_型胶原蛋白与弗氏完全佐剂大鼠关节炎模型的建立和比较

第7卷 第1期 中国实验动物学报 Vol.7No.1 1999年6月 Acta Laboratorium Animalis Scientia Sinica June,1999 型胶原蛋白与弗氏完全佐剂大鼠关节炎模型的建立和比较林 红 贺永怀* 黎 燕* 陆应麟* 沈倍奋*(中国协和医科大学 中国医学科学院药用植物研究所,北京)摘要 目的 对 型胶原蛋白(C -A)和弗氏完全佐剂(A-A)大鼠关节炎模型在大体外观和足部组织病理学切片等方面进行观察比较。

方法 分别采用 型胶原蛋白和弗氏完全佐剂诱导建立大鼠关节炎模型,利用排水法对大鼠足部体积进行测定,并将大鼠后足进行组织病理学切片观察。

结果 从大体外观和足部病理切片上两种大鼠模型均显示出有明显的病变,但C -A大鼠与A-A大鼠比较,滑膜增生及软骨破坏等继发性病变特征更为明显,关节炎持续时间也较长,更接近于人的类风湿性关节炎。

结论 C -A大鼠模型与A-A相比是研究RA较为理想的动物模型。

关键词 类风湿性关节炎 型胶原蛋白大鼠关节炎 弗氏完全佐剂大鼠关节炎类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis,RA)是以慢性多关节炎症为主要表现的全身性自身免疫性疾病,病因和发病机制尚未完全清楚。

在RA中,滑膜的持续性增生和软骨及骨的破坏是其重要的病理学特征。

RA的动物模型有多种,其中较为经典的是弗氏完全佐剂诱导的大鼠关节炎和 型胶原蛋白诱导的大鼠关节炎模型。

本文将对这两种大鼠关节炎模型的大体外观、足部肿胀程度以及组织病理学观察等方面进行比较研究,以选择更为理想的动物模型。

材料与方法1 实验动物 Wistar大鼠,雌性,4~6周龄,30只,由军事医学科学院动物中心提供。

2 主要试剂 牛源性 型胶原蛋白(C ollagen ,C ,from bovine nasal septum),酸可溶性,美国Sigma公司产品;弗氏不完全佐剂(Freund s Adjuvant Incomplete,FI A)美国Sigma公司产品;卡介苗(BCG)购于北京卫生部生物制品研究所。

3 大鼠关节炎的诱导方法型胶原蛋白诱导的大鼠关节炎模型的建立 参照文献!1∀的方法,将酸溶性 型胶原蛋白(collagen ,C )用弗氏不完全佐剂配成C 浓度为2 5mg ml的乳剂,按每只大鼠100 l乳剂含C 250 g,于左后足跖皮内注射致炎。

佐剂性关节炎的诱导按照常规方法!2∀:将卡介苗(B CG)于80#灭活1h,加入到弗氏不完全佐剂中(终浓度10mg ml),充分乳化混匀制成弗氏完全佐剂(FCA),每只大鼠注射100 l;用注射100 l生理盐水 只的大鼠作为正常对照组。

* 军事医学科学院基础医学研究所4 大鼠关节炎足体积的测定方法!3∀采用排水法测足部体积:在大鼠足部踝骨关节突出部位划一条线作为标记,用一特制量筒,灌满水后,将大鼠足部插入,使水面与踝骨上的标记处于同一界面,另用一个烧杯接从量筒侧口排出的水,测量排出水的体积,即为所测大鼠足部的体积,每只足每次测量重复5次。

5 大鼠足部病理切片制备乙醚麻醉引颈处死大鼠后,切取掌趾部,立即放入缓冲福尔马林溶液中固定,常规梯度乙醇脱水,石蜡包埋、切片,片厚约3~5 m,HE 染色观察。

结 果1 注射诱导后大鼠的外观变化随机将大鼠分成3组,每组10只,分别用于 型胶原蛋白诱导处理组(C -A)、弗氏完全佐剂诱导处理组(A-A)和正常对照组(Control)。

C 和FCA 注射诱导后第二天,大鼠注射足即有明显的肿胀,出现急性免疫反应。

第14~21d 后,C 诱导组大鼠对侧足出现红肿,至第35~45d 后,大鼠前足出现红肿,并有关节变形。

而A-A 大鼠则到注射后第18~25d 左右才出现对侧足的肿胀。

在两种关节炎大鼠中,C -A 大鼠关节炎的持续时间较长,到四个月后肿胀仍较明显。

A-A 大鼠至四个月后足部的肿胀则逐渐消退。

如图1~3。

图1 正常大鼠注射后第35天的外观图图2 A-A 关节炎大鼠注射后第35天的外观图2 中 国 实 验 动 物 学 报 第7卷图3 C 关节炎大鼠注射后第35天的外观图2 C 诱导关节炎的大鼠足体积改变用排水法测量大鼠足部体积,观察到注射后第14~21天C -A 大鼠后足体积有明显变化,C -A 大鼠的左后足和右后足体积大于正常对照组(P<0 05),至第35~45天后足的肿胀更为明显(P<0 01)。

(见表1)。

注射后第35天可以检测到C -A 大鼠的四足体积均显著大于正常对照组(P<0 01),(见表2),以上数据均用成组资料t 检验方法进行统计分析。

表1 不同时间C 大鼠左后足和右后足体积的变化足 体 积 (cm 3)注 射 后 天 数 (d)014 35 正常大鼠左后足1 19∃0 131 37∃0 051 64∃0 07正常大鼠右后足1 16∃0 041 33∃0 081 67∃0 06C 大鼠左后足(注射足)1 14∃0 162 59∃0 53*2 67∃0 42**C 大鼠右后足(对侧足)1 15∃0 101 86∃0 19*2 24∃0 38** * P<0 05 ** P<0 01 n=10表2 注射后35d C 大鼠四足体积的变化左后足(cm 3)右后足(cm 3) 左前足(cm 3) 右前足(c m 3) 正常大鼠1 67∃0 081 64∃0 070 59∃0 020 59∃0 01C 大鼠2 67∃0 42**2 24∃0 38**0 71∃0 06**0 73∃0 09****P<0 01 n=103 C -A 和A-A 发病情况的比较注射诱导后第2天两组大鼠的注射足均发生明显的肿胀,到第14~20天左右,C -A 组就出现对侧足的肿胀,而A-A 组则约在注射后第18~25天左右才出现对侧足的反应。

到注射后4个月,C -A 大鼠足部的红肿仍然维持,而A-A 大鼠足部的红肿则逐渐消退,说明具有一定的自限性。

C -A 与A-A 比较,肿胀关节比率、发病率等有明显差别(P<0 05),(见表3)。

表3 C 关节炎大鼠与佐剂性关节炎大鼠的比较组 别肿胀关节比率发病率C -A72 806 10A-A24 803 103第1期 型胶原蛋白与弗氏完全佐剂大鼠关节炎模型的建立和比较表中肿胀关节比率和发病率分别表示:肿胀关节比率= 每只大鼠四肢肿胀关节数每只大鼠四肢总关节数(=80)发病率= 出现对侧关节肿胀大鼠只数注射大鼠只数(=10)4 C -A 与A-A 大鼠足部病理切片的观察比较于注射后35d,引颈处死大鼠,切取四肢,置于缓冲福尔马林溶液中固定,石蜡包埋,切片,经HE 染色后,光镜下观察。

C -A 大鼠右后足(即对侧足)和前足病变关节中出现滑膜增生,可达6~8层,呈乳头状突起,细胞排列不规则,可见有淋巴细胞侵润,软骨面破坏呈锯齿状,有些软骨帽消失,严重的甚至炎性细胞已侵蚀到软骨中;在注射足(左后足)中则只观察到关节周围有大量的淋巴细胞侵润,分析可能左后足注射部位主要表现为注射免疫引起的炎性反应,而对侧足为继发性病变,呈现滑膜增生和软骨破坏等异常变化。

正常对照组大鼠足部切片未见炎性细胞侵润、滑膜增生和软骨破坏等异常改变如图4~8。

图4 正常大鼠后足病理切片,HE 染色,%25,无异常变化图5 A-A 大鼠左后足病理切片,HE 染色,%104 中 国 实 验 动 物 学 报 第7卷图6 A-A 大鼠右后足病理切片,HE 染色,%10图7 C -A 大鼠左后足病理切片,HE 染色,%25图8 C -A 大鼠右后足病理切片,HE 染色,%25,示滑膜增生5第1期 型胶原蛋白与弗氏完全佐剂大鼠关节炎模型的建立和比较6 中 国 实 验 动 物 学 报 第7卷讨 论临床上RA患者急性期病变出现急性炎症反应,关节肿胀,滑膜充血、水肿、组织疏松,慢性病变则表现为滑膜组织的不规则增厚,关节软骨破坏等,可以看出动物模型的病理改变与临床上的病变是相似的。

此外,我们在关节炎大鼠掌趾部的病理切片中观察到上述现象,这与RA多发于手足小关节,尤其是近侧指间关节、掌指关节、跖趾关节的特征是相一致的。

上述结果表明,我们所建立的C -A大鼠模型在病理学的变化上,接近人的类风湿性关节炎。

A-A 大鼠足部的病理切片中主要表现为大量炎性细胞侵润,而滑膜增生和软骨破坏则不如C -A 大鼠明显,这与文献的报道基本相同,佐剂性关节炎缺乏慢性病理过程,病变具有一定自限性。

参 考 文 献1 Seki N.J Immunol.1988,140(5)&14772 徐叔云,等 药理实验方法学 人民卫生出版社,第二版,1991:pp723-7253 马东来,等 中国实验动物学杂志,1995,7(3)&13Rheumatoid Arthritis Model in Rat Induced byType Collagen and Freund s Complete AdjuvantLin Hong,et al(Ins ti tute of Medicinal Plant Development Chi nese Academy of Medical Sciences,Beijing))Objective Type collagen-induced arthritis(C -A)in rats has been compared with Freund s complete adjuvant arthritis(A-A)about legs size and pathological examination.Methods The legs size in C -A and A-A rats was measured by water exclusion.The legs of the arthritis rats were taken and cut section for pathological exa mination.Results The legs size and pathological section showed tha t some aspects including duration of arthritis,synovial membrane proliferation and cartilage dama ge were more significant in rats with C -A than those with A-A.Conclusions Comparing with A-A arthri tis,C -A arthritis is a good animal model for rheumatoid arthritis.Key words Rheumatoid arthritis Animal model Type collagen。