人表皮干细胞的体外分离、培养及鉴定

人表皮干细胞的体外分离、培养及鉴定

何黎顾华

昆明医学院第一附属医院皮肤性病科云南

[摘要]

目的：探索实验条件下人表皮干细胞的体外分离、培养及鉴定。

方法：利用细胞工程方法进行组织分离及细胞培养：通过免疫组化方法，利用角蛋白单克隆抗体对培养的角质形成细胞进行鉴定，并利用表皮干细胞的相对特异标识分子——CK19对其进行检测分析。

结果：表皮自真皮较完整分离，电镜及免疫组化证实培养细胞为角质形成细胞，免疫组化结果显示：CK反应阳性，部分细胞CK19阳性，表明有表皮干细胞存在。

结论：体外分离、培养角质形成细胞成功，且分离得到的角质形成细胞中有表皮干细胞存在。

[关键词]：角质形成细胞表皮干细胞细胞培养角蛋白——19

对于烧伤、急性创伤、某些疾病导致的皮肤缺损，尤其是大面积烧伤一直以自体皮移植作为首选方案，而自体皮肤不足是临床遇到的主要问题。随着细胞培养技术和组织工程的出现，使许多脏器或组织体外重建成为可能。人工皮肤的研制就是一个典型例子。在这一技术中，种子细胞——角质形成细胞的体外培养，以及体外分离到的角质形成细胞中是否有在体外能大量增殖的表皮干细胞决定了能否成功构建人工皮肤。为此本课题采用组织分离方法及细胞培养方法进行角质形成细胞体外分离及培养；通过免疫组化方法，利用人广谱单克隆抗体对培养细胞进行鉴定；并利用CK19对体外培养细胞中是否有表皮干细胞进行检测。

材料和方法

一、材料

1、取材

选择6-26岁健康男性，行包皮环切术切除的包皮。

2、主要培养基及试剂

(1)磷酸盐缓冲溶液（PBS和D-Hank’s液）：（2）培养基：K-SFM（Gibco公司），编号：37010，内含2.5ug表皮细胞生长因子（EGF）和25mg小牛垂体(BPE)：（3）分离酶：dispase（4）胰蛋白酶；（5）抗人广谱角蛋白单克隆抗体；（6）CK19单克隆抗体；（7）SP 超敏免疫组化试剂盒。

二、方法

1、取材

将包皮环切术切除的健康包皮组织放入50ml离心管中（内装10mlDMEM培养基，含青、链酶素及硫酸庆大酶素）。

2、角质形成细胞的分离

将手术切除的包皮组织剪截成0.5大小皮片,75%酒精漂洗3次后，用含硫酸庆大酶素的PBS重复漂洗3次，再用PBS冲洗3-5次,放入装有10mldispase酶的离心管中放入4℃冰箱过夜。次日晨，用无菌弯头眼科镊轻轻揭下表皮，放入含有5ml0.05% 胰酶及0.01%EDTADE的50ml离心管，置于37℃消化吸收10min ，加入含有15%小牛血清的DMEM终止消化，滤网过滤残渣，将滤下的液体离心，弃上清，在加入不敷出10MLK-SFM培养基充分混匀后再离心一次，弃上清，加入5ml完全K-SFM培养基，用液管充分吹散细胞团。

3、细胞计数

将10ul细胞悬液与10ul台盼蓝充分混匀后，于计数板上计数，每次收集到的细胞总在1×1之间，细胞活率>90%以上。

4、角质形成细胞原代培养

将制备的角质形成细胞悬液以 1 的密度接种到25 塑料培养瓶中，置于

37 ℃的培养箱中培养，48小时后换液，以后每3天换液一次。

5、角质形成细胞的传代培养

当原代培养角质形成细胞铺满瓶底约80%左右时，弃培养基，加入0.05%胰蛋白酶和0.01%EDTA 混合液，约3-5min后加入含15%牛血清的DMEM终止消化，然后离心弃上清，加入10 完全K-SFM培养基,记数后按的密度接种到25 塑料培养瓶中,置于37 ℃的培养箱中培养,每2-3天换液一次.代长满培养瓶约80%后,重复上述步骤继续传代培养.

6 角质形成细胞的鉴定

(1) 倒置显微镜观察

将原带代培养的角质形成细胞接种之后, 倒置显微镜观察细胞形态及动态变化,并于培养后1天3天5天7天9天11天照相.

(2) 透射电子显微镜观察将传代培养的角质形成细胞按常规方法处理后,置于100C-X透射电子显微镜下观察并照相.

(3) 免疫组化染色

将原代培养的角质形成细胞调整细胞悬液进行免疫组化染色.以光谱的鼠抗人角蛋白单克隆抗体及CK19分别作为一抗,以PBS作为阴性对照.

结果

1.角质形成细胞的分离及培养

取出经dipase酶消化后的包皮组织,行HE染色,组织形态学观察显示:表皮自真皮分离较完整,表皮基底层中细胞基本完整.

2、倒置显微镜观察结果

于培养的第1、3、5、7、9、11天倒置显微镜观察细胞形态并照相

3、透过电镜下观察结果

电镜下细胞结构清晰，细胞内可见大量的束状张力细丝，证实为角质形成细胞：且其间可见少量的较为幼稚的角质形成细胞（细胞体积较小。细胞核大，核仁明显，常染色质丰富，异染色质教少，胞浆可见少量的张力细丝及较丰富的线粒体）

4 、免疫组化染色结果

利用抗角蛋白单克隆抗体对培养的细胞进行免疫组化鉴定，细胞呈阳性反应，证实为人角质形成细胞：CK19免疫组化染色显示，有少量CK19阳性细胞存在，并以PBS作为一抗设置阴性对照。

讨论

人正常皮肤的表皮细胞包括角质形成细胞、黑素细胞、Merkel细胞，而角质细胞占表皮细胞的绝大部分。表皮基底层是表皮细胞的生发层，紧靠基底膜，随着表皮基底层细胞复杂而有续的增殖过程，分裂、增殖的细胞由内向外逐层推移，依次形成棘细胞层、颗粒层、透明层、角质层，以维持体表结构、屏障的完整性及内环境的稳定。在表皮中除了基底层棘层的角质形成细胞具有分裂、增殖能力外，其他层细胞均属于终末分化或退化了的细胞，不具备增殖能力，因此，人表皮角质形成细胞的培养，实质上就是收集表皮基底层、棘层细胞并保持其增殖活力。角质形成细胞体外培养成功的关键因素取决于：

1 、采用dipase /胰蛋白酶联合消化分离收集细胞

本课题采用dipaseⅡ和胰蛋白酶/EDTA两步消化法，disase酶是一种中性蛋白酶，研究表明中性蛋白酶主要分解皮肤的IV型胶原蛋白和纤维粘连蛋白，只破坏半桥粒结构，并不表皮细胞间的桥粒结构。在我们的实验中，联合应用两步酶消化法，首先采用2U/ml dispase 酶分离真皮、表皮，再运用胰蛋白酶 / EDTA 离散表皮细胞，制备成单细胞悬液；这样，既缩短了酶消化作用的时间，获得较多具增殖能力的表皮细胞，而且减少了成纤维细胞的污染。

2、应用无血清培养基培养

目前，角质形成细胞体外培养方法主要有三种：1、组织块培养法：2、以3T3 细胞作为滋养层的有血清培养法：3、无血清培养法。角质形成细胞无血清培养方法的建立，去处了3T3细胞的影响，而其中起重要作用的是牛垂体提取物，为表皮细胞的生长提供了必须的一些成分，无血清培养基尚可抑制成纤维细胞的增殖，促进上皮细胞的增长。在我们的实验中，采用Gibco公司生产的角质形成细胞无血清培养基（K-SFM），培养基中没有血清成分，