生物大分子分离纯化技术共43页文档
生物大分子分离与纯化技术
生物大分子分离与纯化技术是生物学、生物医学和生物工程领域中非常重要的技术之一。
它可以用于提取和分离生物大分子，从而达到纯化的目的。
本文将着重探讨的原理、方法和应用。
一、原理在生物细胞中，不同的生物大分子有着不同的形态、结构和性质。
为了分离和纯化这些生物大分子，需要利用它们的理化性质差异。
例如，蛋白质可以通过电泳分离，根据电荷、分子量等差异分离出不同的成分；核酸则可以通过浓度梯度离心分离，根据密度差异分离出单独的成分。
还有一些生物大分子，如多肽、糖类、脂质等，可以通过其他特殊方法分离。
二、方法1. 柱层析法柱层析法是中常用的重要方法之一。
它利用固定相（柱子中的树脂）和流动相（洗脱缓冲液）之间的相互作用来分离和纯化生物大分子。
根据固定相和洗脱缓冲液的不同性质，可以选择不同的柱层析方法，例如离子交换层析、凝胶过滤层析和亲和层析等。
2. 电泳法电泳法是基于生物大分子的电荷差异和分子量差异的原理，将不同的生物大分子分离并捕获的技术。
根据电泳介质、运行方式以及电场的不同条件，可以选择不同的电泳方法，如蛋白质电泳、DNA电泳、脂质电泳等。
3. 超滤法超滤法是利用微孔过滤膜的不同截留分子量，将生物大分子按照大小分离纯化的技术。
超滤法分为正压式和负压式，正压式是通过液体压力将生物大分子向膜孔内压缩，从而分离得到小分子；负压式是通过负压将大分子向膜孔内吸附，难以通过的是大分子。
4. 溶剂萃取法溶剂萃取法是将生物大分子从混合物中溶解到特定的有机溶剂中，然后通过反萃取、扩散等工艺，使它在不同相中转移、分离和纯化的方法。
5. 其他方法生物大分子的分离和纯化方法还有一些其他方法，例如磁性珠法、浓缩法、冷冻干燥法等。
三、应用在生物医学、生物工程、食品工业、环境保护和新能源开发等领域中有广泛的应用。
具体来说，1. 生物医学领域生物医学领域的应用主要是分离和纯化蛋白质和多肽类物质，如酶、抗体、激素、血浆蛋白等。
这些物质可以作为药物、诊断试剂、生物治疗的原材料等。
2013-第三章生物大分子的分离纯化资料
他分子的污染。
（一）材料与方法的选择
材料：根据 各自的研究目的， 选择核酸含量丰 富，且易于采样 获得。常见如血 液、尿液、唾液、 组织及培养细胞 等。
方法的选择
核酸的提取方法很多，提取时主 要考虑提取核酸的完整性、核酸 纯度等因素，此外，还要考虑样 品的种类、检测的目的及时间要 求等因素。根据标本的类型、数 量及制备核酸的用途等选择合适 的方法。 手工提取； 试剂盒； 全自动仪器法。
性沉淀。其中电泳最常用。
凝胶电泳
电泳：带电粒子在电场中向与其自身电荷相反电极 的运动称为电泳。
原理：琼脂糖分子依靠氢键和其它力的作用使其相 互缠绕形成绳状琼脂糖束，构成细微多孔的网状结 构。凝胶电泳兼有分子筛效应和电荷效应。
在核苷酸中的磷酸基团和碱基带电，是两性分子。 在PH3.5时带正电；在PH8.5时带负电。
匀浆法 ：基于液相的剪切力，适用面广，处理 量大，速度快。但产热大，可能造成生物活性 物质失活及DNA分子的断裂。
珠磨法：利用研磨作用破碎，适用面广。但产 热大，可能造成生物活性物质失活。
超声波：利用超声波作用使细胞破碎， 产热量 大，且散热不易，成本高，仅适用于小量样品 破碎。
物理方法
干燥法：干燥后的菌体细胞膜渗透性变化，自 溶较剧烈，易引起蛋白质或其他组分变性。
核糖核酸（ribonucleic acid， RNA）
分布: DNA：细胞核（真核细胞，原核细 胞） 细胞器（叶绿体，线粒体） 病毒（DNA病毒） RNA：细胞核中产生，核仁中或运 输到细胞质 RNA病毒
一、细胞内核酸的存在形式及理化性质
细胞内核酸的存在方式： DNA+Protein→DNP; RNA+Protein→RNP
生物大分子的分离纯化及其应用2012-文档资料
随着生物技术的发展和对各种蛋白质结构和功 能研究的深入，对蛋白质分离检测研究也有了迅 速发展，出现了许多高效的分离纯化技术和手段， 主要包括膜分离、高效液相色谱，毛细管电泳、 分子印迹技术及联用技术。
采用阴离子交换色谱分离乳蛋白时，一般是有 针对性的分离某一种蛋白质时的效果较好，如分 离骨桥蛋白时，纯度可以达到85 %以上。
对于乳品中一些等电点较高的蛋白质，如乳铁 蛋白，采用强阳离子色谱的分离手段则更为有效。
6.3凝胶过滤层析
凝胶过滤层析亦称凝胶色谱、排阻色谱或分子 筛，是利用凝胶把分子大小不同的物质分离开的 一种方法。
蛋白质的分离纯化是研究蛋白质化学组成、结 构及生物学功能、新蛋白质的发现和疾病分子诊断 的基础；
分子克隆中，下游的处理和分析鉴定，基因工 程产品的制备，也需要蛋白质的分离和纯化。
蛋白质分离纯化的总目标是增加制品的纯度，以 增加单位蛋白质重量中靶蛋白的含量或生物学活性 以达到目的，即从蛋白混合物中设法去除不要的杂蛋白和
凝胶色谱的机理是分子筛效应，在洗脱过程中， 大分子不能进入凝胶内部，而沿凝胶颗粒间的空 隙最先流出柱外；而小分子可以进入凝胶颗粒内 部的多孔网状结构，路径长、流速慢，以至最后 流出柱外。因此，混合样品如同“过筛”一样， 因分子大小的不同得以彼此分开。
它具有分离条件温和，产品收率高，生物活 性好，分离面宽等优点，广泛用于蛋白质或多肽 物质的分离纯化中。
对分离物的要求：在介质中必须带电。
7.1凝胶电泳
主要介绍聚丙烯酰胺凝胶电泳
7.1.1原理：不同带电粒子在同一外加电场作用下泳 动的速度是不同的，泳动度取决于带电颗粒的性质， 颗粒所带净电荷越多、直径越小，越接近球形、泳 动速度越大。
生物大分子分离纯化技术(159页)
F1 平衡作用
分离主要的
依
据
极性、 位阻因素 离子性质 分子大小 极性因素
分子大小 极性因素
离子性质 离子性质
离子性质 分子大小 离子性质 离子性质
分子大小 离子性质
分子大小 分子大小 分子大小
分子大小 形状
分子大小 分子大小 介质密度
（细胞外液）
（细胞内液） 发酵液→预处理→细胞分离→细胞破碎→碎片分离→提取 → 精制 → 成品制作
静电引力，极化度分子筛效应
扩散，偶极作用， 缔合和解离效应 渗透作用, 渗透，缔合和解离效应
分子摩擦力，极化度动电作用 分子摩擦力，极化度动电作用， 表面能 分子筛效应
分子摩擦效应
分子筛效应
电动力 分子筛效应 分子筛效应，表面能（吸附） 分子摩擦效应
扩散
分子摩擦效应
占优势的 作用力
F2 F2 F2 F2 F2 F1 F1 F1和F2 平衡作用 F1 F1和F2
分离纯化是整个生化制备过程的核心部分。生 物体的组成成分千千万万种，分离纯化的实验方案 也千变万化。没有一种分离纯化方法可适用于所有 物质的分离纯化，一种物质也不可能只有一种分离 纯化方法。所以对于某一种物质，究竟选用什么分 离纯化方法最理想，主要是根据该物质的物理化学 性质和具体实验条件而定。认真参考借鉴前人经验 可以避免许多盲目性，节省实验摸索时间。即使是 分离一个新的未知组分，根据分析和预试验的初步 结果，参考别人对类似物质分离纯化经验，也可以 帮助少走弯路。
五．结晶
六．沉降 （a）动力学的 （b）等密度的
生化分离方法分类表
推 动 力 F1
流体动力
流体动力
流体动力
流体动力 机械作用
生物大分子的分离纯化方法
生物大分子的分离纯化方法由于生物体的组成成分是如此复杂，数千种乃至上万种生物分子又处于同一体系中，因此不可能有一个适合于各类分子的固定的分离程序，但多数分离工作关键部分的基本手段是相同的。
为了避免盲目性，节省实验探索时间，要认真参考和借鉴前人的经验，少走弯路。
常用的分离纯化方法和技术有：沉淀法（包括：盐析、有机溶剂沉淀、选择性沉淀等）、离心、吸附层析、凝胶过滤层析、离子交换层析、亲和层析、快速制备型液相色谱以及等电聚焦制备电泳等。
本章以介绍沉淀法为主。
1 沉淀法沉淀是溶液中的溶质由液相变成固相析出的过程。
沉淀法（即溶解度法）操作简便，成本低廉，不仅用于实验室中，也用于某些生产目的的制备过程，是分离纯化生物大分子，特别是制备蛋白质和酶时最常用的方法。
通过沉淀，将目的生物大分子转入固相沉淀或留在液相，而与杂质得到初步的分离。
此方法的基本原理是根据不同物质在溶剂中的溶解度不同而达到分离的目的，不同溶解度的产生是由于溶质分子之间及溶质与溶剂分子之间亲和力的差异而引起的，溶解度的大小与溶质和溶剂的化学性质及结构有关，溶剂组分的改变或加入某些沉淀剂以及改变溶液的pH值、离子强度和极性都会使溶质的溶解度产生明显的改变。
在生物大分子制备中最常用的几种沉淀方法是：⑴中性盐沉淀（盐析法）：多用于各种蛋白质和酶的分离纯化。
⑵有机溶剂沉淀：多用于蛋白质和酶、多糖、核酸以及生物小分子的分离纯化。
⑶选择性沉淀（热变性沉淀和酸碱变性沉淀）：多用于除去某些不耐热的和在一定pH值下易变性的杂蛋白。
⑷等电点沉淀：用于氨基酸、蛋白质及其他两性物质的沉淀，但此法单独应用较少，多与其他方法结合使用。
⑸有机聚合物沉淀：是发展较快的一种新方法，主要使用PEG聚乙二醇（Polyethyene glycol）作为沉淀剂。
1.1 中性盐沉淀（盐析法）在溶液中加入中性盐使生物大分子沉淀析出的过程称为“盐析”。
除了蛋白质和酶以外，多肽、多糖和核酸等都可以用盐析法进行沉淀分离，20％～40％饱和度的硫酸铵可以使许多病毒沉淀，43％饱和度的硫酸铵可以使DNA和rRNA 沉淀，而tRNA保留在上清。
生物大分子的分离纯化技术
溶液的澄清 微量沉淀物的收集 细菌细胞的收集
精品课件
盐析
基本原理：
在盐浓度很低时，蛋白质的溶解度随盐浓度的升高而 增加，这称为盐溶；随盐浓度不断增加，蛋白质的溶解度 不断降低而沉淀析出，即盐析。
盐析实验应注意的问题：
盐类的选择：硫酸铵 （767g/l, 25℃)
盐的饱和度：
温度：室温或4℃
不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳 (盘状电泳) 电荷效应 浓缩效应 分子筛效应
精品课件
不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳
精品课件
聚丙烯酰胺凝胶电泳的应用
SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质的分子量
1% SDS+ 0.1 M 巯基乙醇 分子量1.0×104~2.0×105
蛋白质的等电聚焦(Isoelectric Focusing, IEF) 原理 pH梯度的形成与保持
毛细管凝胶电泳
（Capillary Gel Electrophoresis, CGE)
毛细管等电聚焦
（Capillary Isoelectric Focusing, CIEF)
纤维透析管的处理: 1%乙酸水溶液 1h, 碱性EDTA (1% Na2CO3, 1 mM EDTA) 煮1h, 纯水清洗,保存.
透析液: 水, 缓冲液, 高分子的浓溶液
Donnan效应: pH变化
(勤换透析液,使用大量的透析液)
精品课件
Donnan效应:
精品课件
微过滤
微过滤的类型:
深层滤器(Depth Filter) : 滤膜滤器(Screen Filter):纤维素醋酸酯(硝酸酯)
生物大分子的分离纯化技术
生物样品的特点: 生物活性 复杂性
内容: 生物样品的常规分离纯化方法 临床及生化分析样品的预处理 生物大分子的电泳分离纯化技术 生物大分子的色谱分离纯化技术
生物大分子分离纯化技术之层析(色谱)技术(56页)
生物大分子分离纯化技术
当流动相中所含的混合物经过固定相就会与固定 相发生作用。由于混合物中各组分在结构和性质上存 在差异，它们与固定相发生作用的大小、强弱就有差 异。因此，在同一条件下，不同组分在固定相中滞留 时间不同，从而按先后不同次序从固定相中流出。这 种借在两相间分配的原理而使混合物中各组分离的技 术，称为色谱分离技术或色谱法，又称色层法、层析 法。
生物大分子分离纯化技术
塔板理论是基于热力学近似的理论，在真实 的色谱柱中并不存在一片片相互隔离的塔板，也 不能完全满足塔板理论的前提假设。如塔板理论 认为物质组分能够迅速在流动相和固定相之间建 立平衡，还认为物质组分在沿色谱柱前进时没有 径向扩散，这些都是不符合色谱柱实际情况的， 因此塔板理论虽然能很好地解释色谱峰的峰型、 峰高，客观地评价色谱柱地柱效，却不能很好地 解释与动力学过程相关的一些现象，如色谱峰峰 型的变形、理论塔板数与流动相流速的关系等。
液相色谱法开始阶段是用大直径的玻璃柱在室温及 常压下进行起来，又补充了气相色谱法的内 容。根据液相色谱的特点，可称做高效、高压、高速和现 代液相色谱法。液相色谱法不论在仪器还是柱填料方面均 发展很快。
生物大分子分离纯化技术
层析（色谱）法分类
样品中的离子与离子交换树脂上的离子的交换反应过程可用下式表示：
阳离子交换
树脂-SO3-H++M+ 阴离子交换
树脂-SO3-M++H+
树脂-NR3+Cl-+X- 树脂-NR3+X-+C1-
生物大分子分离纯化技术
(四)空间排阻色谱法 (五)亲和色谱法
生物大分子分离纯化技术
塔板理论
塔板理论是色谱学的基础理论， 塔板理论将色谱柱看作一个分馏塔，待 分离组分在分馏塔的塔板间移动，在每 一个塔板内组分分子在固定相和流动相 之间形成平衡，随着流动相的流动，组 分分子不断从一个塔板移动到下一个塔 板，并不断形成新的平衡。一个色谱柱 的塔板数越多，则其分离效果就越好。
生物大分子的分离纯化和鉴定
利用溶解度差异 进行分离纯化
利用电荷性质进 行分离纯化
利用生物活性进 行分离纯化
分离纯化的过程
分离纯化的目的：去除杂质， 获得高纯度的生物大分子
分离纯化的方法：沉淀法、色 谱法、电泳法等
分离纯化的原理：利用生物大 分子在物理性质、化学性质等 方面的差异进行分离
分离纯化的流程：样品制备、 粗分离、精制纯化、产物检测
高效液相色谱法：随着技术的不断改进， 液相色谱法的分离效果和鉴定准确性得到 显著提高。
毛细管电泳技术：具有高效、快速、高分 辨率的特点，成为生物大分子分离纯化的 重要手段。
质谱技术：随着蛋白质组学研究的深入， 质谱技术在生物大分子鉴定中发挥着越来 越重要的作用。
生物信息学方法：通过计算机技术对生 物大分子数据进行处理和分析，为生物 大分子的分离纯化和鉴定提供了有力支 持。
03
生物大分子的鉴定
鉴定方法
化学分析法：通 过化学反应对生 物大分子的组成 和结构进行分析。
免疫分析法：利 用抗体与抗原的 特异性结合，对 生物大分子进行 检测和识别。
生物活性测定法： 通过检测生物大 分子对细胞或生 物体的活性影响， 确定其结构和功 能。
分子生物学方法： 利用分子杂交、 PCR等技术对生 物大分子进行基 因水平和蛋白质 水平的鉴定。
随着新材料的出现和应用，将会有更多高效、低成本的分离纯化材料应用 于实际操作中。
人工智能和机器学习等先进技术的应用，将有助于提高生物大分子分离纯 化和鉴定的自动化程度和智能化水平。
生物大分子分离纯化和鉴定技术将与生物信息学、系统生物学等学科交叉 融合，形成更加全面和深入的研究和应用领域。
05
生物大分子分离纯化和鉴定的应用领域
酶工程：通过分离 纯化技术获取酶， 用于酶催化反应研 究和酶制剂的生产 。