克隆策略
合成生物学中不依赖限制性内切酶的分子克隆策略
合成生物学中不依赖限制性内切酶的分子克隆策略不依赖限制性内切酶的分子克隆策略是一种生物学的技术，用于将特定的DNA片段复制成多个复制物，以便进行进一步分析和研究。
它可以帮助遗传学家获取大量特定的DNA序列，并可以通过特定的实验室方法对这些序列进行功能分析。
一、概述不依赖限制性内切酶的分子克隆策略主要是通过外源保护化合物（TAP）来实现无限制酶性克隆技术（TFC）。
TAP通过专门表达的融合蛋白分泌到培养基中，形成一个不接受基因粒范围的抗胞内抗原的壳。
TAP可以把DNA片段放置在其中的交叉起始位点，然后可以使用TFC把DNA片段克隆到另一个载体上，最终得到重组基因。
另一个重要的技术是以有害突变为基础的PCR方法，即突变依赖PCR （MAPS），它是一种不需要保护性蛋白酶就可以进行无限制酶性复制的高通量克隆方式。
MAPS神经可以检测特定的基因突变区域，从而克隆出对应的特定DNA片段。
二、TAP和MAPS的原理理解TAP技术是不依赖限制性内切酶的一种分子克隆策略，其效率要高于传统的限制性内切酶的分子克隆策略。
其原理是：通过表达一种特殊的保护化合物，形成一个不可受阻基因粒范围的抗胞内抗原的壳，这个抗原壳可以将DNA片段放置在其中的交叉起始位点，然后可以利用TFC把DNA克隆到载体上。
MAPS方法是一种基于毒性突变的PCR技术，它可以检测特定的基因突变区域，从而克隆出特定的DNA片段，而不需要任何保护性酶。
三、TAP和MAPS的实验流程在TAP技术中，需要研究者完成以下几个步骤：（1）设计一对序列特异性引物，可以通过in silico方法预测是否存在交叉起始位点，以确定可克隆的最佳DNA片段；（2）在受体上，添加足够的融合蛋白，以保护邻接的交叉起始位点；（3）在源上提供足够多的DNA片段，通过TFC把这些DNA片段复制到受体上；（4）培养新生成的菌株，检测复制基因效率。
MAPS方法的实验流程如下：（1）把特定的DNA片段转录制备好，由此形成一组cDNA；（2）利用突变依赖的PCR技术，根据特定的cDNA的突变，选择相应的引物搭配；（3）复制特定的DNA片段；（4）把复制出的DNA片段克隆到载体上；（5）检测复制的DNA的效率。
基因图位克隆的策略与途径
基因图位克隆的策略与途径基因图位克隆的策略与途径拟南芥(Arabidopsis thaliana)是⼀种模式植物，具有基因组⼩(125Mbp ) 、⽣长周期短等特点，⽽且基因组测序差不多完成 (The Arabidopsis Genomic Initiative, 2000)。
同时，拟南芥属⼗字花科(Cruciferae),具有⾼等植物的⼀样特点，拟南芥研究中所取得成果专门容易⽤于其它⾼等植物包括农作物的研究，产⽣重⼤的经济效益，专门是⼗字花科中还有许多重要的经济作物，与⼈类的⽣产⽣活紧密有关，因此⽬前拟南芥的研究越来越多地受到国际植物学及各国政府的重视。
基因(gene是遗传物质的最差不多单位，也是所有⽣命活动的基础。
不论要揭⽰某个基因的功能,依旧要改变某个基因的功能,都必须第⼀将所要研究的基因克隆出来。
特定基因的克隆是整个基因⼯程或分⼦⽣物学的起点。
本⽂就基因克隆的⼏种常⽤⽅法介绍如下。
1 、图位克隆Map-based cloning, also known as positional cloning, first proposed b y Alan Coulson of the University of Cambridge in 1986, Gene isolated b y this method is based on functional genes in the genome has a relativel y stable loci, in the use of genetic linkage analysis or chromosomal abnor malities of separate groups will queue into the chromosome of a specific location, By constructing high-density molecular linkage map, to find mole cular markers tightly linked with the aimed gene, continued to narrow the candidate region and then clone the gene and to clarify its function and biochemical mechanisms.⽤该⽅法分离基因是按照⽬的基因在染⾊体上的位置进⾏的，⽆需预先明⽩基因的DNA 序列，也⽆需预先明⽩其表达产物的有关信息。
同源重组介导的克隆策略研究进展
３Ｙｕ ｎ Ｌ ｎ ｐｎ ｇ — ｅｈ Ａ ｃ ｌ ｒ ． ａ ｏ ｇ ｉｇＨｉｈ Ｔ ｃ ｕｔ ｅＣＯ，Ｌ Ｄ，Ｃ ａ ｇｈ ，Ｈｕｎ ｎ４ ０ ０ ，Ｃ ｉａ ｕ Ｔ ｈ ｎｓａ ’ａ １ ０ １ ｈｎ ）
Ｒｅ ｅ ｒ ｈ Ｐｒ ｇ ｅ ｓｏ ｃ ｍｂｉａｉｎ Ｂａ ｅ ｎ Ｃｌ ｎｎ ｅｈ ｄ ｓ ａ ｃ ｏ ｒ ｓ ｎ Ｒｅ ｏ ｎ ｔｏ ｓ ｄ ｏ ｏ ｉ ｇ Ｍ ｔｏ ｓ
Ｄ ｉ ｉ ，＂ｉ ｕ ，Ｌ ｉ ｇａｇ ａ Ｑ． ｎ ｒ ｎＹ ｎ ａ ｕＸａ ｙｎ ｎ
摘 要 ：随 着 基 因功 能 的深 入 研 究 ，构 建 表 达载 体 是 研 究 各 基 因的 功 能 及 其 相互 关 系 的 第 一 步 。 近年 来 涌 现 的 多 种 同 源 重 组 介 导 的 高 效 克 隆 策 略 极 大 地 方 便 了 载体 的构 建 。 简 要 综 述 了 同源 重 组介 导 的 克 隆 方 法 的研 究 进 展 ，及 其 在 载 体 构 建 中 的应 用 。 关键词 ：载体构建 ；同源重组 ；连接酶非依赖型克隆；无 限制酶系统 中图 分 类 号 ：Ｑ ８ ７５ 文 献标 志码 ：Ａ ｄ ｉ １． ６／ｓｎ１７ — ６ ６ Ｘ） ０ １ ６０ ２ ｏ： ０３ ９ｊｓ．６ １ ９４ （ ． １ ． ． ９ ｉ ２ ０ ０
ｃｏ ｉ ｇ ｓ ｓｅ ｌｎ ｎ ｙ ｔ ｍ
分 子 生物 学经 过 ２ Ｏ年 的发 展 ，利 用 限制 性 内切 酶 和连 接 酶 的 方法 成 为 载 体 构 建 中一 个 稳 定 而 有 效 的 系统 。在 载 体构 建 的过 程 中 ，可根 据 实 验 要 求 选 择合 适 的克 隆方法 ，最大 程度 利 用 每种 方 法 的优 点 。 经典 克 隆这 种 依 赖 限制 性 酶 切 位 点 的技 术 完 全 依 赖
基因分离的策略
基因分离的策略一、概念基因克隆是指通过分子生物学手段进行基因分离，从而进一步研究其结构功能。
分子克隆是指在体外对不同生物的DNA分子进行人工剪切，重新组合得到新的遗传物质通过载体转入到宿主菌或细胞中表达，扩增带目的基因的重组DNA。
基因克隆的目的是分离基因，分子克隆是分离基因的最终手段。
基因的分离是基因工程研究中最主要的要素，目的基因的成功分离是基因工程操作的关键。
由于每种基因，特别是单拷贝基因占整个生物基因组的很小部分，且DNA的化学结构相似，都是由A、T、C、G四种碱基组成，具有极相似的理化性质，这给分离特定的目的基因带来很大困难。
二、基因克隆的总体策略1、功能克隆法：依赖于基因表达产物及其生物功能进行基因克隆。
①通过分析蛋白质中氨基酸顺序合成寡核苷酸探针从cDNA文库中分离cDNA克隆②通过制备基因产物单抗来进行cDNA片段分离③通过构建cDNA的表达文库，利用基因产物的功能来筛选基因2、定位克隆法：在事先不知道基因的相关功能信息的条件下，通过遗传连锁或细胞学定位技术将基因定位于染色体某一区段，再通过该区域的精细物理图或表达图分析、寻找候选基因并进行突变分析从而确定疾病的相关基因。
CpG岛筛选法、NotI连锁片段筛选法、外显子捕捉法和外显子扩增法、剪切位点筛选法、启动子捕捉法、polyA捕捉法、显微切割微克隆法、候选基因法。
3、消减杂交：将不同来源的基因组DNA或mRNA进行杂交，两者之间相同的核酸片段互补，或通过随机引物进行差别显示PCR扩增不同来源的cDNA，比较其中的mRNA表达差异，从而将两种之间的差异mRNA被筛选出来。
该法有两种思路：①采用杂交的方法：消减文库、代表性差异显示、比较基因组错配筛选② mRNA差别显示，采用PCR扩增，比较其mRNA的表达差异。
4、动物园杂交：利用一些基因在进化中高度保守的特点，在同种或不同种生物的基因组中有许多高度同源的基因，或具有共同的结构，因而可以利用已经有的基因与基因组文库或cDNA文库杂交，来调取高度同源、或结构相似、功能相似的基因。
QTL精细定位和克隆的策略
QTL精细定位和克隆的策略QTL（Quantitative Trait Loci）精细定位和克隆是一种用于研究复杂性状遗传基础的策略。
QTL是指影响数量性状的基因或染色体区域，通过精细定位和克隆这些QTL，可以了解底层的基因机制以及其对数量性状的调控方式。
本文将介绍QTL精细定位和克隆的策略及其主要步骤。
1.QTL的初步定位：初步定位是通过建立遗传图谱或关联分析等方法，确定QTL所在的染色体区域。
常用的方法包括构建遗传连锁图和联合鉴定法。
遗传连锁图通过建立基因座之间的连锁关系，得到QTL大致所在的染色体区域。
联合鉴定法是基于多个遗传座的遗传效应与表型表达之间的关系，通过统计模型来确定QTL的位置。
2.QTL的精细定位：精细定位是在初步定位的基础上，进一步缩小QTL的定位区域。
常用的方法包括细分群体和QTL-候选基因关联分析。
细分群体是通过构建更多的染色体互换系或染色体片段替代系，并进行连锁鉴定，缩小QTL区域。
QTL-候选基因关联分析则是通过挖掘精密的关联信号，确定QTL所在的基因区域。
这些关联信号可以来自候选基因的DNA多态性标记或RNA表达水平等。
总之，QTL精细定位和克隆是一种通过缩小QTL区域，最终确定突变基因，揭示底层的基因机制的策略。
通过建立遗传图谱和进行关联分析等初步定位方法，缩小QTL的定位区域。
随后，通过细分群体和QTL-候选基因关联分析等精细定位方法，最终确定QTL所在的基因区域。
最后，通过基因克隆和功能验证，揭示QTL对数量性状的调控方式。
这些研究有助于深入理解数量性状的遗传基础，提高作物和动物的育种效率。
植物基因克隆的策略及方法
植物基因克隆的策略及方法首先，PCR是植物基因克隆的重要策略之一、PCR（聚合酶链反应）是一种体外复制DNA片段的方法，可以在短时间内扩增大量的特定DNA序列。
通过PCR可以快速准确地克隆植物基因。
PCR的基本原理是利用DNA 聚合酶酶学合成原理，在DNA片段两侧设计引物，将其与DNA片段的两侧结合，在适当的条件下进行DNA的聚合酶链反应，从而扩增目标基因。
PCR方法主要包括加热解性、引物连接、扩增和酶切等步骤。
其次，限制性酶切也是植物基因克隆的重要方法。
限制性酶切是指利用特定的限制性酶将DNA分子切割成特定序列的片段。
通过限制性酶切，可以将目标基因从植物DNA中剪切出来，然后进行进一步处理。
限制性酶切的基本原理是将特定的限制性酶加入反应体系中，该酶能识别和切割DNA的特定序列，从而将目标基因从DNA中剪切出来。
限制性酶切方法主要包括选择合适的限制性酶、反应条件的优化、酶切产物的回收和检测等步骤。
连接是植物基因克隆的另一种重要方法。
连接是指将目标基因连接到特定的载体DNA上，以便在目标植物中稳定地表达。
连接方法主要包括两个步骤：首先，需要处理载体DNA和目标基因的末端，以便它们能够相互连接；其次，利用DNA连接酶将载体和目标基因连接起来。
连接步骤中的处理涉及到DNA末端的修饰和处理，可以通过多种方法如限制性内切酶切割、引物扩增、酶切等进行。
最后，转化是植物基因克隆的最后一步。
转化是指将连接好的目标基因插入到目标植物的基因组中，使其能够在植物体内稳定表达。
转化的方法有多种，包括农杆菌介导的转化、基因枪转化、电穿孔转化等。
其中，农杆菌介导的转化是最常用的方法之一、农杆菌介导的转化是利用农杆菌作为载体将外源DNA导入到目标植物细胞中，通过农杆菌的自然寄生习性以及在植物细胞中特定的植物基因的活性表达，实现目标基因的稳定表达。
总的来说，植物基因克隆的策略和方法包括PCR、限制性酶切、连接和转化。
通过这些方法，可以快速准确地克隆植物基因，实现对植物遗传特性的改变和优化，为农业生产和植物遗传研究提供有力的技术支持。
空心病的心脏克隆细胞治疗策略研究
空心病的心脏克隆细胞治疗策略研究心脏病是世界范围内的一大健康问题，其中空心病是一种严重的心脏疾病，常常导致心脏功能衰竭。
近年来，心脏克隆细胞治疗策略成为研究的热点，为患者提供了一种新的治疗选择。
本文将介绍空心病的病理机制、心脏克隆细胞治疗的原理和方法，并探讨其在临床应用中的前景。
空心病是一种心肌细胞丧失或损伤导致心脏功能减弱的疾病。
通常情况下，心肌细胞的损伤是不可逆转的，因为心肌细胞的再生能力非常有限。
因此，寻找一种替代治疗方法成为了研究的重点。
心脏克隆细胞治疗策略就是利用体外培养的心脏干细胞或多能干细胞，通过注射或移植到患者的心脏，以修复受损的心肌组织。
心脏克隆细胞治疗的原理是利用干细胞的多能性和自我更新能力，将其转化为心脏特定的细胞类型，如心肌细胞、心内膜细胞和心包细胞。
这些特定的细胞类型可以替代受损的心肌细胞，恢复心脏的功能。
在过去的几十年里，研究人员已经开发出了各种不同的方法来实现心脏克隆细胞治疗，包括体外培养、基因编辑和生物材料支架等。
在体外培养的过程中，研究人员首先从患者的体内或体外获取干细胞，如诱导多能干细胞或心脏干细胞。
然后，这些干细胞经过特定的培养条件，被诱导分化为心脏特定的细胞类型。
最后，这些细胞被注射或移植到患者的心脏，以修复受损的心肌组织。
这种方法的优点是可以使用患者自身的细胞，减少免疫排斥的风险。
然而，体外培养的过程中存在一些技术挑战，如细胞转化效率低、细胞成熟度不足等。
除了体外培养，基因编辑也是一种常用的心脏克隆细胞治疗方法。
通过基因编辑技术，研究人员可以改变干细胞的基因组，使其具有心脏特定的功能和特征。
例如，将干细胞中的特定基因进行敲除或过表达，可以促使其分化为心肌细胞。
此外，基因编辑还可以用于修复患者体内的病因性基因突变，从而达到治疗的效果。
然而，基因编辑技术在应用中仍然存在一些安全性和效率的问题，需要进一步的研究和改进。
生物材料支架是一种新兴的心脏克隆细胞治疗方法。
克隆策略复习题及答案.doc
克隆策略复习题及答案一、填空题1.克隆策略有三层含义：① 采用什么样的技术路线将目的基因中克隆出来；②用什么方法将目的基因同载体连接；③通过什么方法将体外连接的DNA分子导入适当的受体进行扩增或表达。
2.假定克隆一个编码某种蛋白质的基因，必须考虑其表达的三个基本条件：①保持正确的可读框；②能够使其转录的启动子；③具有翻译的起始和终止信号。
3.现有的基因克隆策略大体上分为四类：功能克隆、定位克隆、表型克隆、电子克隆。
4.受体细胞的感受态是接受外源DNA的生理状态。
5.DNA重组连接的方法大致分为四种：①黏性末端连接；②平末端连接；③同聚物加尾连接；④接头/连接子连接。
6.将含有外源基因组一个酶切片段的质粒称之为含有一个基因组DNA克隆，各种此类质粒的集合体称之为构建了一个基因组DNA文库。
7.将含有一个mRNA的DNA拷贝的克隆称作一个cDNA克隆,源于同一批RNA制备物的克隆群则构建了一个cDNA文库。
8.在构建cDNA克隆之前，可以用差示杂交来富集一特殊的核昔酸序列。
做法是：用来自于能够产生目的蛋白的细胞mRNA分子同来自于另一类型细胞（不产生这种蛋白质，但亲缘关系密切）的过量mRNA 分子杂交。
9.一旦克隆了一个遗传定位的基因，就可以用染色体步移技术来鉴定基因组DNA文库中与之相邻的基因克隆。
10.只要知道基因组中某一特定区域的部分核昔酸组成，用聚合酶链式反应（PCR）可以将这段DNA进行百万倍的扩增。
11.SD序列是mRNA分子中同核糖体RNA结合的序列，其结构特征是AGGAGG的全部或一部分。
12.环状质粒的转化效率很低，通常是线性双链DNA转化效率的1% o13.cDNA技术是进行真核生物基因克隆的一种通用方法，因为它可以用mRNA为模板，通过反转录合成一个双链的、无内含子的基因，因而有利于在原核细胞中进行功能表达。
14.产生平末端的方法通常有：①平切的酶；②S1核酸酶切除黏性末端；③DNA聚合酶补平黏末端。
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①粘性末端连接，每一种限制性核酸内切酶作用于DNA分 子上的特定的识别顺序，许多酶作用的结果产生具有粘性末 端的两个DNA片段。例如来自大肠杆菌(Escherichia coli) 的限制酶EcoRI作用于识别顺序
↓…GAATTC… …CTTAAG…↑
（↑指示切点），产生具有粘性末端…G …CTTAA和AATTC… G…的片段。把所要克隆的DNA和…载体DNA用同一种限制 酶处理后再经DNA连接酶处理，就可以把它们连接起来。 ②平整末端连接，某些限制性内切酶作用的结果产生不含粘 性末端的平整末端。例如来自副流感嗜血杆菌 （Hemophilus parainfluenzae）的限制酶Hpal作用于识别 顺序
6.2.3 在噬菌体载体上克隆
合成cDNA的局限性 1、并非所有mRNA都有polyA结构 2、细菌或原核生物的mRNA半衰期很短 3、 mRNA在细胞中含量少，队酸和碱敏感， 分离困难 4 、仅仅限于克隆蛋白质编码基因
6.3 从内切酶部分酶切后， 将酶切片段插入到载体DNA分子中，所有这些插入了基因 组DNA片段的载体分子的集合体，将包含这个生物体的整样每个细胞就包含了一个基 因组DNA片段与载体重组DNA分子，经过繁殖扩增，许多 细胞一起包含了该生物全部NA 或染色体DNA的所有片断随机地连接到基因载体上， 然后转移到适当的宿主细胞中，通过细胞增殖而构成各个片 段的无性繁殖系（克隆），在制备的克隆数目多到可以把某 种生物的全部基因都包含在内的情况下，克隆大片段DNA
许多真核基因片段超过47kb，所以柯斯质粒 被采用。但是质粒噬菌体柯斯质粒都无法分 离整个基因，所以高容量载体BAC,YAC就能 解决这个问题。
当cDNA和质粒DNA混合的时候，有几种可 能的情况。最好的情况就是一个插入的 cDNA连接一个质粒DNA形成一个重组DNA。 如果浓度不匹配，那么可形成单分子串联体 而不是双分子重组DNA.如何区分插入有外源 DNA的重组质粒和无插入而自身环化的载体 分子是较为困难的。通过调整连接反应中外 源DNA片段和载体DNA的浓度比例,可以将载 体的自身环化限制在一定程度之下,也可以进 一步采取一些特殊的克隆策略,如载体去磷酸 化等来最大限度的降低载体的自身环化。
完全酶切和部分酶切的区别： 完全酶切，是指使用的内切酶在目标片段上的切点全部切开， 切出来的片段大小不会因为酶量增加，或酶切时间加长而导 致片段大小发生改变（确保不发生星号活性的量和时间）。 克隆构建载体时，就是使用的完全酶切。所有的切点都切了。 部分酶切是指，只对片段上一部分酶切位点产生切割。这种 一般是在建库，或者需要酶切基因组后，获得一定大小范围 内的片段而使用的酶切方法。这种酶切不要求获得某一大小 的片段，而是要获得例如200-500bp的片段，在电泳上没有 条带，而是smear。所以部分酶切需要严格控制酶的用量和 时间，要尝试稀释后的酶液，切一定时间段内，哪一个条件 可以获得目标范围的片段。 部分酶切的条件需要更多的摸索，而且重复性要求也会更高。
Байду номын сангаас
基因克隆即重组DNA技术，指在体外对DNA 分子按照既定的目的和方案，采用酶学方法 将不同来源的DNA分子在体外剪切和重新连 接,组装成一个新的DNA分子。 在此基础上，将这个DNA分子导入到一定的 宿主细胞，使它能够在宿主细胞中扩增，形 成大量的子代分子，此过程即称为基因克隆。
基因克隆包括四个基本技术环节：
↓…GTTAAC… …CAATTG…
而产生末端为…GTT …GAA的DNA片段。用机械剪切方法 取得的DNA片段的末端也是平整的。在某些连接酶（例如 感染噬菌体T4后的大肠杆菌所产生的DNA连接酶）的作用 下同样可以把两个这样的DNA片段连接起来。
③同聚末端连接，在脱氧核苷酸转移酶（也称末端 转移酶）的作用下可以在DNA的3′羧基端合成低聚 多核苷酸。如果把所需要的DNA片段接上低聚腺嘌 呤核苷酸，而把载体分子接上低聚胸腺嘧啶核苷酸， 那么由于两者之间能形成互补氢键，同样可以通过 DNA连接酶的作用而完成DNA片段和载体间的连接。 ④人工接头分子连接，在两个平整末端DNA片段的 一端接上用人工合成的寡聚核苷酸接头片段，这里 面包含有某一限制酶的识别位点。经这一限制酶处 理便可以得到具有粘性末端的两个DNA片段，进一 步便可以用DNA连接酶把这样两个DNA分子连接起 来。
1、目的基因和载体的获得； 2、目的基因与载体连接,形成重组分子； 3、重组DNA分子导入宿主细胞； 4、含有重组DNA分子的细胞的筛选和扩 增。
6.1 哪一个方法是最好的
一个是构建感兴趣的生物个体的基因， 即将生物体的基因全部分段克隆，然后建个是用PCR体外扩增技术或者人工化学 合成法直接合成目的基因。
目的基因来mRNA还是基因组DNA是每一个 试验面临的第一个选择。 mRNA有两个优点：1在特定组织细胞里时空 特异性的表达某种基因；2没有非编码基因。 选择了目的基因的物质来源，接下来确定载 体和宿主系统。在目的基因和实验总体目标 确定的情况下，这一系统的选择是相对容易 的。
“If it ain‟t broke, don‟t fix it” By keeping the overall aim of the experiments in mind, the researcher can minimize the effects of such compromises and choose the most efficient cloning route.
6.2 克隆mRNA
指一种特定的mRNA在某个细胞中的平均分 子数。 丰度越高克隆越容易
6.2.1 cDNA的合成
合成cDNA过程中的几个问题： 1、很难得到全长的cDNA片段 2、在核酸酶去除发卡结构时，会去除一些重 要的5‟端序列
6.2.2 在质粒载体上进行克隆
从原理上说是很简单的，先用限制性内切酶 切割质粒DNA和目的DNA片段, 然后体外使 两者相连接, 再用所得到重组质粒转化细菌, 即可完成。 连接Cdna与质粒有三种方法1平性末端连接2 分子连接3同聚物加尾。
6.3准备。准备DNA片段需要考虑两方面： 1、DNA片段的大小； DNA片段的大小取决于载体的运输能力。超过 100kb是比较理想的。置换型形噬菌体EMBL-4的 运载能力在23kb左右，YAC,BAC在300kb 2、剪切DNA片段的方法。 剪切DNA片段的方法由机械剪切，缺点是不能产生度梯度离心或是 凝胶电泳进行“分馏”。 插入DNA可以通过磷酸化来避免自身环化和 串联体的形成。
6.4 克隆策略展望
6.4.1 cDNA的合成和克隆
保罗伯格和冈山发明的方法，质粒本身成为 引物，mRNA-s1DNA杂交双联与质粒即连接 分子连接后再进行置换反应，将杂交链变为 Cdna双链 。
“策略”就是为了实现某一个目标，首先预先 根据可能出现的问题制定的若干对应的方案， 并且，在实现目标的过程中，根据形势的发 展和变化来制定出新的方案，或者根据形势 的发展和变化来选择相应的方案，最终实现 目标。 克隆即来自同一始祖的相同副本或拷贝的集 合。 获取同一拷贝的过程称为克隆化,即无性繁殖。
6.4.2 克隆DNA的表达
克隆DNA的表达。有些试验不需要表达DNA，有些 试验需要将序列作为探针或是生产蛋白质等商业用 途，就需要克隆基因的表达。表达时，选用于表达 载体相匹配的菌株。外源基因在原核细胞表达的必 要条件： 1、删除内含子及5„非编码区； 2、外源基因置于强启动子和SD顺序控制下； 3、维持正确开放阅读框架； 4、Mrna稳定且可有效转译，形成蛋白质不被降解； 5、蛋白不需要翻译后加工过程。