将其与DNA片段的两侧结合，在适当的条件下进行DNA的聚合酶链反应，从而扩增目标基因。
PCR方法主要包括加热解性、引物连接、扩增和酶切等步骤。
其次，限制性酶切也是植物基因克隆的重要方法。
限制性酶切是指利用特定的限制性酶将DNA分子切割成特定序列的片段。
通过限制性酶切，可以将目标基因从植物DNA中剪切出来，然后进行进一步处理。
限制性酶切的基本原理是将特定的限制性酶加入反应体系中，该酶能识别和切割DNA的特定序列，从而将目标基因从DNA中剪切出来。
限制性酶切方法主要包括选择合适的限制性酶、反应条件的优化、酶切产物的回收和检测等步骤。
连接是植物基因克隆的另一种重要方法。
连接是指将目标基因连接到特定的载体DNA上，以便在目标植物中稳定地表达。
连接方法主要包括两个步骤：首先，需要处理载体DNA和目标基因的末端，以便它们能够相互连接；其次，利用DNA连接酶将载体和目标基因连接起来。
连接步骤中的处理涉及到DNA末端的修饰和处理，可以通过多种方法如限制性内切酶切割、引物扩增、酶切等进行。
最后，转化是植物基因克隆的最后一步。
转化是指将连接好的目标基因插入到目标植物的基因组中，使其能够在植物体内稳定表达。
转化的方法有多种，包括农杆菌介导的转化、基因枪转化、电穿孔转化等。
其中，农杆菌介导的转化是最常用的方法之一、农杆菌介导的转化是利用农杆菌作为载体将外源DNA导入到目标植物细胞中，通过农杆菌的自然寄生习性以及在植物细胞中特定的植物基因的活性表达，实现目标基因的稳定表达。
总的来说，植物基因克隆的策略和方法包括PCR、限制性酶切、连接和转化。
通过这些方法，可以快速准确地克隆植物基因，实现对植物遗传特性的改变和优化，为农业生产和植物遗传研究提供有力的技术支持。
基因克隆的方法及应用原理
基因克隆的方法及应用原理1. 引言基因克隆是分子生物学中非常重要的技术，它能够帮助科学家们研究基因的结构和功能，并且在生物工程、医学和农业等领域有着广泛的应用。
本文将介绍基因克隆的方法和应用原理。
2. 基因克隆的方法2.1 PCR法PCR（聚合酶链反应）是一种常用的基因克隆方法。
它通过使用DNA聚合酶将DNA模板复制成多个复制体，从而扩增目标基因片段。
PCR法的步骤如下： - 选取DNA模板，设计引物（即PCR反应需要的特异性序列），确定目标片段。
- 混合DNA模板、引物、dNTPs（四种核苷酸）、缓冲液和聚合酶，在PCR机中进行循环扩增。
- 设定PCR循环参数，包括退火温度、延伸时间等。
- 重复循环扩增过程，生成大量目标DNA片段。
2.2 限制性内切酶法限制性内切酶法利用限制酶切割酶将DNA切割成特定的片段，然后将目标片段与载体DNA连接，形成重组DNA。
限制性内切酶法的步骤如下： - 选择合适的限制酶，将DNA切割成特定的片段。
- 利用DNA连接酶将目标片段与载体DNA连接，形成重组DNA。
- 将重组DNA转化到宿主细胞中，宿主细胞就会复制这个重组DNA，从而得到克隆基因。
2.3 转座子法转座子法是一种常用的基因克隆方法。
它利用转座子（一段能够在基因组中移动的DNA序列）在细胞中构建重组DNA，并将其转移到宿主细胞中。
转座子法的步骤如下： - 设计转座子序列，含有目标基因。
- 在体外构建重组转座子。
- 将重组转座子转移到宿主细胞中。
- 宿主细胞复制重组转座子，从而得到克隆基因。
3. 基因克隆的应用原理基因克隆在许多领域有着广泛的应用，以下列举几个典型的应用原理。
3.1 基因表达和功能研究基因克隆可以用于基因表达和功能研究。
通过克隆目标基因到适当的表达载体中，可以在宿主细胞中高效表达目标基因，并研究其功能。
3.2 基因治疗基因克隆技术在基因治疗中起着重要作用。
通过克隆相关基因，并将其导入患者的细胞中，可以矫正患者身体中的遗传缺陷或异常，并达到治疗作用。
基因克隆常用的方法
3.2 Differential display PCR(DD-PCR) PCR(DDDD-PCR是在AP-PCR基础上发明的一种RTDD-PCR是在AP-PCR基础上发明的一种RTPCR方法,主要用于2 PCR方法,主要用于2种或多种类似生物个体在基因 表达上的差异分析。其基本原理是: 表达上的差异分析。其基本原理是:所有真核生物 的成熟mRNA都含有不同长度的poly+(A)尾部序列, 的成熟mRNA都含有不同长度的poly+(A)尾部序列, 根据poly+(A)内部的2个核苷酸排列的不同, 根据poly+(A)内部的2个核苷酸排列的不同,可以将 所有的mRNA分子分为12类 见图3)。 所有的mRNA分子分为12类(见图3)。
PCR反应模式图： 反应模式图： 反应模式图
Nested PCR反应模式图 反应模式图
根据蛋白质序列也可或cDNA 序列。如蛋白质序列是自己测定的,那么需要设计至少1 序列。如蛋白质序列是自己测定的,那么需要设计至少1对简并引 物(degen做序列测定才能鉴别所扩增产物的特异性。
另外,在基因克隆之后,如还要进一步做表达研究, 另外,在基因克隆之后,如还要进一步做表达研究,所使用的 PCR酶最好不用Taq DNA聚合酶,而采用其他有自我检测(reading PCR酶最好不用Taq DNA聚合酶,而采用其他有自我检测(reading proof)功能的酶, pfu。这样可以避免由于扩增过程中出现的点 proof)功能的酶,如pfu。这样可以避免由于扩增过程中出现的点 突变或终止密码子而导致整个研究结论的错误。
图３真核生物12种mRNA的序列特点
根据这12种mRNA序列可合成12种相应的反转录引物，即 根据这12种mRNA序列可合成12种相应的反转录引物，即 M’N’TTTTTTTT……,用其分别进行反转录,即可将所有mRNA分类合成 M’N’TTTTTTTT……,用其分别进行反转录,即可将所有mRNA分类合成 12种cDNA(于12个试管内)，然后再用随机引物,以这12种cDNA分别做 12种cDNA(于12个试管内)，然后再用随机引物,以这12种cDNA分别做 模板进行PCR扩增(见图1和图4)，那么与表型相关的mRNA就很容易被 模板进行PCR扩增(见图1和图4)，那么与表型相关的mRNA就很容易被 发现并克隆出来。但不论AP-PCR还是DD-PCR,都适用于2 发现并克隆出来。但不论AP-PCR还是DD-PCR,都适用于2种种源近似生 物或不同发育阶段的同一个体之间的比较。因而, PCR的模板必须是 物或不同发育阶段的同一个体之间的比较。因而,其PCR的模板必须是 来自2个生物或同一生物的不同发育阶段的mRNA。DD-PCR的优点是快 来自2个生物或同一生物的不同发育阶段的mRNA。DD-PCR的优点是快 速、方便,可以检测表达量极低的mRNA，但其技术条件要求较高，所 速、方便,可以检测表达量极低的mRNA，但其技术条件要求较高，所 扩增的mRNA的质量不能有差异, mRNA不应降解。目前这一方法已广 扩增的mRNA的质量不能有差异,即mRNA不应降解。目前这一方法已广 泛应用于生物表型相关基因的克隆及比较研究。
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基因克隆得几种常见方法基因（gｅｎe)就是遗传物质得最基本单位,也就是所有生命活动得基础。
不论要揭示某个基因得功能,还就是要改变某个基因得功能,都必须首先将所要研究得基因克隆出来。
特定基因得克隆就是整个基因工程或分子生物学得起点。
本文就基因克隆得几种常用方法介绍如下。
1 根据已知序列克隆基因对已知序列得基因克隆就是基因克隆方法中最为简便得一种。
获取基因序列多从文献中查取，即将别人报道得基因序列直接作为自己克隆得依据。
现在国际上公开发行得杂志一般都不登载整个基因序列,而要求作者在投稿之前将文章中所涉及得基因序列在基因库中注册，拟发表得文章中仅提供该基因在基因库中得注册号(acｃｅssion numｂer）,以便别人参考与查询。
目前，世界上主要得基因库有１）EMBL,为设在欧洲分子生物学实验室得基因库，其网上地址为;（2)Genbank，为设在美国国家卫生研究院(ＮIＨ）得基因库，其网上地址为;（3)Swｉssport与TＲEMBＬ,Swissport就是一蛋白质序列库,其所含序列得准确度比较高,而TREMBＬ只含有从EＭBＬ库中翻译过来得序列。
目前,以Geｎbａnk得应用最频繁。
这些基因库就是相互联系得,在Genbank注册得基因序列,也可能在Swisspoｒt注册。
要克隆某个基因可首先通过Inｔeｒnet查询一下该基因或相关基因就是否已经在基因库中注存。
查询所有基因文库都就是免费得,因而极易将所感兴趣得基因从库中拿出来,根据整个基因序列设计特异得引物，通过PＣＲ从基因组中克隆该基因,也可以通过RＴ-PCＲ克隆cＤNA。
值得注意得就是,由于物种与分离株之间得差异,为了保证PＣR扩增得准确性,有必要采用两步扩增法,即neｓted PCR。
根据蛋白质序列也可以将编码该蛋白质得基因扩增出来。
在基因文库中注册得蛋白质序列都可以找到相应得ＤNA或cDNＡ序列。
如蛋白质序列就是自己测定得，那么需要设计至少１对简并引物(dｅgｅneｒated ｐrimeｒ),从cDNA文库中克隆该基因。
以这种方法克隆得基因必须做序列测定才能鉴别所扩增产物得特异性。
另外,在基因克隆之后，如还要进一步做表达研究，所使用得PCR酶最好不用Taq DNA聚合酶，而采用其她有自我检测（reading proｏf)功能得酶,如pfｕ。
这样可以避免由于扩增过程中出现得点突变或终止密码子而导致整个研究结论得错误。
２根据已知探针克隆基因这也就是基因克隆得一种较直接得方法。
首先将探针作放射性或非放射性标记,再将其与用不同内切酶处理得基因组DNＡ杂交,最后将所识别得片段从胶中切下来，克隆到特定得载体（质粒、噬菌体或病毒)中作序列测定或功能分析。
这种方法不但可以将基因克隆出来,还能同时观察该基因在基因组中得拷贝数。
但在探针杂交后,要注意高强度（high striｎgent）漂洗,以避免干扰信号,即保证克隆得特异性,同时节省时间。
3 未知序列得基因打靶根据已知序列进行基因克隆，多数就是重复别人得工作,或者就是在别人工作得基础上继续自己得工作,因而不存在新基因得克隆过程。
对未知序列得基因克隆才就是真正得创造性研究。
3．1 随机引物法克隆未知序列基因［1］随机引物ＰCR(arbitrａrilｙ primed ＰＣR,AP－PCR)首先被用于基因组DNA或ＲNA得指纹图谱(finｇer pｒｉnt)分析，后来也有人将这种方法用于克隆与表型相关得基因或mＲＮA。
该方法得理论依据就是:表型受基因支配,在一个生物体发生了表型变化后,其基因组ＤＮA 很可能发生变化或出现不同基因得激活或关闭等;另一方面,如在寄生虫得发育过程中,不同发育阶段得虫体所表达得基因很可能不同,如将不同发育阶段得虫体ｍRＮA提取出来，用单一引物（随机引物,其长度不超过16 nt）对不同时期得虫体ｍRNA进行扩增比较，即可找出导致表型变异得遗传学依据。
这种方法就是一种比较PCＲ,它要求至少有２种来自不同表型但又很类似得基因组DNA或mRNA。
ＡＰ－ＰＣＲ扩增后得产物必须99%就是一致得,只有个别特异得产物出现在特异得表型个体中。
该方法对表型或种源关系相差甚远得生物个体之间没有比较意义、应用AＰ-PCＲ法进行2种或多种表型特征类似得个体间指纹图谱分析或表型相关基因克隆箭头所指扩增带为特异于个体(Ⅱ）得扩增产物AP-ＰＣR得操作一般采用两步法,即前10个循环多以较低得退火温度（anneａlｉnｇtemperature)进行扩增,后20个循环则采用较高得退火温度扩增。
ＡP-ＰCR产物多较短,一般需高浓度得琼脂糖凝胶检测,也可用聚丙烯酰胺凝胶检测。
如扩增得模板为mＲNA,通过比较扩增产物得强度，可以得知该基因在２种生物或同一生物不同发育阶段得表达强度。
另外，在AP－PCR检测到与某一表型相关得基因或基因产物(mRNA）以后,下一步工作就就是克隆出整个基因或mRNA。
主要操作程序为1)AＰ－PCR产物得提取、克隆及序列测定。
首先将AP-PＣＲ检测到得特定片段从凝胶中切下,提取DNA克隆到适宜得载体内(如TA载体),再测定其核苷酸组成。
根据其核苷酸组成设计2个方向相反得引物(P-1,P-2,见图2)。
引物长度多在20 nt以上;退火温度在60℃以上;(2）将基因组ＤNA做适当酶切，然后在其两端连接上相同得接头(这种接头可从生物制品公司购买）。
根据接头得序列扩增。
3、2 Differentiａl display PＣR(DD-PCR)DD-PCR就是在AP-PCR基础上发明得一种RT－ PCＲ方法,主要用于2种或多种类似生物个体在基因表达上得差异分析。
其基本原理就是:所有真核生物得成熟mRNA都含有不同长度得polｙ（Ａ)尾部序列,根据poly (A)内部得2个核苷酸排列得不同,可以将所有得mRN Ａ分子分为12类(见图3)。
根据这12种mRNA序列可合成12种相应得反转录引物,即Ｍ’Ｎ’TＴTTTTTT……,用其分别进行反转录,即可将所有mRNA分类合成1２种cDNA(于12个试管内),然后再用随机引物，以这12种 cDNＡ分别做模板进行PCR扩增(见图1与图4),那么与表型相关得mRNA就很容易被发现并克隆出来。
但不论AＰ－ＰCR还就是DD-PＣR,都适用于2种种源近似生物或不同发育阶段得同一个体之间得比较。
因而，其PＣＲ得模板必须就是来自２个生物或同一生物得不同发育阶段得mRNA。
DD-ＰＣR得优点就是快速、方便,可以检测表达量极低得mRNA,但其技术条件要求较高，所扩增得mRNＡ得质量不能有差异,即mRNA不应降解。
目前这一方法已广泛应用于生物表型相关基因得克隆及比较研究。
3、３Ｒepresｅntatｉve ｄiｆｆerence ａnalysis PＣR (RDA-PCR)[3～５]这就是一种差减杂交(ｓubtractivｅ hybrｉｄizａtio-n）与ＰCＲ相结合得技术,其整个操作程序完全不同于AＰ-PＣＲ与ＤD-PCR。
前2种方法就是将两模板DＮＡ或ｃDNA分别进行PCR扩增,最后通过扩增产物得差异,分离与克隆特异扩增带,其缺点就是需要将特异扩增产物从胶中切下来,提取DNA,再扩增后才能克隆。
RDA-PＣR只扩增区别于某一表型得特异基因,因而更便于扩增产物得克隆与分析(见图5)。
其基本原理就是：用一个在种源上相近得基因组将靶基因组中所有共同得基因掩盖起来,而只暴露出特异得基因,在整个反应中只有特异基因能被扩增。
其操作程序为：(1）用同一限制性内切酶(一般用Bam ＨI,Ｂgl II或Hind III)同时处理靶基因组与掩盖基因组ＤNA，其中掩盖基因组DNA得量至少要2倍于靶基因组DＮA得量;(2)在经酶切得靶基因组片段得两端加上连接头,其序列与酶切产生得粘性末端得序列相对应;(3)将2个基因组得DNA混合后,高温变性,低温退火。
由于掩盖基因组ＤNA得量远大于靶基因组DN Ａ量,那么与掩盖基因组ＤNＡ相同得靶基因就会与掩盖基因形成杂合体，而只有特异得靶基因才能重新组合,不会受掩盖基因得影响;(4)用Taq ＤＮA聚合酶将粘性末端补齐后,加入与连接子相对应得引物,经过30个左右得PCR扩增,就可以将靶基因组中与掩盖基因不同得特异基因扩增出来。
这种方法得起始操作程序较复杂,各反应步骤要求准确无误,但其检测得准确度较高。
对于基因组内得点突变、重排、插入序列等变化均可检测出来。
４用特异抗体克隆基因ﻫ用抗体克隆基因得关键就是抗体得特异性。
一般以单克隆抗体最为理想。
获取特异抗体得方法主要有:(１)制备识别功能抗原得单克隆抗体;（２)将ＳDＳ－PAＧE分离得蛋白质特异带切下免疫动物,其抗体只识别该特异蛋白质;(3)用Westeｒn-blot法将识别某一蛋白质带得抗体从膜上洗脱下来。
在获取理想得抗体后,便可以用这些抗体筛选表达型基因组文库或cDNA 文库,从文库中将编码某一特异蛋白质得基因克隆出来。
ﻫ５特异基因得功能克隆它就是借助于基因产物即基因所编码得蛋白质得功能将该基因克隆出来得一种方法。
基因得功能克隆主要有2种:一就是pｈａge diｓpｌay［6，7］,另一就是 pｅpｔｉｄe disｐlａy。
后者得原理与前者基本相同。
目前以pｈaｇe disp ｌａy得应用最为广泛,本文只对这一方法加以介绍。
任何一种病原体,包括细菌、病毒与寄生虫,在其对宿主侵入或致病过程中,病原体本身得蛋白质成分(lｉgａnd)需要首先与宿主细胞上得受体(reｃeptor)相互识别连接。
如口蹄疫病毒需要借助于受体细胞上得Hepaｒan sｕｌfaｔe受体,并与其相互作用后才能侵入细胞内;巴贝斯虫裂殖子需借助于宿主得补体作为桥梁，才能与红细胞结合并最后侵入红细胞内。
对病原体与宿主受体相互作用成分得特性与功能分析,就是制订免疫预防措施及制备阻断药物得前提。
pｈag ｅdiｓplaｙ法就是克隆病原体ligａnd得一种最为理想得手段。
Phage diｓpｌay得基本操作过程为：(１)提取某一病原体基因组DNＡ,用超声波将DＮＡ切割成５00～１ 5０0得片段；(2）将片段末端用Ｔ4DNA聚合酶处理后,与载体DNA(phagemid）连接形成噬菌体质粒。
用这些质粒与辅助噬菌体(hel ｐer pｈａｇe）同时转染大肠杆菌。
ｐｈａｇemｉd在大肠杆菌内包装成噬菌体,大量繁殖,同时将插入得外源基因片段表达,表达产物主要集中在噬菌体颗粒得表面;(3)将特定得受体固定于载体上(多为ＥLISA板)，方法同一般得ＥLISA包被。
将噬菌体悬液作适当稀释后，加入平板孔内，感作一段时间,用 PBS 等缓冲液漂洗。
最后,只有表达特异功能蛋白得噬菌体才能与包被在平板上得受体相互结合,那些表达非相关蛋白得噬菌体由于不能与受体连接而被洗脱； (4)用高强度ＮaＣl液将结合在受体上得噬菌体分离下来,再感染大肠杆菌，便可将编码特异功能蛋白质得基因克隆。