山羊基因克隆实验方案设计
《山羊、牛MyoG启动子序列克隆及其活性分析》范文
《山羊、牛MyoG启动子序列克隆及其活性分析》篇一一、引言随着生物学领域的研究深入，启动子序列在基因表达调控中扮演着重要的角色。
MyoG（Myogenin）是肌肉发育和生长的关键调控因子，其启动子序列的研究对于理解肌肉生长和发育机制具有重要意义。
本文旨在克隆山羊和牛的MyoG启动子序列，并对其活性进行分析，为后续的基因表达和肌肉生物学研究提供基础数据。
二、材料与方法1. 材料准备本实验所需的山羊和牛的肌肉组织样本、酶切工具、载体等实验材料均来自可靠渠道，且在实验前进行了充分的检验与鉴定。
2. 实验方法（1）启动子序列克隆：采用PCR技术，以肌肉组织DNA为模板，设计特异性引物扩增MyoG启动子序列。
（2）序列分析：对扩增得到的启动子序列进行测序，并利用生物信息学软件进行序列比对和分析。
（3）活性分析：构建含有山羊和牛MyoG启动子序列的报告基因载体，通过细胞转染和荧光素酶活性检测等方法，分析其转录活性。
三、实验结果1. 启动子序列克隆结果通过PCR技术成功扩增出山羊和牛的MyoG启动子序列，测序结果显示序列完整，无突变或缺失。
与已公布的序列进行比对，发现高度相似性。
2. 序列分析结果对克隆得到的启动子序列进行生物信息学分析，发现其包含多个潜在的转录因子结合位点，这些位点可能与肌肉发育和生长相关。
此外，还发现山羊和牛的MyoG启动子序列在某些区域存在差异，这可能与其物种特异性的肌肉生长和发育机制有关。
3. 活性分析结果将含有山羊和牛MyoG启动子序列的报告基因载体转染至细胞中，通过荧光素酶活性检测发现，这两个启动子均具有较高的转录活性。
进一步比较发现，牛MyoG启动子的转录活性略高于山羊MyoG启动子。
这可能与牛和山羊的肌肉生长和发育特性有关。
四、讨论本研究成功克隆了山羊和牛的MyoG启动子序列，并对其进行了活性分析。
实验结果表明，这两个启动子均具有较高的转录活性，且存在物种间的差异。
这些差异可能与不同物种的肌肉生长和发育机制有关。
《绒山羊和绵羊Izumo1和CD9基因的克隆及其相互作用的初步研究》范文
《绒山羊和绵羊Izumo1和CD9基因的克隆及其相互作用的初步研究》篇一一、引言近年来，随着生物科技和遗传学的快速发展，对于不同动物品种间基因的克隆与相互关系的研究成为了科学界的研究热点。
特别是绒山羊和绵羊，这两种常见的家畜在生产生活中有着举足轻重的地位。
Izumo1和CD9作为重要的基因分子，它们在绒山羊和绵羊中的表达、功能以及相互关系尚未被充分理解。
本研究的目的是初步探讨这两个基因的克隆及相互作用机制，为家畜育种及畜牧产业发展提供理论基础。
二、材料与方法1. 材料本实验选取了健康的绒山羊和绵羊作为实验对象，并从其体内提取了相应的组织样本。
同时，我们还准备了PCR仪、电泳仪、显微镜等实验设备以及相关的试剂。
2. 方法（1）基因克隆：通过PCR技术从提取的组织样本中扩增Izumo1和CD9基因片段，并将它们连接到适当的载体中。
（2）载体构建：利用DNA克隆技术，构建包含目标基因的重组载体。
（3）基因表达分析：通过实时荧光定量PCR和Western Blot 等方法，分析Izumo1和CD9基因在绒山羊和绵羊中的表达情况。
（4）相互作用研究：利用生物信息学方法，对Izumo1和CD9基因的相互作用进行初步研究。
三、实验结果1. 基因克隆与载体构建成功克隆了Izumo1和CD9基因，并成功构建了相应的重组载体。
通过测序验证，所克隆的基因序列与预期的序列完全一致。
2. 基因表达分析实时荧光定量PCR和Western Blot结果显示，Izumo1和CD9基因在绒山羊和绵羊中的表达水平存在差异。
具体来说，Izumo1在绒山羊中的表达量高于绵羊，而CD9在绵羊中的表达量较高。
3. 相互作用研究通过生物信息学方法对Izumo1和CD9基因的相互作用进行初步研究，发现它们之间可能存在一定的相互作用关系。
为了进一步验证这一发现，后续需要开展更多的实验研究。
四、讨论本研究初步探讨了Izumo1和CD9基因在绒山羊和绵羊中的克隆及相互作用机制。
山羊KAP8.2基因的克隆表达及分析
参考 文献 ： ［］ ． 卡尔尼克 ． １Ｂ Ｗ． 禽病学 ．０版 ． 京 ： Ｍ］ １ 北 中国农业 出版社 ，９９ １９ ：
８ ７—８ ７． ５ ６
［ ］ｊ ｕｕＳ Ｋ ｇＸ．ｈｒｃ ｒａｉ ｏ ｔ ｎｓ ｎｏｉｇｕ ２ ， Ｋａｄ ３ Ｉ Ｈ， ， ｏ ｎ Ｃ ａａｔ ｚ ｏ ｆ ｈ ｇ ｅ ｃｄｎ Ｌ ４ Ｔ ｅ ｔ ｉ ｎ ｅｅ ｅ ｎ ｇ ｒｅ ｓｆ ｍ ｄｃ ｎｅｔ ｉ ｓ（ Ｅ ） ｒｏ ｒ ｅｃ ｓｉｃｔ Ｈ ｐｏ ｉ ｏ ｕｋｅｔｉｓｖ ｔｎ ｒ ｒｉ ｒ Ｄ Ｖ ：ａｐｏｆｏ ｌ ｓ ａｏ ｏ ｅ ｆ ｔ ａ ｆ ｉ ｆ ｈ ｉ ｎ
【 ］ｅｅＡ ａｄＦｋｓ ． ｐｏｅ ａｅ ａｃ ｅ ｆ ￣ｔｏ ｐｔ ｅｉ ｎ ９ Ｓａ ． ｎ ｉ ｙ Ｅ ｉｐ —ｂｓ ｖｃｉ ： ｌｕ ｅ ｅｉｐ ｄ — ｅ Ｊ ｔ ｄ ｎ ｉ ｒ ｎ ｌ ｏ ｅ
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《2024年绒山羊和绵羊Izumo1和CD9基因的克隆及其相互作用的初步研究》范文
《绒山羊和绵羊Izumo1和CD9基因的克隆及其相互作用的初步研究》篇一一、引言随着现代生物技术的飞速发展，基因克隆技术已成为研究动物遗传学和生物学特性的重要手段。
绒山羊和绵羊作为两种重要的家畜动物，其生长、繁殖以及生理特性的研究对于畜牧业的发展具有重要意义。
Izumo1和CD9基因作为两种在动物体内发挥重要功能的基因，其表达和功能在绒山羊和绵羊中具有一定的差异。
本文将重点研究这两种基因的克隆及其相互作用的初步结果。
二、实验材料与方法1. 实验材料本实验所需材料包括绒山羊和绵羊的组织样本，实验中所用的PCR引物，酶及缓冲液等试剂均为市售产品。
2. 实验方法(1) 基因克隆：通过PCR技术扩增Izumo1和CD9基因，将PCR产物进行纯化、酶切、连接等操作，最终构建出重组质粒。
(2) 相互作用研究：采用双荧光素酶报告系统等方法，研究Izumo1和CD9基因在细胞中的相互作用。
三、实验结果1. Izumo1和CD9基因的克隆通过PCR扩增和基因克隆技术，成功克隆出Izumo1和CD9基因，经测序验证，证实了克隆的准确性。
2. 相互作用研究通过双荧光素酶报告系统等实验方法，发现Izumo1和CD9基因在细胞中存在相互作用。
进一步的研究表明，这种相互作用可能涉及到两种基因的表达调控，以及在细胞信号传导过程中的作用。
四、讨论1. Izumo1和CD9基因的克隆成功为进一步研究这两种基因的功能和表达调控机制提供了基础。
2. 通过双荧光素酶报告系统等实验方法，我们发现Izumo1和CD9基因在细胞中存在相互作用，这可能涉及到两种基因在生理和病理过程中的作用。
未来的研究可以进一步探讨这种相互作用的机制和功能。
3. 绒山羊和绵羊作为两种不同的家畜动物，其Izumo1和CD9基因的表达和功能可能存在一定的差异。
未来的研究可以比较这两种动物中这两种基因的表达差异，以及其在生长、繁殖等生理特性中的作用。
五、结论本文通过基因克隆技术和双荧光素酶报告系统等方法，初步研究了绒山羊和绵羊中Izumo1和CD9基因的克隆及其相互作用的机制。
山羊CLAⅠα链基因的克隆及生物信息学分析
集 中在 ａ １区 域 （ ２ ２ 一ｌ １ ｏ位 氨 基 酸 ） 与ａ ２区 域 （ １ １ １ —２ ｏ ３ 位 氨基 酸 ） 。遗 传 进 化 分 析 表 明 ， Ｇ ｅ ｎ Ｂ ａ ｎ ｋ中 山 羊 Ｃ Ｌ Ａ Ｉ ａ 链 基 因 与 红 寺 湖 绒 山羊 、 河西绒山羊 、 陕北 绒 山 羊 、 阿 尔 巴斯 绒 山羊 的 Ｃ Ｌ ＡＩ ａ 基 因遗 传 关 系 较 近 ， 与 其 他 ６个 品
系山羊 ， 即简阳大耳山羊 、 金 堂黑山羊 、 西 农 萨 能奶 山 羊 、 美姑 山羊 、 大足 黑山羊 、 努 比 亚 山羊 的 Ｃ Ｌ Ａ Ｉ ａ基 因 遗 传 关 系 较 远 。本 试 验 结 果 为 进 一 步 研 究 Ｃ Ｌ Ａ Ｉ 链 基 因 的 多 态 性 奠 定 了理 论 基 础 。 关 键 词 ：山 羊 ； Ｃ Ｌ Ａ Ｉ ａ 链基 因； 克隆 ； 生 物 信 息 分 析 中 图分 类 号 ： ￥ ８ ５ ２ ． ６ ５ 文献标识码 ： Ａ 文 章 编 号 ：１ ６ ７ １ — ７ ２ ３ ６ （ ２ ０ １ ７ ） ０ ７ — ２ ０ ６ ５ — ０ ６
Ｖ ｅ ｔ ｅ ｒ ｉ ｎ ａ ｒ ｙ Ｅ ｔ ｉ ｏ ｌ ｏ ｇ ｉ ｃ ａ ｌ Ｂｉ ｏ ｌ ｏ ｇ ｙ，Ｌ ａ ｎ ｚ ｈ ｏ ｕ Ｖ ｅ ｔ ｅ ｒ ｉ ａｒ ｎ ｙ Ｒｅ ｓ ｅ ａ ｒ ｃ ｈ Ｉ ｎ ｓ ｔ ｉ ｔ ｕ ｔ ｅ ，Ｃ ｈ ｉ ｎ ｅ ｓ ｅ Ａｃ ａ ｄ ｅ ｍｙ ｏ ｆ
Ｃ Ｌ Ａ Ｉ ｎ 链 基因长度为 １ ０ ７ ４ ｂ ｐ ， 编码 ３ ５ ７个 氨 基 酸 。经 核 苷 酸 序 列 分 析发 现 ， １ Ｏ个 品 系 山 羊 Ｃ Ｌ Ａ Ｉ ａ 链 基 因 同 源 性 集 中在 ８ ２ ． ８ ～９ ９ ． ５ Ａ ｏ之 间 。将 １ Ｏ个 品 系 山羊 Ｃ Ｌ Ａ Ｉ 链 基 因 核 苷 酸 推 导 的 氨 基 酸 序 列 进 行 比对 ， 发 现 突 变
《绒山羊和绵羊Izumo1和CD9基因的克隆及其相互作用的初步研究》范文
《绒山羊和绵羊Izumo1和CD9基因的克隆及其相互作用的初步研究》篇一一、引言随着生物科技的发展，基因克隆技术为研究不同物种间的遗传差异及基因相互作用提供了强有力的工具。
本篇论文着重对绒山羊和绵羊两种家畜动物中Izumo1和CD9基因的克隆以及其相互作用进行初步探讨和研究。
这有助于理解家畜的遗传特性，为家畜的遗传育种和疾病防治提供理论依据。
二、材料与方法1. 实验材料本实验选取了绒山羊和绵羊作为研究对象，以实验室自繁种畜的生殖组织作为主要材料，利用PCR技术克隆出Izumo1和CD9基因的特定片段。
2. 方法(1) 通过PCR技术，从绒山羊和绵羊的生殖组织中提取Izumo1和CD9基因的DNA序列；(2) 利用生物信息学方法对克隆出的基因序列进行初步分析；(3) 构建基因表达载体，研究基因在两种家畜中的表达情况；(4) 通过生物实验手段，分析Izumo1和CD9基因在家畜中的相互作用。
三、结果与分析1. 基因克隆结果通过PCR技术成功克隆出绒山羊和绵羊的Izumo1和CD9基因的特定片段，经测序验证，序列正确无误。
2. 生物信息学分析对克隆出的基因序列进行初步分析，发现绒山羊和绵羊的Izumo1和CD9基因在序列上存在一定差异，这可能与两种家畜的遗传特性和生理特性有关。
3. 基因表达情况构建基因表达载体后，发现Izumo1和CD9基因在绒山羊和绵羊中的表达情况存在差异，这可能与两种家畜的生长、发育、繁殖等生理过程有关。
4. 基因相互作用分析通过生物实验手段，初步发现Izumo1和CD9基因在家畜中存在相互作用。
这种相互作用可能影响家畜的生殖、生长、免疫等生理过程。
具体作用机制需进一步研究。
四、讨论本实验成功克隆了绒山羊和绵羊的Izumo1和CD9基因，并对其进行了初步分析。
结果表明，这两种基因在两种家畜中存在差异，且存在相互作用。
这些差异和相互作用可能与家畜的遗传特性和生理特性有关。
这为进一步研究家畜的遗传育种、疾病防治等提供了理论依据。
《绒山羊和绵羊Izumo1和CD9基因的克隆及其相互作用的初步研究》范文
《绒山羊和绵羊Izumo1和CD9基因的克隆及其相互作用的初步研究》篇一一、引言随着生物科技的发展，基因克隆技术为研究不同物种间的遗传差异及基因相互作用提供了强有力的工具。
本篇论文将着重探讨绒山羊和绵羊的Izumo1和CD9基因的克隆及其相互作用的初步研究。
Izumo1和CD9基因在细胞黏附、信号传导及免疫应答等生物学过程中扮演着重要角色。
通过研究这两种基因在绒山羊和绵羊中的表达差异及其相互作用，有助于我们更深入地理解这两种基因在动物生理和疾病发生中的作用机制。
二、材料与方法2.1 实验材料本实验所使用的绒山羊和绵羊样本均来自本地养殖场，实验前已获得养殖场主的同意。
实验所需试剂、耗材等均采购自正规渠道。
2.2 方法（1）基因克隆：采用PCR技术，分别从绒山羊和绵羊的基因组DNA中扩增出Izumo1和CD9基因的编码区序列。
（2）序列分析：将扩增出的基因序列进行测序，并进行序列比对分析。
（3）相互作用研究：通过生物信息学方法，预测两种基因在蛋白质水平上的相互作用，并进一步通过细胞实验验证其相互作用。
三、实验结果3.1 基因克隆结果成功从绒山羊和绵羊的基因组DNA中扩增出Izumo1和CD9基因的编码区序列，经测序验证，序列正确。
3.2 序列比对分析通过序列比对分析，发现绒山羊和绵羊的Izumo1和CD9基因在编码区存在一定程度的序列差异，这可能与两种动物在生理和疾病发生过程中的差异有关。
3.3 相互作用研究通过生物信息学方法预测，Izumo1和CD9蛋白在蛋白质水平上可能存在相互作用。
进一步通过细胞实验验证，证实了这两种蛋白之间的相互作用。
四、讨论4.1 基因克隆与序列分析本实验成功克隆了绒山羊和绵羊的Izumo1和CD9基因，并进行了序列比对分析。
结果表明，这两种基因在编码区存在一定程度的序列差异，这可能与两种动物在生理和疾病发生过程中的差异有关。
这为进一步研究这两种基因在动物生理和疾病发生中的作用机制提供了基础。
《绒山羊和绵羊Izumo1和CD9基因的克隆及其相互作用的初步研究》范文
《绒山羊和绵羊Izumo1和CD9基因的克隆及其相互作用的初步研究》篇一一、引言近年来，绒山羊和绵羊的基因研究成为了生物学和畜牧业的热点话题。
随着分子生物学技术的进步，我们对这些动物的基因表达和调控机制有了更深入的理解。
在众多重要的基因中，Izumo1和CD9是两种重要的细胞膜相关基因，其在动物的生长发育以及生理活动中具有重要功能。
本文将对绒山羊和绵羊中这两种基因的克隆及初步的相互作用研究进行探讨。
二、Izumo1和CD9基因的克隆首先，我们使用PCR技术对绒山羊和绵羊的Izumo1和CD9基因进行了克隆。
这一步的关键在于设计合适的引物，确保能够准确地扩增出目标基因序列。
我们通过生物信息学软件预测了引物的特异性，并进行了PCR实验。
经过多轮的PCR反应和纯化，我们成功获得了这两种基因的克隆序列。
三、基因序列分析我们使用生物分析软件对克隆得到的基因序列进行了分析。
结果表明，绒山羊和绵羊的Izumo1和CD9基因在序列上存在一定程度的差异，这可能与其生物学特性和功能有关。
通过比对分析，我们进一步了解了这两种基因在绒山羊和绵羊中的保守性和特异性。
四、基因相互作用研究为了研究Izumo1和CD9基因之间的相互作用，我们构建了这两种基因的过表达和干扰载体，并进行了细胞共转染实验。
通过观察细胞的变化，我们发现当这两种基因共表达时，它们之间存在明显的相互作用。
进一步的研究表明，这种相互作用可能涉及到细胞的信号传导和生长调控等过程。
五、讨论与展望通过对绒山羊和绵羊的Izumo1和CD9基因的克隆及其相互作用的初步研究，我们得到了许多有价值的发现。
这些发现不仅有助于我们理解这两种基因在动物生长发育和生理活动中的作用，还为进一步研究其与其他基因的相互作用提供了基础。
然而，仍有许多问题需要进一步探讨。
例如，这两种基因在绒山羊和绵羊中的具体功能是什么？它们之间的相互作用是如何影响细胞的功能的？这些问题需要我们进行更深入的研究。
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山羊基因克隆实验方案设计第五组1.提取DNA2.DNA检测（电泳）3.目的DNA片段基因扩增（PCR）4.DNA检测（电泳）5.目的基因片段与载体连接6.大肠杆菌感受态细胞的制备7.导入受体细胞与蓝白斑筛选8.阳性克隆鉴定9.DNA测序一、DNA提取【实验目的】指导DNA提取原理（羔羊片），熟悉DNA提取步骤。
【实验原理】组织细胞被PK消化后，经过萃取漂洗获得纯净DNA。
【实验步骤】1. ＜30 mg组织，用眼科剪剪碎，加入200 TL buffer＋20 μL PK，55℃水浴1-3 h。
2. 加入220 μL buffer BL，振荡15 s，70 ℃放置10 min，溶液变清亮。
3. 10000 r离心2 min，移上清液至新离心管。
4. 加220 μL无水乙醇，充分振荡15 s，可能会出现絮状沉淀。
5. 将溶液和絮状物加入到吸附柱中，12000 r离心30 s，弃废液。
6. 向吸附柱加入500 μL WB，12000 r离心30 s，弃废液。
7. 向吸附柱加入500 μL wash buffer，12000 r 离心30 s，弃废液，空滤一次。
8. 将吸附柱转入干净离心管，加入50 μL TE，放置5 min，12000 r离心2 min，备检。
二、DNA电泳检测【实验原理】琼脂糖凝胶电泳技术是分离、鉴定和提纯DNA片断的有效方法。
凝胶分辨率决定于使用材料的浓度，并由此决定凝胶的孔径。
琼脂糖凝胶可分辩0.1~6.0kb的双链DNA片段。
琼脂糖凝胶电泳是一个电场作用。
它首先利用琼脂糖的分子筛效应，此外，在弱碱性条件下，DNA分子带负电荷，从负极向正极移动。
根据DNA分子大小、结构及所带电荷的不同，它们以不同的速率通过介质运动而相互分离。
借助溴化乙锭（EB）能与双链DNA结合的作用，利用EB染色，并通过紫外线激发即可观察被分离DNA片段的位置。
【仪器与试剂】琼脂糖、10×TAE电泳缓冲液（40mMTris，20mMNaAc，1mMEDTAPH8.0）、载体缓冲液（0.25%溴酚蓝，30%甘油）、溴化乙锭水溶液（10mg/ml）、凝胶槽、电泳仪【实验步骤】1．取琼脂糖0.9g，加入100ml1xTAE电泳缓冲液于250ml烧瓶中，100℃加热溶解。
2．平衡凝胶槽，放好两侧挡板，调节好梳子与底板的距离（一般高出底板0.5~1mm）。
3．铺板：在溶解好的凝胶中加入终浓度为0.5ug/ml的溴化乙锭水溶液，轻轻混匀，待冷至50℃左右倒入凝胶槽，胶厚一般为5~8mm。
4．待胶彻底凝固后，去掉两侧挡板，将凝胶放入盛有电泳液的槽中（加样孔朝向负极端，DNA由负极向正极移动），使液面高出凝胶2~3mm，小心拔出梳子。
5．DNA样品与载体缓冲液5：1混合并加入凹孔中（样品不可溢出）。
6．打开电源，调节所需电压，电压与凝胶的长度有关，一般使用电压不超过5v/cm。
7．据指示染料移动的位置，确定电泳是否终止（溴酚蓝的涌动距离在5sRNA和0.3kbDNA 带之间）。
8．电泳完毕关闭电源。
将凝胶放紫外灯下观察并拍照。
三、目的DNA片段基因扩增（PCR）方案1：遗传学实验31，PCR扩增基因片段方案2：【实验目的】了解多聚合酶链反应DNA 扩增技术的基本原理和实验应用，掌握PCR反应基本技术。
【实验原理】PCR（Polymerase Chain Reaction）即聚合酶链式反应是1986 年由Kallis Mullis 发现。
这项技术已广泛地应用于分子生物学各个领域，它不仅可用于基因分离克隆和核酸序列分析，还可用于突变体和重组体的构建，基因表达调控的研究，基因多态性的分析，遗传病和传染病诊断，肿瘤机制探查，法医鉴定等方面。
PCR技术已成为方法学上的一次革命，它必将大大推动分子生物学各学科的研究发展。
PCR是一种利用两种与相反链杂交并附着于靶DNA两侧的寡核苷酸引物经酶促合成特异的DNA 片段的体外方法，由高温变性，低温退火和适温延伸等几步反应组成一个循环，然后反复进行，使目的的DNA 得以迅速扩增，主要过程如图6。
置待扩增DNA 于高温下解链成为单链DNA 模板；人工合成的两个寡核苷酸引物在低温条件下分别与目的片段两侧的两条链互补结合；DNA聚合酶在72℃将单核苷酸从引物3'端开始掺入，沿模板5'—3'方向延伸，合成DNA 新链。
由于每一循环所产生的DNA均能成为下一次循环的模板，所以PCR 产物以指数方式增加，经25—30次周期之后，理论上可增加109倍，实际上可增加107倍。
PCR 技术具有操作简便、省时、灵敏度高特异性强和对原始材料质量要求低等优点，但由于所用的TaqDNA 聚合酶缺乏5'—3'核酶外切酶活性，不能纠正反应中发生的错误核苷酸掺入，估计每9000个核苷酸会导致一个掺入错误，不过Innis M·A 发现，错误掺入的碱基有终止链延伸的作用倾向，使得错误不会扩大。
图3-1 PCR原理示意图PCR 技术应用广泛，不可能有这样一套条件满足所有的实验，但本实验所介绍的方法可适应于大多数DNA 扩增反应，即使有的不适应，至少也确定了一个共同的起点，在此基础上可以作多种变化。
不过下列因素在实验应用时应予以特别注意，以求取得满意结果。
1、模板：单、双链DNA 和RNA都可以作为PCR样品，若起始材料是RNA，须先通过逆转录得取第一条cDNA。
虽然PCR 可以仅用极微量的样品，但为了保证反应的特异性，一般宜用ng 量级的克隆DNA，ug 级的染色体DNA，待扩增样品质量要求较低，但不能混合有任何蛋白酶、核酸酶，Taq DNA聚合酶的抑制剂以及能结合DNA 的蛋白质。
2、引物：引物是决定PCR 结果的关键，下列原则有助于引物的合理设计。
（1）尽可能选择碱基随机分布，GC 含量类似于被扩增片段的引物，尽量避免具有多聚嘌呤、多聚嘧啶或其它异常序列的引物。
（2）避免具有明显二级结构（尤其是在引物3'—末端）的序列。
（3）防止引物间的互补，特别要注意避免具有3'末端重叠的序列。
（4）引物的长度约为20个碱基，较长引物较好，但成本增加，短引物则特异性降低。
（5）引物浓度不宜偏高，过高易形成二聚体，而且扩增微量靶目标或起始材料是粗制品，容易产生非特异产物。
3、缓冲液：PCR缓冲液的变化通常会影响扩增结果，特别是MgCl2，其浓度对专一性和扩增量有重大影响，通常最适浓度为1.5mM左右（每种dNTP 的浓度为0.2mM时），浓度过高，使反应特异性降低；浓度过低，使产物产量降低。
四种dNTP 浓度通常每种都是0.05mM—0.2mM。
过高的浓度会导致错误掺入，浓度过低，则影响反应产物的产量。
四种dNTP浓度应大体相同，其中一种若偏高，会诱发错误掺入，降低合成速度，过早终止延伸反应。
另外dNTP 能与Mg 2+结合，使游离Mg2+浓度降低，所以如果dNTP 的浓度有很大改变，MgCl2浓度也要改变。
Taq聚合酶是一种耐高温聚合酶，用量通常是1—4 单位/100ul，浓度过高，产生过多的非特异片段。
4、循环参数：PCR 循环是把起始材料加热到90—95℃，保持短时间使双链DNA 解链；然后冷却至37—55℃，使引物与模板退火；再升温至70—75℃，在TaqDNA聚合酶的作用下掺入单核苷酸，使引物沿模板延伸。
解链不完全是导致PCR 失败的最主要原因。
用DNA 扩增仪时，94℃保持1 min可使模板的起始物完全变性。
若用低于94℃的条件，则应适当延长时间。
引物与模板退火温度由引物的长度及G+C含量决定。
适时间退火（1—2）min 有利于产物的特异性。
引物延伸在70—75℃保温的时间可根据扩增DNA片段的长短来调节。
正常情况下，每min可延伸1Kb 的长度，常规PCR 一般为25—40 个循环，若循环加长，则由于酶活性降低，聚合时间延长，引物及单核苷酸减少等原因，反应后期容易产生错误掺入，所以在满足产物得率前提下，应尽量减少周期次数。
【仪器与试剂】（一）仪器与器皿PRC 扩增仪（PE2400），琼脂糖凝胶电泳设备，微量取样器，一次性指形管，凝胶成像仪,玻片（二）试剂与材料琼脂糖凝胶电泳试剂：1）电泳缓冲液：Tris—乙酸0.04mol/L PH8.0 0.002mol/L EDTA；2）加样缓冲液：0.25%溴酚兰40% w/v蔗糖；3）溴化乙锭溶液：0.05mg/ml溴化乙锭/水；4）琼脂糖、TaqDNA 多聚酶、5′反应缓冲液：125mmol/L Tris-HCl pH8.2；10mmol/L MgCl2；0.5mg/ml gelatin；125mmol/L(NH4)2SO4；Formamide 25%、混合dNTP 液(dATP dGTP dTTP dCTP各2mmol/L)、DNA 模板（每2′ml 中含有10fg 待扩增DNA）、引物1 （25 pmol/L），5’加入EcoRI 粘性末端碱基、引物2 （25 pmol/L），5’加入HindIII 粘性末端碱基、无菌水【实验步骤】1. 按顺序在200ml 指形管中加入以下试剂与样品。
（因购入的试剂批次不同，加样时有所差别，以预实验结果为准。
总体积共100ml，也可以配成40ml 的反应体系）表3-1 PCR所用试剂样品及其用量试剂及样品用量/mLddH2O7410′Buffer10 MgCl2（10′Buffer 如已加入MgCl2，则不必加）6dNTP 2引物1 2引物2 2模板 2Taq DNA聚合酶 22. 在PCR 扩增仪上按表3-2反应条件编入程序（以下为参考值，因扩增的DNA片段不同，各类PCR 扩增仪程序设定各不相同，编程过程视扩增的DNA 片段的要求及仪器而定）。
表3-2 PCR反应参数条件循环条件（30次）预变性变性复性延伸温度94 ℃94 ℃55 ℃55 ℃时间 2 min 40 s 35 s 2 min 10 s 3．延长延伸72 ℃7 min编完反应程序，置反应管于PCR扩增仪的反应孔中，开动机器，扩增循环反应开始。
4. PCR 扩增完毕，配2%琼脂糖凝胶，取15ml 反应液及相适应的PCR mark 分别点样，加样缓冲液应为40%W/V 蔗糖，电泳观察结果。
5. 凝胶成像仪或紫外灯下观察实验结果，是否已扩增到实验设计的DNA 片段。
四、DNA电泳检测（具体方案见实验2）五、目的基因片段与载体连接【实验原理】克隆载体（T载体）：重组的DNA分子是在DNA连接酶的作用下，有Mg2+ 、ATP存在的连接缓冲系统中，将分别经酶切的载体分子与外源DNA分子进行连接。
DNA连接酶有两种：T4噬菌体DNA连接酶和大肠杆菌DNA连接酶。