基因的克隆与转化汇总.
基因工程知识点总结归纳(更新版)
基因工程绪论1、克隆（clone）：作名词：含有目的基因的重组DNA分子或含有重组分子的无性繁殖。
作动词：基因的分离和重组的过程。
2、基因工程（gene engineering）：体外将目的基因插入病毒、质粒、或其他载体分子中，构成遗传物质的新组合，并使之掺入到原先没有这些基因的宿主细胞内，且能稳定的遗传。
供体、受体和载体是基因工程的三大要素。
3、基因工程诞生的基础三大理论基础：40年代发现了生物的遗传物质是DNA；50年代弄清楚DNA 的双螺旋结构和半保留复制机理；60年代确定遗传信息的遗传方式。
以密码方式每三个核苷酸组成一个密码子代表一个氨基酸。
三大技术基础：限制性内切酶的发现；DNA连接酶的发现；载体的发现3、基因工程的技术路线：切：DNA片段的获得；接：DNA片段与载体的连接；转：外源DNA片段进出受体细胞；选：选择基因；表达：目的基因的表达；基因工程的工具酶1、限制性内切酶（restriction enzymes）：主要是从原核生物中分离纯化出来的，是一类能识别双链DNA分子中某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA双链的核酸内切酶。
2、限制酶的命名：属名（斜体）+种名+株系+序数3、II型限制性内切酶识别特定序列并在特定位点切割4、同裂酶：来源不同，其识别位点与切割位点均相同的限制酶。
5、同尾酶：来源不同，识别的靶序列不同，但产生相同的黏性末端的酶形成的新位点不能被原来的酶识别。
6、限制性内切酶的活性：在适当反应条件下，1小时内完全酶解1ug特定的DNA 底物，所需要的限制性内切酶的量为1个酶活力单位。
7、星号活性：改变反应条件，导致限制酶的专一性和酶活力的改变。
8、DNA连接酶的特点：具有双链特异性，不能连接两条单链DNA分子或闭合单链DNA，连接反应是吸能反应，最适反应温度是4至15度，最常用的是T4连接酶。
9、S1核酸酶：特异性降解单链DNA或RNA。
10、RNAH降解与DNA杂交的RNA，用于cDNA文库建立时除去RNA以进行第二链的合成。
植物生物技术中的基因克隆与转基因技术
植物生物技术中的基因克隆与转基因技术植物生物技术是指通过对植物基因的研究与应用，利用一系列方法和技术手段对植物进行改良，以提高农作物产量和品质，增强植物的抗病虫害能力，改进植物的适应性和耐逆性等。
其中，基因克隆与转基因技术作为植物生物技术的重要组成部分，发挥着关键的作用。
一、基因克隆在植物生物技术中的应用基因克隆是指将感兴趣的基因从一个物种中分离并放大，然后把它们转移到另一个物种中。
在植物生物技术中，基因克隆广泛应用于植物基因组的研究、基因功能的分析、种质资源的保护和创新育种等方面。
首先，基因克隆为植物基因组的研究提供了基础。
通过基因克隆技术可以获得目标基因的DNA序列，进而揭示基因的结构、功能和调控机制，为植物的进化和发育研究提供重要的依据。
其次，基因克隆还可以用于基因功能的分析。
通过克隆目标基因，可以利用转基因技术将该基因在目标植物中表达或沉默，从而研究基因在植物生长、发育和抗逆性等方面的功能。
此外，基因克隆在植物种质资源的保护和创新育种中起着重要作用。
通过克隆具有重要性状的基因，可以将这些基因迅速转移到其他作物中，实现对作物品质和抗性的改良。
相反，对于具有抗性基因的植物种质资源，通过基因克隆技术可以更好地理解和保护这些珍贵资源。
二、转基因技术在植物生物技术中的应用转基因技术是指将来自不同种属的基因导入目标植物中，使其获得新的特征或功能。
转基因技术在植物生物技术中被广泛运用于提高农作物产量和抗病虫害能力、改善营养价值、增加对逆境的耐受性等方面。
首先，转基因技术可以提高农作物的产量和抗病虫害能力。
通过转基因技术，可以将抗病虫害基因导入农作物中，使其获得对特定病虫害的抗性。
同时，还可以通过增加产量相关的基因表达来提高农作物的产量，从而满足粮食安全的需求。
其次，通过转基因技术可以改善农作物的营养价值。
例如，将含有丰富营养物质的基因导入作物中，使其富含蛋白质、维生素和矿物质等，从而提高人类对食物的营养摄入，缓解全球营养不足问题。
植物遗传工程中的基因克隆与转化技术
植物遗传工程中的基因克隆与转化技术植物遗传工程是指通过改变植物的遗传物质，以达到改良、改变或创新植物性状的目的。
其中基因克隆与转化技术是植物遗传工程中的关键技术之一。
基因克隆指的是通过将特定基因从一个生物体中分离并扩增形成DNA片段，使其能够在其他生物体中稳定表达。
转化技术则是将克隆的基因导入到目标植物体内，使其能够在植物表达并产生相应的功能。
一、基因克隆技术基因克隆技术是植物遗传工程中的关键环节。
首先需要从源生物体中分离出目标基因。
常用的方法有PCR扩增、限制酶切片段分离等。
通过PCR扩增技术，可以快速、高效地扩增目标基因，提供足够的DNA片段用于后续的克隆工作。
限制酶切片段分离则是利用特定的酶将目标基因从源DNA片段中切割出来。
接下来，克隆基因需要被插入到适当的载体中，常用的载体包括质粒和病毒等。
将基因插入载体后，需要通过转化技术将其导入目标植物体内。
二、转化技术转化技术是将克隆的基因导入到目标植物体内的关键步骤。
常见的转化技术主要有基因枪法、农杆菌介导法和化学法等。
基因枪法是通过将DNA微粒射入植物细胞，使基因得以导入的方法。
此方法简单、高效，对不同植物都适用，因此被广泛应用于植物遗传工程中。
农杆菌介导法则是利用农杆菌将目标基因导入植物细胞。
这种方法克服了基因枪法的一些限制，可以导入更长的DNA片段，但受适用植物种类的限制。
此外，化学法也是一种常用的转化技术，通过利用化学物质使植物细胞的细胞壁通透性增强，从而实现目标基因的导入。
三、应用前景与挑战基因克隆与转化技术在植物遗传工程中具有广阔的应用前景。
通过基因克隆和转化技术，可以实现对植物农艺性状的改良，提高植物的抗病虫害能力、耐逆性和产量，从而促进农业的可持续发展。
此外，利用基因克隆和转化技术还可以为植物生物制药、环境修复等领域提供解决方案。
然而，基因克隆与转化技术在应用过程中也面临一些挑战。
首先，对于目标基因的选择和定位仍然是一个复杂的问题。
基因的克隆与表达课件
----TAC -----TTG GAC CTT AAG GAT CCA---
DNA序列
AAT CGG AAG AAT TCA GAC CTA GGT TTA GCC TTC TTA AGT CTG GCT CCA
基因的克隆与表达课件
位相载体----含有3种读码框的系列载体
基因的克隆与表达课件
优点： • 表达效率高 • 产物稳定 • 易鉴定：融合蛋白分子量大，电泳可
➢基因克隆(gene cloning) ➢基因表达(gene expression)
-原核基因表达 -真核基因表达
基因的克隆与表达课件
基因克 隆 Gene Cloning
基因的克隆与表达课件
➢概述 ➢克隆载体 ➢受体细胞 ➢体外重组的策略 ➢基因克隆工作流程
基因的克隆与表达课件
一、概述
• 确定了遗传信息的携带者，即基因的盆 子载体是DNA而不是蛋白质
基因的克隆与表达课件
（二）体外重组 连接体系的建立： • 温度：粘末端连接：12-18℃
平末端连接：室温（低于30℃) • DNA量：载体分子数/目的基因分子数
=1：1-3 • 酶量：平端连接时需加大酶量
基因的克隆与表达课件
（三）转化—Cacl2法、电击法
（四）重组子的筛选及鉴定
1、筛选：平板法（抗生素、蓝白斑）
基因的克隆与表达课件
二．原核生物基因结构和表达特点
基因的克隆与表达课件
• 原核生物染色体DNA是裸露的环形 DNA，其转录和翻译是偶联的连续 进行。
• 原核生物形成多顺反子mRNA： mRNA在合成过程中和多个核糖体 结合，翻译形成多条肽链。
基因的克隆与表达课件
3、一般不含内含子（intron），没有转 录及翻译后加工系统
cdna基因克隆的基本原理和流程
一、CDNA基因克隆的基本原理CDNAplementary DNA）是DNA的互补序列，通过反转录酶将mRNA作为模板合成的一种DNA。
CDNA基因克隆是利用逆转录酶将mRNA逆转录合成cDNA，并通过PCR或其他方法将cDNA插入到质粒载体中，实现对目标基因的克隆。
二、CDNA基因克隆的流程1. RNA提取：首先需要从细胞中提取出总RNA，可以使用TRIzol等试剂进行RNA的提取纯化工作。
2. 反转录合成cDNA：将提取得到的RNA作为模版，利用逆转录酶进行cDNA的合成。
反转录反应通常包括RNA模版、随机引物、dNTPs、逆转录酶和缓冲液，并经过一系列温度循环反应，将mRNA 逆转录成cDNA。
3. cDNA纯化：为了避免反转录反应中产生的非特异性产物和杂质，需要对反转录反应产物进行纯化。
4. cDNA扩增：对cDNA进行PCR扩增，以获得目标基因的cDNA 片段。
PCR反应体系包括cDNA模板、引物、dNTPs、Taq聚合酶和缓冲液，通过一系列温度循环反应，扩增目标基因cDNA片段。
5. 酶切与连接：将PCR扩增得到的cDNA片段与质粒载体进行酶切，并在两者的黏端上连接。
6. 转化：将连接得到的质粒转化入大肠杆菌等细菌中，使其进行复制。
7. 筛选与鉴定：通过筛选和鉴定，选出携带目标基因cDNA片段的质粒，进行测序和分析，最终确定目标基因序列。
三、CDNA基因克隆的应用CDNA基因克隆技术已广泛应用于基因克隆、基因表达等多个领域。
在科研领域中，通过CDNA基因克隆技术可以方便快捷地获得目标基因的cDNA，实现对目标基因的研究和功能分析；在医药领域，CDNA基因克隆技术也被应用于基因治疗、蛋白表达等方面。
总结：CDNA基因克隆是一种重要的基因工程技术，通过反转录酶合成cDNA并将其插入到质粒中，可以方便地获取目标基因序列，具有广泛的应用前景。
掌握CDNA基因克隆的基本原理和流程对于开展相关实验研究具有重要意义。
基因工程中的基因克隆与基因表达实验总结
基因工程中的基因克隆与基因表达实验总结基因工程作为一门新兴的交叉学科，已经广泛应用于生物医学、农业、环境保护等领域。
其中，基因克隆和基因表达实验是基因工程的核心技术，对于研究基因功能和开发新药已经起到了重要作用。
本文将对基因工程中的基因克隆和基因表达实验进行总结，并探讨其在科学研究和应用中的前景。
一、基因克隆实验基因克隆是通过重组DNA技术，将感兴趣的基因从一个生物体中复制并插入到另一个生物体中的过程。
它是研究基因功能、生物制药和转基因等领域的基础。
基因克隆实验主要包括以下几个步骤：1. DNA提取与限制性内切酶切割：通过提取DNA样品，使用限制性内切酶切割将目标基因和载体DNA切割成相应片段。
2. 基因插入：将目标基因与载体DNA片段进行连接，常用的方法是使用DNA连接酶将两者黏合。
3. 转化与筛选：将连接后的DNA转入到宿主细胞中，使其成为转基因细胞。
通过选择性培养基进行筛选，可以获得拥有目标基因的转基因细胞。
通过基因克隆实验，我们可以获得不同生物体的目标基因，并进行后续的研究和应用。
例如，通过将某种植物的耐旱基因克隆到其他作物中，可以提高作物的抗旱能力，增加农作物产量。
二、基因表达实验基因表达实验是将目标基因在宿主细胞中进行转录和翻译，产生具有特定功能的蛋白质的过程。
基因表达实验是研究基因功能和制备重组蛋白等领域的重要手段。
基因表达实验主要包括以下几个步骤：1. 选择合适的表达系统：根据需要表达的蛋白质的性质和规模，选择合适的表达系统。
常用的表达系统包括细菌、酵母、哺乳动物细胞等。
2. 构建表达载体：将目标基因插入到表达载体中，通常使用限制性内切酶和DNA连接酶进行连接，并通过测序确保插入正确。
3. 细胞转染：将构建好的表达载体导入到宿主细胞中。
不同表达系统有不同的转染方法，如细菌的化学转型、酵母的电转染等。
4. 表达和纯化：经过一定时间的培养，宿主细胞会表达目标基因，合成目标蛋白质。
可以通过蛋白质纯化技术，如亲和层析、凝胶电泳等手段获得纯度较高的目标蛋白质。
克隆技术知识点总结
克隆技术知识点总结克隆技术是现代生物技术领域中的重要分支，通过对细胞或生物体进行复制，可以获得与原始个体遗传信息相同的克隆个体。
本文将从克隆技术的定义、分类、应用，以及伦理道德等方面对克隆技术的知识点进行总结。
一、克隆技术的定义克隆技术是指通过人工手段复制或产生与原始个体遗传信息相同的生物个体。
克隆技术可以分为两种形式：基因克隆和生物体克隆。
基因克隆是指通过重组DNA技术获得具有相同遗传信息的DNA分子，而生物体克隆则是通过复制细胞或胚胎来获得与原始个体相同基因组的生物个体。
二、克隆技术的分类根据克隆技术的不同方法和手段，可以将其分为以下几种类型：1. 重组DNA技术克隆：通过将目标基因插入到载体DNA中，进而将其转化到宿主细胞中，使得宿主细胞表达目标基因并进行大量复制。
2. 基因工程克隆：通过DNA分子的重组和转化，将外源基因导入到受体生物体中，使得受体生物体表达和遗传外源基因。
3. 细胞克隆：通过体细胞核移植或分裂的方法，复制出与原始细胞基因相同的细胞，实现细胞的无性繁殖和扩增。
4. 动物体克隆：通过体细胞核移植等方法，复制出与原始生物体基因相同的生物个体。
5. 植物体克隆：通过组织培养、离体培养等方法，将植物组织进行分裂和再生，得到与原始植株基因相同的新个体。
三、克隆技术的应用克隆技术在各个领域都有广泛的应用。
以下是其中一些主要领域的应用：1. 医学研究：克隆技术在医学研究中可以用于制备大量含有特定基因的重组蛋白，用于疾病的诊断和治疗研究。
2. 农业领域：通过克隆技术可以获得优良农作物的纯合株系，提高农作物的产量和抗病虫害能力。
3. 物种保护：对于濒危物种而言，克隆技术可以通过细胞克隆或动物体克隆的方式，复制出与原始物种基因完全相同的个体，以保护珍稀物种。
4. 药物研发：通过克隆技术可以制备大量含有特定基因的动物模型，用于药物研发和毒性测试。
5. 人类生育领域：体细胞核移植技术为不育夫妇带来了希望，使得他们可以通过克隆技术获得自己的后代。
植物基因的克隆与转化_3_转基因植物中报告基因的检测方法
科技知识讲座植物基因的克隆与转化(3)转基因植物中报告基因的检测方法李成云 (云南省农业科学院生物技术研究所,昆明 650223) 检测转基因植物有许多方法。
根据检测的基因功能来划分,可分为调控基因(包括启动子、终止子等)检测法、标记基因检测法及目的基因直接检测法。
根据检测的不同阶段区分,有DNA检测法,RNA检测法及蛋白质检测法。
DNA检测法只能检测到外源基因是否已经整合到植物基因组中,而后两种检测方法检测到的是外源基因是否能在受体植物中表达;根据RNA检测法得到的结果可判定外源基因是否转录,蛋白质检测法则可检测出外源基因是否翻译。
还可根据检测所用的具体方法划分,有PCR检测法、化学组织检测法、酶联免疫吸附法、S onth2 ern杂交法、Nouthern杂交法、Western杂交法及生物测定检测法等。
但这些划分也并非是绝对的,如用PCR既可检测调控基因,也可检测标记基因和目的基因。
其中较为常见及简便的方法是报告基因检测法,这些基因一般编码一个特殊的酶,这些酶所催化的反应很容易用普通的生化反应检测出来。
而在正常的非转基因植物中,这些酶及其所催化的反应几乎完全不存在。
目前常用的报告基因主要有卡那霉素抗性基因(NPT-Ⅱ),β-葡萄苷酶基因(G us),荧光素酶基因,胭脂碱和章鱼碱合成酶基因,氯霉素乙酰转移酶基因(Cat基因),除草剂抗性基因(Pat),二氢叶酸还原酶基因(DHFR)等。
这些基因由于其检测简单方便,在大多数植物中背景小而得到广泛应用。
本文对这些报告基因的检测原理及方法作一简要介绍。
NPT-Ⅱ基因的检测:抗卡那霉素基因编码新霉素磷酸转移酶Ⅱ(NPT-Ⅱ),是一个小分子量的酶(分子量为25000),它由转座子Tn5编码,催化许多氨基酸糖苷类的磷酸化反应,诸如新霉素、卡那霉素、庆大霉素和G418等。
这个反应将ATP的γ-磷酸基转到抗生素分子上,从而阻止了它们的靶位点———核糖体的相互作用,起到解毒作用。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
操作步骤
载体及目的基因的酶切 酶切产物的纯化
载体与目的基因的连接
感受态细胞制备与转化
载体及目的基因的酶切
载体的酶切： 目的基因的酶切：
质粒(Bluescript) 10×Buffer
BamHⅠ EcoRⅠ ddH2O 总体积
4 µl 2 µl
1 µl 1 µl 12 µl 20 µl
实验四
基因的克隆与重组质粒的转化
实验目的
掌握外源基因与载体连接的原理及方式 理解重组体转化大肠杆菌的条件
了解转化的过程
实验步骤及原理
纯化载体 特定基因与载体连接
重组载体转化大肠杆菌
筛选含重组子的大肠杆菌
载体
外源DAN片段不能在细菌中稳定遗传，随细菌的繁
殖而扩增。须有载体携带进入宿主细胞 专为分子克隆提供的载体特点： 多为环形 含多克隆位点，可选择适当内切酶切开 含抗药基因，可使宿主在含某种抗菌素的培养基 上存活 可在宿主细胞中自我复制，也可随宿主细胞的繁 殖而扩增
实验组
感受态菌液 连接反应液 pBluescript 100μl 5μl
阳性对照组
100μl 1μ l
阴性对照组
100μl
42oC准确水浴90秒，迅速取出，置冰水浴。 各管加入amp+
LB培养液200 μl，混匀，37振荡复
苏45min。
转化（二）
取4皿amp+固体培养基，每皿加入IPTG8μl，
16oC保温4小时或过夜，-20oC冷冻保存
感受态细胞制备（一）
受体菌的活化
取冻存XL1-blue菌株，划线接种于LB(amp-) 固体培养基上，37oC培养过夜。 培养单菌落 用接种棒挑选单菌落接种于50ml LB(amp-) 液体培养基，37oC振荡培养6-8小时
制备感受态菌的最佳时机一般以菌液出现轻度混
PCR纯化产物+ ddH2O至 64 µl 10×Buffer
BamHⅠ EcoRⅠ
8 µl
4 µl 4 µl
80 µl
分别混匀，置37oC保温1.5小时
酶切产物的纯化
混合两组酶切产物，酚/氯仿抽提，乙醇沉
淀，方法见实验三。
载体与目的基因的连接
纯化产物溶于8 µl水中，再加入：
10×T4 DNA连接酶缓冲液 T4 DNA连接酶 总体积 1 µl 1 µl 10 µl
制备感受态细菌
CaCl2
0º C
重组DNA分子进入细胞
筛选含重组子的大肠杆菌
转化细菌的培养
由于质粒携带抗药基因，故获得质粒的细 菌可在抗性培养基上生长，形成单菌落。 重组子单菌落的筛选 获得质粒的细菌均可形成单菌落，故需进 一步鉴定具有外源基因插入的重组子单菌 落，常用方法是蓝白筛选（筛选原理下一 实验详细介绍）。
单酶切产生平端切口
单酶切产生粘末端
双酶切产生粘性末端
重组载体转化大肠杆菌
转化的关键是制备感受态细菌，使受体菌
处于易于吸收和容纳外源 DNA的易感状态。 常用方法是氯化钙冰浴法。 0º C条件下用低 渗CaCl2 溶液处理快速生长的细菌，使细胞 壁疏松，细菌膨胀成球形。 重组 DNA 分子易吸附于感受态细胞表面，短 暂的42º C热处理促进细胞对质粒的吸收。
外源基因与载体连接
外源DNA片段与载体的连接有多种方式，选择不同
酶切，连接方式也不同。 单酶切产生平端切口，与外源DNA片段连接，效率 很低。因Taq酶的特殊活性，PCR产物3‘-末端常有 突出的A。针对此特点，有3‘-末端突出的T载体。 单酶切产生粘末端，连接效率较高，但因载体两 端的粘末端相同，故外源DNA片段的连接没有方向 性，载体本身也容易回连。 双酶切产生粘性末端，连接效率高，且可确定插 入片段的方向。
浊为宜。
感受态细胞制备（二）
3000rpm2悬浮菌体沉淀，置 冰浴中静置30min。 3000rpm离心5min，弃上清。 1ml预冷的0.1M CaCl2悬浮菌体沉淀，置冰 浴中过夜。
转化（一）
取1.5ml离心管3支，按下表操作：
X-gal 40μl，均匀涂布，置37oC恒温箱至 液体消失。 阳性对照与阳性对照各取50μl涂布于抗性 平板。实验组以50μl、100μl分别涂布于 抗性平板。 37oC恒温箱培养过夜。 待有肉眼可见的菌落出现，将实验组培养 皿移至4oC显色，待用。