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同源序列法克隆目的基因
同源序列法克隆目的基因同源序列法克隆是一种常用的基因克隆方法，用于获取目的基因的DNA序列。
同源序列法克隆的主要步骤如下：1. 设计引物：根据已知目的基因的序列，设计一对引物（即寡核苷酸片段），其中一个引物具有与目的基因的5'端相互匹配，另一个引物具有与目的基因的3'端相互匹配。
2. 提取模板DNA：从包含目的基因的源生物体中提取总DNA 或特定组织/细胞中的DNA作为模板。
3. 聚合酶链反应（PCR）扩增：在PCR反应中使用设计的引物和模板DNA来扩增目的基因的DNA序列。
PCR反应通过多次循环加热和冷却来产生大量DNA复制品。
4. 凝胶电泳分析：将PCR扩增产物与分子量标记物一起加载在琼脂糖凝胶上进行电泳分离。
通过比较扩增产物与标记物在凝胶上的迁移距离，可以确定是否成功扩增了目的基因。
5. 纯化目的基因：从PCR反应中纯化目的基因的扩增产物，一般使用凝胶切片、DNA纯化试剂盒等方法。
6. 连接到载体：将纯化的目的基因DNA与适当的载体（如质粒）进行连接。
这通常涉及酶切目的基因和载体的DNA，然后使用连接酶将它们连接在一起。
7. 转化宿主细胞：将连接的DNA导入宿主细胞中，使其自行复制和表达。
这可以通过转染、电穿孔或热激冲等方法实现。
8. 筛选与鉴定：通过对转化后的细胞进行选择性培养或检测，筛选出带有目的基因的克隆。
常用的筛选方法包括抗生素筛选、荧光筛选等。
9. 验证目的基因：最终需要验证克隆中是否成功插入了目的基因。
这可以通过DNA测序、限制性酶切、PCR等方法来进行。
同源序列法克隆是一种有效的基因克隆技术，可用于获得感兴趣的基因序列并进一步研究其功能、表达和调控机制等。
基因克隆与表达
基因克隆与表达基因克隆与表达是生物学领域中重要的技术手段和研究方法。
通过基因克隆和表达，科学家能够研究特定基因的功能、调控机制以及其在生物体内的作用，这对于深入了解生物体的生理过程和疾病发生机制具有重要意义。
本文将介绍基因克隆与表达的原理、方法以及应用。
一、基因克隆基因克隆是将特定基因从一个生物体中分离并复制到另一个载体中的过程。
这个过程主要涉及DNA的分离、复制和连接。
常用的基因克隆技术包括PCR、限制性内切酶切割、琼脂糖凝胶电泳和基因插入等。
1. PCR聚合酶链反应（PCR）是一种强大的基因扩增技术。
它通过不断地重复某一特定区域的DNA序列，使其得以大规模复制。
PCR可以在短时间内合成大量目标DNA片段，为基因克隆提供了充足的材料。
2. 限制性内切酶切割限制性内切酶可以识别并切割特定的DNA序列。
通过选择合适的限制性内切酶，可以实现将目标基因从源DNA中切割下来，为下一步的基因克隆做好准备。
3. 琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳是一种常用的DNA分离技术。
通过将DNA样品加入琼脂糖凝胶槽中，并施加电场，DNA片段会根据其大小在凝胶中迁移。
凝胶电泳可以帮助科学家分离和纯化目标基因。
4. 基因插入基因插入是将目标基因连接到载体上的过程。
载体可以是质粒、病毒或者人工染色体等。
通过连接酶的作用，目标基因与载体可以稳定地结合在一起。
二、基因表达基因表达指特定基因通过转录和翻译过程转化为蛋白质的过程。
从基因克隆到基因表达，可以分为以下几个步骤：转染或转化、筛选和检测。
1. 转染或转化转染是指将外源DNA导入到动物细胞中的过程，而转化是将外源DNA导入到细菌细胞中的过程。
转染和转化可以通过多种方法实现，如化学法、电穿孔法和基因枪法等。
2. 筛选筛选是为了确定是否成功将目标基因表达在宿主细胞中而进行的步骤。
常见的筛选方法包括荧光筛选和克隆筛选。
荧光筛选利用荧光蛋白标记目标基因，观察细胞是否出现荧光信号。
克隆筛选则利用选择性培养基，筛选出含有目标基因的克隆。
克隆突变基因的方法
克隆突变基因的方法
克隆突变基因的方法主要分为以下几个步骤：
1. 基因突变体的诱导：通过物理、化学或生物诱变剂处理靶基因，以产生所需的突变。
这些诱变剂可以包括紫外线、X射线、化学诱变剂等。
2. 突变体的筛选：通过表型筛选或DNA测序，从处理过的基因中找出突变的个体。
表型筛选是通过观察表型变化来挑选突变体，而DNA测序则是直接对基因序列进行分析。
3. 突变基因的克隆：使用PCR（聚合酶链式反应）或基因文库技术，将突变基因从基因组中扩增出来。
这一步需要用到特定的引物或探针，以便准确地识别和扩增目标基因。
4. 克隆的验证：通过DNA测序等技术，对克隆的基因进行验证，确保其与原始突变基因一致。
5. 表达载体构建：将克隆的突变基因插入到表达载体中，以便在宿主细胞中进行表达。
这一步通常涉及到载体DNA和目的DNA的酶切、连接和转化等操作。
6. 表达和功能分析：将构建的表达载体转染到适当的宿主细胞中，进行表达和功能分析。
这一步可以包括对表达产物的检测、对细胞表型的影响等方面的研究。
7. 突变基因的应用：根据研究结果，将突变基因应用于相关的生物工程或医学研究中。
例如，可以用于研究基因功能、开发新药物或改良农作物等。
克隆突变基因的方法涉及多个技术领域，如分子生物学、生物化学和遗传学等。
这些技术的不断发展和改进，使得我们能够更快速、更准确地鉴定和克隆突变基因，为相关研究提供有力支持。
基因克隆常用的方法
3.2 Differential display PCR(DD-PCR) PCR(DDDD-PCR是在AP-PCR基础上发明的一种RTDD-PCR是在AP-PCR基础上发明的一种RTPCR方法,主要用于2 PCR方法,主要用于2种或多种类似生物个体在基因 表达上的差异分析。其基本原理是: 表达上的差异分析。其基本原理是:所有真核生物 的成熟mRNA都含有不同长度的poly+(A)尾部序列, 的成熟mRNA都含有不同长度的poly+(A)尾部序列, 根据poly+(A)内部的2个核苷酸排列的不同, 根据poly+(A)内部的2个核苷酸排列的不同,可以将 所有的mRNA分子分为12类 见图3)。 所有的mRNA分子分为12类(见图3)。
PCR反应模式图： 反应模式图： 反应模式图
Nested PCR反应模式图 反应模式图
根据蛋白质序列也可或cDNA 序列。如蛋白质序列是自己测定的,那么需要设计至少1 序列。如蛋白质序列是自己测定的,那么需要设计至少1对简并引 物(degen做序列测定才能鉴别所扩增产物的特异性。
另外,在基因克隆之后,如还要进一步做表达研究, 另外,在基因克隆之后,如还要进一步做表达研究,所使用的 PCR酶最好不用Taq DNA聚合酶,而采用其他有自我检测(reading PCR酶最好不用Taq DNA聚合酶,而采用其他有自我检测(reading proof)功能的酶, pfu。这样可以避免由于扩增过程中出现的点 proof)功能的酶,如pfu。这样可以避免由于扩增过程中出现的点 突变或终止密码子而导致整个研究结论的错误。
图３真核生物12种mRNA的序列特点
根据这12种mRNA序列可合成12种相应的反转录引物，即 根据这12种mRNA序列可合成12种相应的反转录引物，即 M’N’TTTTTTTT……,用其分别进行反转录,即可将所有mRNA分类合成 M’N’TTTTTTTT……,用其分别进行反转录,即可将所有mRNA分类合成 12种cDNA(于12个试管内)，然后再用随机引物,以这12种cDNA分别做 12种cDNA(于12个试管内)，然后再用随机引物,以这12种cDNA分别做 模板进行PCR扩增(见图1和图4)，那么与表型相关的mRNA就很容易被 模板进行PCR扩增(见图1和图4)，那么与表型相关的mRNA就很容易被 发现并克隆出来。但不论AP-PCR还是DD-PCR,都适用于2 发现并克隆出来。但不论AP-PCR还是DD-PCR,都适用于2种种源近似生 物或不同发育阶段的同一个体之间的比较。因而, PCR的模板必须是 物或不同发育阶段的同一个体之间的比较。因而,其PCR的模板必须是 来自2个生物或同一生物的不同发育阶段的mRNA。DD-PCR的优点是快 来自2个生物或同一生物的不同发育阶段的mRNA。DD-PCR的优点是快 速、方便,可以检测表达量极低的mRNA，但其技术条件要求较高，所 速、方便,可以检测表达量极低的mRNA，但其技术条件要求较高，所 扩增的mRNA的质量不能有差异, mRNA不应降解。目前这一方法已广 扩增的mRNA的质量不能有差异,即mRNA不应降解。目前这一方法已广 泛应用于生物表型相关基因的克隆及比较研究。
基因克隆的几种常见方法
基因克隆得几种常见方法基因（gｅｎe)就是遗传物质得最基本单位,也就是所有生命活动得基础。
不论要揭示某个基因得功能,还就是要改变某个基因得功能,都必须首先将所要研究得基因克隆出来。
特定基因得克隆就是整个基因工程或分子生物学得起点。
本文就基因克隆得几种常用方法介绍如下。
1 根据已知序列克隆基因对已知序列得基因克隆就是基因克隆方法中最为简便得一种。
获取基因序列多从文献中查取，即将别人报道得基因序列直接作为自己克隆得依据。
现在国际上公开发行得杂志一般都不登载整个基因序列,而要求作者在投稿之前将文章中所涉及得基因序列在基因库中注册，拟发表得文章中仅提供该基因在基因库中得注册号(acｃｅssion numｂer）,以便别人参考与查询。
目前，世界上主要得基因库有１）EMBL,为设在欧洲分子生物学实验室得基因库，其网上地址为;（2)Genbank，为设在美国国家卫生研究院(ＮIＨ）得基因库，其网上地址为;（3)Swｉssport与TＲEMBＬ,Swissport就是一蛋白质序列库,其所含序列得准确度比较高,而TREMBＬ只含有从EＭBＬ库中翻译过来得序列。
目前,以Geｎbａnk得应用最频繁。
这些基因库就是相互联系得,在Genbank注册得基因序列,也可能在Swisspoｒt注册。
要克隆某个基因可首先通过Inｔeｒnet查询一下该基因或相关基因就是否已经在基因库中注存。
查询所有基因文库都就是免费得,因而极易将所感兴趣得基因从库中拿出来,根据整个基因序列设计特异得引物，通过PＣＲ从基因组中克隆该基因,也可以通过RＴ-PCＲ克隆cＤNA。
值得注意得就是,由于物种与分离株之间得差异,为了保证PＣR扩增得准确性,有必要采用两步扩增法,即neｓted PCR。
根据蛋白质序列也可以将编码该蛋白质得基因扩增出来。
在基因文库中注册得蛋白质序列都可以找到相应得ＤNA或cDNＡ序列。
如蛋白质序列就是自己测定得，那么需要设计至少１对简并引物(dｅgｅneｒated ｐrimeｒ),从cDNA文库中克隆该基因。
植物基因克隆的方法
阳性克些候选基因，再进行别离，时空表达
特点，同源性比较等分析确定目的基因。
1. 序列克隆 利用目标基因的近等基因系或别离群体分组分析法〔BSA〕进行连锁分析，筛选目标基因所在局部区域的分子标记。
4、目的区域的精细作图 的标记和通过转座子在染色体上
植物基因克隆的方法
基因：为RNA或蛋白质编码的核苷酸序 列。
基因克隆：利用体外重组技术，将特定 基因
体中。
和其它DNA顺序插入到载
克隆目标：识别、别离特异基因并获得 基因
的完整全序列，确定染色
植物基因克隆的方法
能的mRNA序列,据此合成寡核苷酸探针从文
抑制性扣除杂交〔suppression subtractive
人工合成并克隆基因
方法：根据的氨基酸或核苷酸序列，采 用植物偏爱的密码子，人工合成并
克 隆该基因。〔可对基因进行改造〕
例子：根据蜘蛛毒素的氨基酸序列，人பைடு நூலகம் 合
成并克隆了此肽的基因。
表 型 克 隆〔phonetypical cloning〕
方法：利用植物的表型差异或组织器官特 异 表达产生的差异来克隆植物基因。此方法 试图把表型与基因结构或基因表达联系起 来，从而别离特定表型相关基因。不必事 先知道基因的生化功能或图谱定位，根据 基因的表达效应就直接别离该基因。
3、构建目的基因区域跨叠克隆〔contig〕
测所测序列或氨基酸序列与序列是否同 定位克隆的优点和局限性
通过转座子上的标记基因〔如抗药性等〕就可以检测出突变基因的位置和克隆出突变基因来。
源→发 不必事先知道基因的生化功能或图谱定位，根据基因的表达效应就直接别离
方法二: 利用Velculescu等建立的基因 表达
基因克隆方法
基因克隆方法一、P CR二、胶回收（Omega E.Z.N.A. Gel Extraction Kit）1、PCR电泳产物，打开水浴锅，待电泳跑好切胶；2、将切好的胶放入1.5ml离心管中，称重，按照1g/ml加入Binding Buffer（XP2）（1.5ml离心管约重0.8g），于55～60℃水浴融化，轻微摇动待完全溶解；spin down；3、将溶液移至吸附柱中，于10000rpm离心1min；4、重复3，提高回收率；5、弃去收集管中液体，在吸附柱中加入300μl的Binding Buffer（XP2），10,000rpm离心1min；6、弃去收集管中液体，在吸附柱中加入700μl的SPW wash Buffer （注意加过酒精的）10，000rpm离心1min；7、重复6；8、12，000rpm空离2min，（此时将Elution Buffer或者去离子水放置于水浴锅中温热），弃去收集管中液体；9、将吸附柱放入新的离心管中，室温放置1～2min，然后加入30～50μl的Elution Bufferor去离子水于吸收管中，静至1～2min，12，000rpm离心1min，可以用洗脱液再洗一次柱子；10、电泳检测回收质量，测浓度。
三、连接（pMD18-T Vector）1）在PCR管中加入如下试剂1)16℃ overnight (around 16h in PCR machine) 16℃一夜之间(约16 h在PCR机器)2)Next day quick spin tubes and put on ice and store at -4℃ refrigerator第二天快速旋转管和搁置在4℃冰箱和存储四、转化转化前将水浴锅水温调至42℃。
1、取大肠杆菌感受态DH5α于冰浴中，分装每管50μl，置于冰上，加入5μl连接产物（连接液的体积不超过感受态的1/10），充分混匀；2、冰浴30min，将离心管置于42℃水浴中温育90sec，快速放入冰浴中，冷却2～3min（别摇动离心管！）3、每管加500～600μl LB液体培养基（不含抗生素），混匀后于37℃摇床震荡培养60min（转速在150～220rpm均可）4、准备LB+Amp（50 mg/ml，100 ml培养基加100 μl）的平板，烧好涂布棒；5、取100～300μl的转化菌液涂布在LB+Amp的平板的平板上，于37℃培养12～16h。
(完整版)基因克隆步骤完整版
1总RNA提取(1) 液氮研磨或冰上匀浆实验材料；先将1ml Trizol加到离心管中待用(2) 将研磨好的样品加到离心管中混匀，室温放置5 min；打开离心机预冷(3) 加200 µL氯仿，振荡15 sec，室温放置3 min，分层；(4) 4o C，12,000g，离心15 min；(5) 取上清，加500 μL异丙醇，混匀，室温放置10 min；(6) 4o C，12,000g，离心10 min；(7) 弃上清，加1 mL75%乙醇，漂浮洗涤沉淀，振荡充分；再用100%乙醇清洗(8) 4o C，7,500g，离心5 min；(9) 弃上清，离心，用枪吸取多余液体，放在超净台里干燥后，加50 μL DEPC 水，－80o C保存。
此操作中所用到的器皿均需经过DEPC灭活RNA酶处理。
提取的总RNA 需经RNA电泳检测质量，并用紫外分光光度计测定浓度。
OD260值为核酸的吸收值，OD280值为蛋白的吸收值，OD260/280值在1.8-2.0间一般说明该核酸蛋白含量在允许的范围内，可正常使用；此外还有OD230值为多糖和酚类的吸收值，比较干净的核酸OD260/230值能达到2.2左右。
RNA浓度计算公式：总RNA 浓度（µg/mL）=A260×稀释倍数×40。
2反转录/cDNA第一链的合成纯化RNA以去除基因组DNA，操作按TaKaRa公司的PrimeScript RT reagent with gDNA Eraser(Perfect Real Time)说明书进行。
其体系为：Total RNA1μg5× gDNA Eraser Buffer2μLgDNA Eraser1μLRNase Free dH2O补齐至10μL 条件为：42o C，2min；RNA纯化后，即可进行反转录。
其体系为：5×PrimeScript Buffer 2（for Real Time）4μLPrimeScript RT enzyme mix Ⅰ1μLRT Primer Mix 1μL上一步的反应液10μLRNase Free dH2O补齐至20μL 操作条件为：(1) 37o C放置15 min；(2) 85o C，5 sec；(3) 4o C保存。