PCR质控及问题分析
实时荧光定量PCR检测HBV DNA室内质控分析
实时荧光定量PCR检测HBV DNA室内质控分析目的探讨实时荧光定量PCR在HBV DNA定量检测过程中的室内质控问题。
方法用实时荧光定量PCR法检测2013年1~7月自制的乙肝阳性室内质控血清，与临床标本同步检测，计算每次阳性质控结果的常用对数、标准曲线的斜率、截距和相关系数(r)及相关结果的均值(x)、标准差(s)和变异系数(cv)，利用EXCEL折线散点图画出质控图进行质控。
结果本室2013年1~7月测定自制的阳性室内质控结果测定值均在控，标准差和变异系数均在允许范围内，符合要求。
结论本实验室采用实时荧光定量PCR检测HBV-DNA定量检测过程中，选用的质控方法和自制的质控品稳定性良好，能可靠有效地为临床提供准确的检验结果。
Abstract：ObjectiveTo explore the indoor quality controlproblems in HBV DNA quantitative detection of real-time fluorescence quantitative PCR. Indoor quality control serum HBsAg positive self detection.MethodsFor 1~7 months of 2013 by real-time fluorescence quantitativePCR method and clinical specimens, synchronous detection, curve of standard logarithm, calculated for eachpositive quality control results of the slope, intercept and correlation coefficient (R) value and related results ,standard deviation (s) and the coefficient of variation(CV), scatter picture quality control chart for quality control by using the EXCEL line. ResultsThe 1~7 months of 2013 were positive results of internal quality control of homemade measured values are in control, the standard deviation and variation coefficient were within the allowable range, meet the requirements. ConclusionThis laboratory detection of HBV-DNA quantitative real-time fluorescence quantitative PCR detection process,quality control methods and quality control of homemadegood stability, can provide valid and reliable accurate test results for clinical.Key words：Real time fluorescence quantitative PCR; Polymerase chain reaction; HBV-DNA; Quality controlHBV DNA含量是诊断和监测乙型病毒性肝炎的重要指标[1]。
PCR实验室核酸检测的常见问题及解决办法
PCR实验室核酸检测的常见问题及解决办法检验科人员是核酸检测工作的主力军，我们不但要保证检测结果的有效性，还时刻面临着被感染的风险。
本文为大家讲解《PCR实验室新冠核酸检测操作注意事项》，重点从新冠病毒生理特性、荧光PCR原理、PCR实验室筹备规范、样本检测环节操作、实验室数据分析、常见问题解析等几个方面讨论学习。
1、传染源目前所见传染源主要是新型冠状病毒感染的患者。
无症状感染者也可能成为传染源。
2、传播途径经呼吸道飞沫和密切接触传播是主要的传播途径。
在相对封闭的环境中长时间暴露于高浓度气溶胶情况下存在经气溶胶传播的可能。
由于在粪便及尿中可分离到新型冠状病毒，应注意粪便及尿对环境污染造成气溶胶或接触传播。
3、荧光PCR原理重复进行“变性 - 退火 - 延伸”三个过程，模板DNA的量就会呈指数倍增加，理论上讲经过 n 个循环之后，模板量就会达到2的n次方。
4、常见问题解析①新冠试剂出现翘尾，怎么处理？答：如果是个别单一通道翘尾，不管是FAM还是VIC通道，首先按照要求复查，复查建议重新采样，如果不方便重新采样建议对原有样本进行重新提取核酸验证，如果复查阴性判读阴性，如果复查还是同一通道翘尾，就要对结果仔细审核，一是要排除实验室污染，二是要对病人信息了解清楚，从临床症状及接触史排查，如果没法确认，建议必须重新采样复查，如有必要可以采用另一家试剂来验证。
如果出现大量的弱阳性扩增翘尾，首要原因是考虑实验室污染，可以通过做环境样本和阴性对照做验证排除。
②N基因和1ab基因是新冠病毒的特有基因吗，灵敏度哪个更高？是否会和其他冠状病毒片段重叠？答：N基因跟1ab都是特异的，不会跟其他呼吸道病原体交叉反应。
设计时候，两个基因的序列不一样，导致灵敏度不一样，N基因的灵敏度比1ab灵敏度高。
③新冠检测结果和临床诊断不符合，怎么解读？答：新冠病毒由于是RNA病毒，容易降解，另外检测结果也和取样，核酸提取以及样本本身的核酸浓度有关，需要逐一分析，同时可以结合临床症状判读。
PCR实验室基因扩增检测实验及结果分析
PCR实验室基因扩增检测实验及结果分析1、目的：保证扩增及结果分析的标准化、规范化。
2．适用范围：适用于本室使用的普通离心机。
3．负责人：操作人：4、标准程序：4.1基因扩增检测标准程序：扩增反应前须先在样本输入模板上按照事先排好的标本位置进行设置。
每次实验除待检标本，还需包括：阴性对照、阳性对照、室内质控品各一份，一组阳性标准品（4个梯度108、106、105、104）。
4.1.1打开电脑电源开关，进入Windows XP界面。
4.1.2 接着打开PCR仪电源开关，预热5分钟。
4.1.3双击电脑桌面的SLAN-96P图标进入程序设置界面。
4.1.4单击“文件”菜单中的“新建”命令，（或单击工具栏中的“新建”按扭）。
在测定、容器和模板中做相应的选择，点击OK。
4.1.5应用检测管理程序，并将其添加到样品板文档中。
4.1.6检测反应管，4.1.7 根据当次实验所需条件编辑时间和温度。
运行样品板文档。
4.2 结果分析标准程序：应按以下步骤进行：全部曲线——阴性对照——阳性对照——阳性室内质控品——阳性标准品——逐个分析（标出阳性标本和可疑标本）——调整参数，获得较好的标准曲线，显示定量结果——登记，发报告。
4.2.1 整体曲线的观察：将所有曲线选中进行整体观察1）观察是否存在污染情况（包括标本污染和试剂污染），特别应注意大量曲线在同一Ct值出现上涨的情况。
2）观察是否有光路传导阻滞或电压波动等机器原因形成的异常曲线。
4.2.2 阴性对照的分析阴性对照：试剂中加入与待检标本进行同样处理的已知阴性标本。
作用：用以监测实验室和前处理过程中是否存在污染。
4.2.3 阳性对照的分析阳性对照：试剂中加入与待检标本进行同样处理的已知阳性标本。
作用：用以监测实验能否正常检出阳性标本，避免假阴性的出现。
4.2.4 室内质控品的分析室内质控品：试剂中加入与待检标本进行同样处理的已知浓度室内质控品。
作用：用以监控日常实验的精密度。
PCR质量控制2023.3
PCR质量控制2023.3引言PCR（聚合酶链反应）是一种广泛应用于分子生物学研究的技术，它能够在体外扩增目标DNA片段，具有高度特异性和灵敏度。
PCR反应的质量控制对于确保实验结果的准确性和可重复性至关重要。
本文将介绍PCR质量控制的方法和注意事项，以帮助研究人员有效地进行PCR实验并获得可靠的结果。
质量控制方法1. 使用质量良好的试剂和材料，确保所使用的PCR试剂和材料的质量良好。
选择来自可靠供应商的高质量试剂，如聚合酶、引物和缓冲液等。
使用新鲜的试剂，并储存于适当的条件下，避免冻融循环和长期存储。
2. 设计合适的引物和探针引物和探针的设计是PCR实验成功的重要因素之一。
确保引物和探针的序列与目标DNA片段完全匹配，并具有合适的Tm值，以确保高度特异性的扩增。
避免引物和探针之间的互相结合和二聚体形成。
3. 进行质控反应在进行实际PCR反应之前，建议进行质控反应以验证试剂和仪器的性能。
质控反应通常包括PCR阴性对照、阳性对照和样品重复，以确保实验的可靠性和一致性。
通过检测阴性对照是否无扩增产物以及阳性对照是否有预期的扩增产物，可以评估试剂和仪器的质量。
4. 优化PCR参数选择合适的PCR条件对于实现高效扩增至关重要。
优化PCR参数包括反应体系的浓度和比例、引物和探针的浓度、PCR循环程序和温度梯度等。
通过调整这些参数，可以获得较高的扩增效率和特异性。
5. 检测PCR产物，对PCR产物进行检测和验证。
常用的PCR产物检测方法包括凝胶电泳、聚合酶链反应的实时荧光定量PCR（qPCR）和基因测序等。
通过这些方法，可以评估PCR扩增的效果，并确认目标DNA片段的存在与否。
注意事项除了上述质量控制方法之外，还有一些重要的注意事项需要注意：1. 保持实验室的清洁和无菌。
PCR反应对外源性污染非常敏感，应该在无菌条件下进行实验，并且使用无菌的试剂和材料。
2. 严格遵循PCR反应的操作规程。
避免交叉污染，使用新鲜的各种试剂，并按照正确的顺序和步骤进行实验操作。
pcr室内质控结果编低
pcr室内质控结果编低
PCR室内质控结果编为低可能有以下原因：1. 实验操作失误：PCR技术对实验操作非常敏感，如果操作不正确，比如样品污染、试剂过期等，就会影响结果的准确性。
2. PCR条件设置不正确：PCR反应的温度、时间等条件设置不正确，可能导致扩增效率降低，结果变差。
3. 试剂质量问题：PCR试剂的质量不良也会影响结果的准确性，比如引物或探针的质量有问题。
4. 样品质量问题：样品的DNA质量不好，比如浓度低、含有抑制物等，都会影响PCR反应的效果。
5. 基因突变或异质性：如果待检测的基因存在突变或者样品中存在基因的异质性，都可能导致PCR结果编为低。
在面对PCR室内质控结果编为低时，应该进行排查和分析，检查实验操作是否正确、PCR条件是否设置正确、试剂质量是否良好等，同时可以尝试重复实验或采取其他措施进一步验证和提高结果的准确性。
PCR实验室污染的原因分析、处理及整改措施
PCR实验室污染的原因分析、处理及整改措施2022年5月29日中午12:30开始PCR实验室假阳性频率增高,考虑可能出现实验室污染，检测工作立即停止，首先，查找污染源和明确污染范围。
经排查本次实验室污染的主要来源可能是部分配置好的反应体系放置时间过久、实验室二区出现扩增产物的污染。
一、发生污染的原因分析。
1.核酸检测工作频次过高，导致每批样本检测之间没有足够时间消毒。
2、核酸检测人员短缺，检测人员需要多次往返二区、三区，极容易导致扩增产物的污染。
二、实验室污染的处理：1.生物安全柜的操作台消毒处理：使用5000mg∕L含氯消毒剂进行喷洒消毒。
消毒液需要现用现配，24小时内使用。
2.实验室台面、地面、物体表面等的消毒处理：立即使用润湿有5000mg∕L含氯消毒剂的毛巾擦拭、消毒。
清洁、消毒通风系统滤网。
采用房间固定和可移动紫外灯进行紫外照射2小时以上。
3.清理污染物时：严格遵循活病毒生物安全操作要求，采用压力蒸汽灭菌处理，并进行实验室换气等，防止次生危害。
整改措施：1.严格实验室功能分区确保实验室人、物及空气单向流动核酸检测实验室的人、物及空气流向按照试剂储存和准备区一样本制备区T扩增和产物分析区，防止扩增产物随人流、物流及空气进入扩增前的区域。
空气流向应按照从试剂储存和准备区一样本制备区一扩增区一扩增产物分析区方向空气压力递减的方式进行。
2、力口强实验室检测安全管理(1)基本要求核酸检测应当在生物安全二级实验室进行，并应在生物安全风险评估的基础上，采取适当的个体防护措施，包括手套、口罩和隔离衣等。
开展新冠病毒核酸检测的实验室应当制定实验室生物安全相关程序文件及实验室生物安全操作失误或意外的处理操作程序，并有记录。
(2)实验室前安全要求应使用2000mg∕L含氯消毒剂或75%酒精进行桌面、台面及地面消毒。
消毒液需每天新鲜配制，不超过24小时。
转运至实验室的标本转运桶应在生物安全柜内开启。
转运桶开启后，使用2000mg∕L含氯消毒剂或75%酒精对转运桶内壁和标本采集密封袋进行喷洒消毒。
PCR 技术在医学检验中的质量控制及应用综述
PCR 技术在医学检验中的质量控制及应用综述摘要】自20实际80年代PCR技术问世以来，该项技术以在医学及生物学等多个领域广泛应用，为医学疾病的精确诊断创造了条件。
但在PCR技术的应用阶段，存在各类隐患如临床标本的处理和污染的控制等，成为PCR技术应用中不可忽视的问题，也是PCR技术成功的关键。
因此，在现代医学中对PCR技术的应用提出了更高的要求，必须提高医学检验人员临床诊治水平，同时提高PCR的准确度和可信度，只有这样才能切实保障人民安全健康，防止医疗纠纷的发生。
本文通过对PCR技术在医学检验中的应用的深入研究，提出了该项技术在医学检验中的质量控制方法及相关应用。
【关键词】PCR技术；医学检验；质量控制；应用【中图分类号】R2 【文献标号】A 【文章编号】1671-8725（2014）10-0128-01引言：在当前的医学疾病监测方法中，PCR 技术以其灵活、简单、快速、特异等优点，成为了一种新型疾病监测手段，增强了各类疾病监测的准确性。
PCR技术在医学研究领域和临床应用中发挥着重大的作用，使医学疾病检验可以从患者身体的一极小一部分组成（如一根头发、一滴血液等）出发，通过细胞扩增来进行DNA的分析诊断。
同时在病原体的鉴定、遗传病诊断研究等方面也发挥着很大的作用。
一PCR技术概述PCR技术是由三个基本步骤组成的循环反应，其基本原理是通过对体内DNA分子的复制机制的模仿，在体外相同条件下对特异的DNA片段进行扩增。
三个步骤分别为：①根据DNA分子的特点，采用加热的方法使双链DNA分子解旋成两条单链，②根据碱基互补配对原则，通过采取降温措施使这两条单链与引物结合成双链，③在镁离子、脱氧核苷酸以及缓冲液环境下，通过DNA 聚合酶催化合成互补链，完成链的延伸。
以上步骤的重复，约经过30各周期，即1~2小时的时间，目的基因的数量就能增加几百万倍。
二医学检验中PCR技术的质量控制在PCR 技术在医学检验中，为了提高PCR技术的准确度和可信度，必须做好PCR技术在医学检验中的质量控制工作，这就要求对PCR技术的相关弱点进行合理的分析，可以从PCR 技术实验室的正规化配置、PCR技术操作人员的技术水平、临床标本的处理、污染的控制等方面着手。
PCR室内质控规则讨论
由于此前HBV-DNA只做单水平质控物，仅采取了1-3S单个失控规则。
此次复审中专家也提到我室质控物操作的问题，建议加做高水平质控物。
针对检查组提出的问题，我们做出了整改，目前已增加高水平质控物，靶值约在108左右。
由于增加了质控物的水平，采用单个失控规则明显不能满足质控管理的需求。
现讨论增加1-2个规则，黄少军：增加R-4S失控规则，增加此规则可有效控制偶然因素导致的出控，确保试验结果的稳定性。
可以考虑增加2-2S失控规则，原因是目前我室采用的失控规则（1-3S、R-4S）仅能判断偶然误差，无法判断系统误差，增加2-2S规则后，可以判断是否存在系统性的偏倚、漂移或倾向性改变。
但要经过一段时间的验证，因为从质控图上看，单个水平的质控物我室基本上很少有2-2S的情况出现，但目前刚开始采用双水平质控物，缺少数据，无法判断采用2-2S 后实际的情况。
柯峰：对增加R-4S失控规则，完全同意。
但对增加2-2S失控规则，有一定的担心，因为整个PCR检测工作可以说是手工操作，受操作人员操作导致的检测变异比较大，在加样误差的控制上无法像生化和临检的机器那么稳定，如果增加2-2S规则的话，可能会出现失控次数比仅使用单水平质控物时候明显增多的情况。
目前可以先观察一段时间，看看2-2S规则的实际应用情况。
另外我赞成黄少军提出的对PCR扩增曲线的斜率进行监测的意见，这样做是符合PCR工作实际情况的。
以上两位同志所说的实际情况，确实也都有一定的道理。
针对柯峰的问题，黄少军提出另外一个可以解决的想法，不增加2-2S规则，但要对PCR扩增曲线的斜率进行监测，因为扩增曲线的斜率实际上是对整个PCR扩增系统的扩增效率的反映，如果监测扩增曲线斜率在一个可接受的范围内，那么可以说PCR的扩增效率基本上是恒定的，这样也基本上不会出现系统误差，仅仅会出现DNA提取过程导致的偶然误差。
结合两位同志的讨论，考虑增加R-4S规则，同时监测扩增曲线斜率。