整个基因克隆实验流程(完整)
基因克隆过程及注意事项
以猪APOA2基因为例一．提取总RNATRIzol法提取RNATRIZOL试剂是直接从细胞或组织中提取总RNA的试剂。
它在破碎和溶解细胞时能保持RNA的完整性。
加入氯仿后离心，样品分成水样层和有机层。
RNA存在于水样层中。
收集上面的的水样层后，RNA可以通过异丙醇沉淀来还原。
在除去水样层后，样品中的DNA和总蛋白也能相继以沉淀的方式还原。
乙醇沉淀能析出中间层的DNA，在有机层中加入异丙醇能沉淀出蛋白。
共纯化DNA对于样品间标准化RNA的产量十分有用Trizol试剂可以快速提取人、动物、植物、细菌不同组织的总RNA，该方法对少量的组织(50-100 mg)和细胞(5×106)以及大量的组织(≥1 g)和细胞(>107)均有较好的分离效果。
TRIZOL试剂操作上的简单性允许同时处理多个的样品。
所有的操作可以在一小时内完成。
TRIZOL抽提的总RNA能够避免DNA和蛋白的污染。
故而能够作RNA 印迹分析、斑点杂交、poly(A)+ 选择、体外翻译、RNA酶保护分析和分子克隆。
如果是用于PCR，当两条引物位于单一外显子内时，建议用级联扩大的DNase I(Cat. No. 18068)来处理抽提的总RNA。
并且利用DNA、RNA和蛋白质在不同溶液中的溶解性质，可以通过分层分别将不同层中的RNA（上层）、DNA（中层）、蛋白质（下层）分离纯化出来，效率极好。
Trizol试剂能促进不同种属不同分子量大小的多种RNA的析出。
例如，从大鼠肝脏抽提的RNA琼脂糖凝胶电泳并用溴化乙啶染色，可见许多介于7 kb和15 kb之间不连续的高分子量条带，（mRNA和hnRNA成分）两条优势核糖体RNA条带位于~5 kb (28S)和~2 kb (18S)，低分子量RNA介于0.1 和 0.3 kb之间 (tRNA, 5S)。
当抽提的RNA用TE稀释时其A260/A280比值≥1.8使用TRIzol注意事项TRIzol对人体有害，使用时应戴一次性手套，注意防止溅出。
基因克隆实验手册
插入片段 线性化载体
推荐使用的试剂盒
产品信息
DNA Ligation Kit <Mighty Mix> P4
Blunting Kination Ligation (BKL) Kit
P6
TaKaRa DNA Ligation Kit LONG P4
Mighty TA-cloning Kit
P6
Mighty TA-cloning Reagent Set for PrimeSTAR®
↓ ③42℃反应45秒后，在冰中放置1～2分钟
↓ ④加入已预先37℃保温的SOC培养基，使终体积为1 ml。
↓ ⑤37℃振荡培养1小时（160～225 rpm）
↓ ⑥取适量涂布于LB选择培养基、37℃过夜静置培养
5. PCR扩增确认插入片段DNA 6. 培养、纯化质粒
PCR扩增确认插入片段DNA请参考第5页
TCGA 5’ Hin d Ⅲ
线性化载体 ※
C TAG A G C T
※ 利用限制性内切酶酶将环状载体DNA切断后，切胶 回收、或必要时进行去磷酸化反应
转化
·感受态细胞
形成菌落
进行菌落PCR 确认插入片段
·EmeraldAmp® MAX PCR Master Mix等
·电泳相关制品
— 1—
基因克隆实验手册
※ PCR扩增产物是平滑末端时进行dA加尾反应。
【目的DNA片段】 带有限制性内切酶的
酶切末端
In-Fusion克隆
5×In-Fusion® HD In-Fusion酶使 Enzyme Premix 末端15个相同
碱基无缝融合
TA克隆
3’ A
A 3’
T载体
基因克隆具体实验报告
一、实验目的1. 学习基因克隆的基本原理和方法。
2. 掌握PCR扩增、酶切、连接等基因克隆实验技术。
3. 验证目的基因的克隆是否成功。
二、实验原理基因克隆是指将目的基因片段从基因组中分离出来，并插入到载体中，使其在宿主细胞中复制、表达的过程。
实验过程中，主要涉及PCR扩增、酶切、连接、转化、筛选等步骤。
三、实验材料1. 模板DNA：含有目的基因的基因组DNA。
2. 引物：根据目的基因序列设计的上下游引物。
3. Taq DNA聚合酶：用于PCR扩增。
4. 酶切体系：限制性内切酶、缓冲液、连接酶等。
5. 连接载体：线性化载体。
6. 转化宿主菌：大肠杆菌DH5α。
7. 筛选培养基：含抗生素的LB培养基。
8. PCR扩增试剂：10×PCR缓冲液、dNTPs、MgCl2等。
四、实验方法1. PCR扩增（1）设计引物：根据目的基因序列设计上下游引物，长度约为20-30bp，分别位于目的基因的上下游。
（2）PCR反应体系：取模板DNA 1μl，上下游引物各1μl，10×PCR缓冲液5μl，dNTPs 4μl，MgCl2 2μl，Taq DNA聚合酶0.5μl，加ddH2O至50μl。
（3）PCR反应程序：95℃预变性5min，95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，共35个循环，最后延伸10min。
2. 酶切连接（1）酶切：取PCR产物5μl，加限制性内切酶（如EcoRI）1μl，10×酶切缓冲液2μl，ddH2O 2μl，混匀后置于37℃水浴酶切2h。
（2）连接：取线性化载体5μl，酶切产物5μl，10×连接缓冲液2μl，T4 DNA 连接酶1μl，混匀后置于16℃连接过夜。
3. 转化（1）制备感受态细胞：将大肠杆菌DH5α在LB培养基中培养至对数生长期，按照1:100的比例加入CaCl2，混匀后冰浴30min。
（2）热激转化：将连接产物加入感受态细胞中，混匀后置于42℃水浴45s，迅速转移至冰浴中。
整个基因克隆实验规程完整
整个基因克隆实验规程完整Document serial number【KK89K-LLS98YT-SS8CB-SSUT-SST108】一、组织总RNA的提取相关试剂：T rizol；氯仿；苯酚；异丙醇；75%乙醇；RNase-free水相关仪器：制冰机；液氮&研钵/生物样品研磨仪；高速离心机；移液器（1ml、200μl、100μl/50μl）；涡旋振荡仪；恒温金属浴。
相关耗材：解剖工具，冰盒，离心管，离心管架，吸头（1ml，200μl/300μl），一次性手套，实验手套。
实验步骤1.取暂养草鱼，冰上放置一段时间，然后解剖，剪取肠道50~100mg，放入研钵中，加入液氮迅速研磨，然后加入1ml 预冷TRIzol试剂，充分研磨至无颗粒物存在。
2.转移到离心管中，室温放置5min，使细胞充分裂解；3.按1ml Trizol加入200μl氯仿，盖上盖子，迅速充分摇匀15s，然后室温放置3min；4.4℃，,12000g 离心15min；此时混合物分为三层，下层红色的苯酚氯仿层，中间层和上层无色水相；RNA存在于无色水相中；5.小心吸取上清液，千万不要吸取中间界面，否则有DNA污染；转移至一个新的离心管，加入等体积的异丙醇，轻轻混匀；6.室温放置10min；4℃，,12000g 离心10min；7.弃上清，加入1ml 75%乙醇洗涤；涡旋，悬浮沉淀；4℃，,12000g 离心5min；8.弃上清；可以再次用75%乙醇洗涤沉淀；9.弃上清；用移液器轻轻吸取管壁或管底的残余乙醇，注意不要吸取沉淀；室温放置5min晾干沉淀；（RNA样品不要过于干燥，否则极难溶解）10.沉淀中加入30μl RNase-free水，轻弹管壁，使RNA溶解。
RNA质量检测相关试剂：溴酚蓝， TEB/TAE电泳缓冲液，溴乙锭（EB）相关仪器：（超微量分光光度计，移液器（2.5μl 或2μl 规格，10μl规格），电子天平，电泳仪，电泳槽，凝胶成像仪，微波炉，制冰机）相关耗材：（无菌无绒纸，吸头，离心管架，PCR管，PCR管架，锥形瓶，烧杯，一次性手套，实验手套，冰盒）（1）RNA纯度的检测：测定其OD260和OD280的值，根据其OD260/ OD280的比值，当其比值在1.9~2.1之间，说明提取的总RNA纯度比较高，没有蛋白质和基因组的污染。
基因克隆方案
基因克隆方案基因克隆是现代生物学中一项重要的技术手段，可以帮助科学家们研究和理解基因在生物体内的功能以及相互作用关系。
本文将介绍一种基因克隆的方案，包括所需材料、实验步骤以及预期结果。
材料准备：1. 原核或真核生物DNA样本2. 大肠杆菌或其他合适的宿主细胞3. 抗生素培养基4. 离心管和显微管5. 高速离心机6. 热循环仪7. DNA聚合酶、限制性内切酶、连接酶等相关试剂实验步骤：1. DNA片段的制备a. 提取所需的DNA样本，并利用限制性内切酶进行酶切，得到所需的目标DNA片段。
b. 进行DNA片段的纯化，通过凝胶电泳确认目标DNA片段的大小，并将其收集起来。
2. 载体的制备a. 准备合适的载体，如质粒或病毒。
b. 利用限制性内切酶对载体进行酶切，以开放载体的多个切位。
c. 将目标DNA片段与载体进行连接，使用连接酶催化反应使其稳定结合。
3. DNA的转化与筛选a. 将连接好的DNA测序样本转化到合适的宿主细胞中，如大肠杆菌。
b. 将转化后的细胞培养于含有抗生素的培养基上，以筛选带有目标DNA的克隆。
c. 通过PCR等方法检测筛选出的克隆是否携带目标基因，确认克隆是否成功。
4. 克隆的扩增与提取a. 选择带有目标基因的克隆进行扩增培养。
b. 利用高速离心机将细胞进行离心分离，提取出目标DNA。
预期结果：经过以上步骤，我们可以获得目标基因的克隆并进行扩增。
在实验结果中，我们能够观察到目标DNA片段在凝胶电泳图谱中的特定带状条带，同时，通过PCR验证可以进一步确认克隆是否成功。
此外，最终扩增的目标基因克隆可以用于后续的实验研究，如转基因生物的构建或基因功能的研究。
总结：通过以上实验方案，我们可以使用基因克隆技术获得目标基因的克隆，并获得扩增后的纯净DNA样本。
这项技术在现代生物学和医学研究中具有广泛的应用前景，为科学家们研究基因的功能及其在人类健康中的意义提供了关键的工具。
然而，需要注意的是，基因克隆技术的操作需要严格遵守实验室安全规范，并经过充分的训练，以确保实验的准确性和安全性。
目的基因T载体克隆实验步骤
目的基因T载体克隆实验步骤pcr产物的t载体克隆一.重组质粒的构建：重组的dna分子就是在dna连接酶的促进作用下，存有mg切的载体分子与外源dna分子进行连接。
dna连接酶存有两种：t4噬菌体dna连接酶和大肠杆菌dna连接酶。
两种dna连接酶都存有将两个具有相同粘性末端的dna分子连在一起的功能，而且t4噬菌体dna连接酶除了一种大肠杆菌dna连接酶没的特性，即为能够并使两个平末端的双链dna分子连接起来。
但这种相连接的效率比粘性末端的相连接率为高，通常可以通过提升t4噬菌体dna 连接酶浓度或减少dna浓度去提升平末端的相连接效率。
t4噬菌体dna连接酶催化剂dna 连接反应分成3步：首先，t4dna连接酶与辅因子atp构成酶-atp复合物；然后，酶-atp 复合物再融合至具备5’磷酸基和3’羟基切口的dna上，并使dna腺苷化；最后产生一个代莱磷酸二酯键，把切口封出来。
连接反应通常将两个相同大小的片断相连。
很多dna聚合酶在进行pcr扩增时会在pcr产物双链dna每条链的3’端加上一个突出的碱基a。
pucm-t载体是一种已经线性化的载体，载体每条链的3’端带有一个突出的t。
这样，pucm-t载体的两端就可以和pcr产物的两端进行正确的at配对，在连接酶的催化下，就可以把pcr产物连接到pucm-t载体中，形成含有目的片断的重组载体。
连接反应的温度在37℃时有助于连接酶的活性。
但是在这个温度下黏末端的氢键融合就是不稳定的。
因此实行折衷的温度，即12-16℃，相连接12-16h（过夜），这样既可以最大限度地充分发挥连接酶的活性，又兼具至较长时间接合结构的平衡。
2、atp存有的相连接缓冲器系统中，将分别经酶二.感受态制备原理细菌在0ccacl2低渗溶液中胀变成球形，遗失部分膜蛋白，沦为难稀释外源dna的状态。
三.β-半乳糖甘酶显色反应选择法（蓝白筛选）原理lacz基因是大肠杆菌乳糖操纵子中的一个基因，可以编码β—半乳糖核苷酶。
基因克隆步骤完整版
基因克隆步骤完整版基因克隆是一项复杂的生物技术，可以用于生物研究、药物开发和农业改良等领域。
下面是基因克隆的完整步骤：1.设计克隆实验方案：首先，确定要克隆的基因序列。
这可以是来自同一物种的已知基因，或者是从其他物种中提取的基因。
然后，设计适当的引物（引物是专门设计用来扩增特定DNA序列的短片段）用于PCR扩增。
2.DNA提取：提取目标组织或细胞中的DNA。
常用的DNA提取方法包括酚/氯仿法、盐法和商业DNA提取试剂盒等。
3.PCR扩增：使用引物和DNA模板进行多轮PCR扩增，从而产生大量目标基因的复制。
4.凝胶电泳：将PCR产物进行凝胶电泳分析，以确认扩增是否成功，并确定目标基因的大小。
5.DNA纯化：将目标基因的PCR产物从凝胶中切割并纯化。
这通常通过使用商业DNA凝胶提取试剂盒来完成。
6.多重限制性内切酶切割和连接：根据克隆方案中的设计，使用适当的限制性内切酶切割DNA。
然后，将目标基因连接到一个载体DNA中，这个载体DNA称为克隆载体。
克隆载体通常是一个圆形的质粒DNA。
7.转化：将克隆载体插入到宿主细胞中。
这可以通过热激冷转化、电转化或化学转化等方法实现。
8.筛选转化子：使用适当的筛选方法筛选转化子。
这可以通过选择性培养基，例如含有抗生素的培养基，或者通过对转化子进行荧光筛选等方法。
9.扩增：从筛选出的阳性克隆中提取DNA，并使用PCR或其他方法进行扩增。
10.序列分析：对扩增的DNA进行序列分析，以确认克隆是否成功。
这可以通过将DNA提交给商业实验室进行测序，或者使用自动测序设备进行测序。
11.功能分析：对克隆所得基因进行功能分析。
可以通过转基因生物的研究，观察基因对生物表型的影响。
12.存储和应用：将克隆所得的基因保存在冷冻库中，以备后续研究或应用。
总结：基因克隆是一项复杂的过程，包括基因序列设计、DNA提取、PCR扩增、凝胶电泳、DNA纯化、限制性内切酶切割和连接、转化和筛选转化子、扩增、序列分析、功能分析和存储等步骤。
全基因组测序逐步克隆法的原理与流程分析
全基因组测序逐步克隆法的原理与流程分析全基因组测序逐步克隆法是一种常用的基因克隆方法，可以用于测定整个生物体的基因组序列。
该方法通过将DNA分子切割成多个较小的片段，逐步将这些片段克隆并测序，最终得到完整的基因组序列。
本文将对全基因组测序逐步克隆法的原理与流程进行详细分析。
一、原理全基因组测序逐步克隆法的原理基于Sanger测序技术和限制性内切酶切割的原理。
该方法先将DNA样本进行限制性内切酶切割，得到许多不同长度的DNA片段。
然后，这些DNA片段逐个进行克隆，并经过Sanger测序技术进行序列测定。
最后，根据测序结果，通过重叠匹配等方式将这些片段拼接起来，得到完整的基因组序列。
二、流程全基因组测序逐步克隆法的流程包括DNA提取、限制性内切酶切割、DNA片段克隆、Sanger测序和序列拼接几个关键步骤。
1. DNA提取：将感兴趣的生物体样本（如细胞、组织等）中的DNA提取出来。
这可以通过破碎细胞壁、裂解核膜等方式进行。
2. 限制性内切酶切割：将提取得到的DNA样本与适当的限制性内切酶一起反应，使得DNA分子在特定的酶切位点被切割成多个较小的片段。
这样做的目的是得到较小的DNA片段，方便后续的克隆和测序。
3. DNA片段克隆：将切割后的DNA片段克隆到合适的载体中，如质粒。
这可以通过PCR扩增、DNA连接等方法进行。
克隆得到的DNA片段形成了一个个克隆子，每个克隆子都携带着一个特定的DNA片段。
4. Sanger测序：对克隆得到的DNA片段进行测序。
通常采用Sanger测序技术，利用特殊的引物、有色荧光基团和催化测序反应来测定DNA片段的序列。
这个过程会产生一系列不同长度的读取片段，从而获得DNA片段的测序结果。
5. 序列拼接：根据Sanger测序结果，通过比对、重叠匹配等算法将不同的DNA片段拼接起来，得到整个基因组序列。
三、分析全基因组测序逐步克隆法具有如下几个优点和局限性：优点：1. 可以测定整个生物体的基因组序列，提供全面的遗传信息。
全长克隆实验步骤
HBV 全基因克隆一病毒DNA的提取1.在1.5ml螺旋盖塑料离心管加入480μl病毒DNA out溶液。
2.加入160μl血清样品，彻底振荡30s混匀后室温放置10min。
3.再振荡30s混匀，加入560μl异丙醇，振荡30s，15000g室温离心15min，带管盖柄的方向一致向外。
4.先用1ml移液枪遗弃上清，分两次吸取（注意不要触及沉淀或者让吸起的液体污染枪），留少量液体，再短暂离心1min，用100-200μl移液枪小心地弃所有残留液体，此步作用尽量去除液体中杂蛋白。
5.加入800μl 70%的乙醇，轻柔颠倒混合3次，不要摇散底部沉淀，然后15000g室温离心5min，按照4的方法分两次遗弃上清，此步作用在于去除残留异丙醇和盐分。
6.开盖8min蒸发，使DNA更易于融解于水，此时加入80μl Tris缓冲液，等待2-3min，使沉淀变得松散，用移液枪吹打管壁和管底的膜状沉淀，使其融解。
7.15000g离心1min后，-20℃保存。
二 HBV全长基因组的扩增Sense primer F1:5--CCGGAAAGCTTGAGCTCTTCTTTTTCACCTCTGCCTAATCA--3’（1821-1841）antisense primer R1:5--CCGGAAAGCTTGAGCTCTTCAAAAAGTTGCATGGTGCTGG-- 3’（1825-1806）引物设计合成以HBV负链开口处序列为起始点，引物3’末端最后一个碱基硫代磷酸化修饰（抵抗Pfu的3’－5’外切酶活性），引物包含Sal I与Not I酶切位点。
PCR反应液组成，20μl体系如下：(两管共计40μl)10×LA PCR Buffer 2μl2.5mmol/L dNTP Mixture 1.6μl1/5 F1(25μmol/L) 1μl1/5 R1(25μmol/L) 1μlTaKaRa LA Taq (5U/μl) 0.4μl蒸馏水 4μlDNA模板 10μlPCR的循环参数：94℃ 5min94℃ 40s, 60℃ 1min40s, 72℃ 4min 共35个循环72℃ 7min 4℃ forever三 PCR产物的加A与回收TA克隆方法（Original TA Cloning Kit）即利用Taq聚合酶同时具有的末端连接酶的功能，在每条PCR扩增产物的3`端自动添加一个3`-A突出端。
基因克隆实验流程
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一、组织总RNA的提取
相关试剂：T rizol；氯仿；苯酚；异丙醇；75%乙醇；RNase-free水
相关仪器：制冰机；液氮&研钵/生物样品研磨仪；高速离心机；移液器（1ml、200μl、100μl/50μl）；涡旋振荡仪；恒温金属浴。
相关耗材：解剖工具，冰盒，离心管，离心管架，吸头（1ml，200μl/300μl），一次性手套，实验手套。
实验步骤
1.取暂养草鱼，冰上放置一段时间，然后解剖，剪取肠道50~100mg，放入研钵中，加入
液氮迅速研磨，然后加入1ml 预冷TRIzol试剂，充分研磨至无颗粒物存在。
2.转移到离心管中，室温放置5min，使细胞充分裂解；
3.按1ml Trizol加入200μl氯仿，盖上盖子，迅速充分摇匀15s，然后室温放置3min；
4.4℃，,12000g 离心15min；
此时混合物分为三层，下层红色的苯酚氯仿层，中间层和上层无色水相；RNA存在于无色水相中；
5.小心吸取上清液，千万不要吸取中间界面，否则有DNA污染；转移至一个新的离心管，
加入等体积的异丙醇，轻轻混匀；
6.室温放置10min；4℃，,12000g 离心10min；
7.弃上清，加入1ml 75%乙醇洗涤；涡旋，悬浮沉淀；4℃，,12000g 离心5min；
8.弃上清；可以再次用75%乙醇洗涤沉淀；
9.弃上清；用移液器轻轻吸取管壁或管底的残余乙醇，注意不要吸取沉淀；室温放置5min
晾干沉淀；（RNA样品不要过于干燥，否则极难溶解）
10.沉淀中加入30μl RNase-free水，轻弹管壁，使RNA溶解。
RNA质量检测
相关试剂：溴酚蓝，TEB/TAE电泳缓冲液，溴乙锭（EB）
相关仪器：（超微量分光光度计，移液器（2.5μl 或2μl 规格，10μl规格），电子天平，电泳仪，电泳槽，凝胶成像仪，微波炉，制冰机）
相关耗材：（无菌无绒纸，吸头，离心管架，PCR管，PCR管架，锥形瓶，烧杯，一次性手套，实验手套，冰盒）
（1）RNA纯度的检测：测定其OD260和OD280的值，根据其OD260/ OD280的比值，当其比值在1.9~2.1之间，说明提取的总RNA纯度比较高，没有蛋白质和基因组的污染。
（2）RNA完整性的检测：取2μlRNA，与2μl溴酚蓝混匀，用1%的琼脂糖进行凝胶电泳，20min后，在凝胶成像系统中观察效果。
当28S与18S条带清晰，且亮度比大约是2:1时，5S条带若隐若现，而且没有其它条带时，说明完整性不错，可以用于下游逆转录实验。
二、逆转录（RNA逆转录成cDNA）
相关仪器：（PCR仪/恒温金属浴，移液器（2.5μl 或2μl 规格，10μl规格），100μl 冰盒，制冰机，PCR管）
根据逆转录试剂盒（TOYOBO公司）说明书进行，反应体系及条件如下：
试剂使用量（μl）
Rnase Free H2O 11.75-Y
Oligo（dT） 1
Total RNA（<1000ng）Y
Total Volume 12.75
65℃，5min后，立即置于冰上。
试剂使用量（μl）
上一步变性后RNA溶液12.75
5×RT Buffer 4
dNTP Mixture（各10mM） 2
Rnase Inhibitor（10U/μl）0.25
Rever Tra Ace 1
Total V olume 20
然后放置于PCR仪上，反应程序为：42℃,60min；99℃,5min；16℃,5min。
所得cDNA放置于-20℃保存。
三、PCR反应
相关仪器：（PCR仪/恒温金属浴，移液器（2.5μl 或2μl 规格，10μl规格），100μl 电子天平，电泳仪，电泳槽，凝胶成像仪，微波炉，冰盒，制冰机）
试剂使用量（μl）
ddH2O 6.0
反转录产物 1.0
10×PCR Buffer 1.0
dNTP（10mmol/l）0.2
Taq酶（1U/μl）0.4
Ghrelin-F（10μmol/l）0.4
Ghrelin-R（10μmol/l）0.4
MgCl2（25mmol/l）0.6
Total V olume 10
反应条件：95℃,预变性3min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸45s，共35个循环；72℃延伸10min。
反应结束后，取5μl PCR产物，1%琼脂糖凝胶电泳检测。
四、PCR产物的分离，回收和纯化
相关试剂：胶回收试剂盒
相关仪器：（紫外照胶仪，移液器（200μl，1ml规格），离心机，恒温金属浴，涡旋混匀仪，制冰机，超微量分光光度计）
相关耗材：（切胶刀片，吸头，离心管架）
PCR反应得到目的条带后，加大反应体积，然后根据胶回收试剂盒说明书进行目的片段的回收纯化。
将所得DNA贮存于-20℃。
五、目的片段与载体的连接
相关仪器：（恒温金属浴，移液器（10μl，2.5μl规格）涡旋混匀仪，制冰机）
按照连接试剂盒(TAKARA公司)说明书进行操作。
pMD-18T载体1μl
DNA 2μl
ddH2O 2μl
然后加入5μl Ligation Mix，4℃/16℃放置过夜连接。
六、转化
相关仪器：（超净工作台，离心机，恒温培养箱，恒温摇床，恒温金属浴/水浴锅，移液器（1000μl，100μl，10μl，2.5μl规格）涡旋混匀仪，制冰机）
◆CaCl2法制备大肠杆菌DH5a感受态细胞
全过程冰上进行，4℃离心，无菌操作。
（1）以接种环从-80℃保存的高效转化菌种蘸取少量菌液划无抗生素平板，培养12h；（2）挑取单菌落接种于1ml无抗生素LB培养基中，37℃剧烈震荡培养6h；
（3）按1:100接种菌液于25ml LB液体培养基中，37℃震荡培养1.5～2h，至OD600达0.4～0.6；（这一步非常关键，培养过度的菌液含有较多的“老”细胞，制备成感受态细胞后其接受外援DNA的能力较低，从而导致转化率降低）
（4）冰上预冷10min；然后4℃，6000rpm离心10min；
（6）弃上清，将细菌沉淀重新悬浮于25ml预冷的0.1M CaCl2中，冰浴20min；
（7）4℃，6000rpm离心10min，弃尽上清；
（8）以1.25ml（菌液体积的5%）预冷的0.1M CaCl2溶液重悬细菌沉淀，同时加入0.3ml 预冷的100%甘油（甘油终浓度达15～20%），混匀后按每支100μl在冰上分装。
-80℃保存备用。
◆连接产物转化到感受态细胞
（1）将10μl连接产物加入100μl感受态菌液中，冰上放置30min；
（2）然后放到42℃水浴锅中热激90s，再在冰上放置3min；
（3）加入890μl LB液体培养基，37℃震荡培养60min；
（4）每个培养平板中加入40μlX-gal和4μlIPTG，然后吸取100μl菌液，均匀涂布于含Amp 的LB固体培养基平板上；
（5）37℃培养箱中正放1h，待菌液被琼脂完全吸干后，倒置平板，过夜培养16h。
（培养时间不宜过长，否则有卫星菌落产生）
七、菌液PCR检测
相关仪器：（PCR仪/恒温金属浴，涡旋混匀仪，移液器（10规格，1000μl规格），100μl电子天平，电泳仪，电泳槽，凝胶成像仪，微波炉，冰盒，制冰机）
在平板上挑取10～20个白色菌落，加入含有1ml Amp+LB液体培养基的1.5ml离心管中，37℃震荡培养6h。
3000rpm离心3min后吸掉上层400μl上清液，短暂涡旋将沉淀打散，然后把菌液当成模板，按上面PCR方法进行扩增，经1%琼脂糖凝胶电泳检测是否含有目的条带。
挑选扩增出正确目的条带的菌液送公司测序。
附注：
主要溶液和培养基的配制
1）电泳缓冲液10×TBE：108g Tris碱，55g 硼酸，20ml 0.5M的EDTA，加入蒸馏水混匀后定容至1000ml，调节pH为8.0；
2）LB液体培养基：蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g；加800ml去离子水，用10M NaOH 调节pH至7.0，定容至1000ml，高压（1.034×100000Pa）灭菌20min，4℃保存；
3）LB固体培养基：在LB液体培养基中加入琼脂粉至终浓度为1.5%，高温、高压灭菌20min 后降温至50~60℃，在无菌状态下铺制平板，室温放置过夜后，置于4℃保存；
4）氨苄青霉素贮存液：用无菌双蒸水配成100mg/ml，分装，-20℃保存。
使用时终浓度为100ug/ml。
5）用于制备感受态细胞的CaCl2（0.1mol/l）：称取0.56g CaCl2（无水，分析纯），溶解于50ml 双蒸水中，定容至100ml，高压灭菌；
6）X-gal（20mg/ml）的配制：将20mg X-gal溶于1ml二甲基甲酰胺中，-20℃避光保存；7）IPTG（200mg/ml）的配制：将0.2gIPTG溶于1ml去离子双蒸水中，0.22μm滤膜除菌，-20℃保存备用；
（dT）17-接头引物：5’GACTC GAGTC GACAT CGA(T) 173’
接头引物：5’GACTC GAGTC GACAT CG 3’
2.cDNA的纯化
利用胶回收试剂盒进行（去除多余的dNTP和引物）。
最后使用20μl TE洗脱沉淀。
2.cDNA的纯化
利用胶回收试剂盒进行（去除多余的dNTP和引物）。
最后使用20μl TE洗脱沉淀。
行下游实验。