分子标记技术PPT课件
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分子标记技术ppt课件
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分子标记的优越性表现为：（1）分子信息
是可遗传的，而只有在遗传上可传递的属性才能 提供评估系统发育的信息；（2）数量极多，遍 布整个基因组，可检测座位几乎无限；（3）分 子标记能提供共同的尺度；（4）分子数据能将
从共同祖先遗传下来的同源性和由于趋同进化从
不同祖先演变而来的相似性区分开来表现为中性， 不影响目标性状的表达；（5）任何生物有机质
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二、蛋白质标记
❖ 在蛋白质多态性研究基础上发展起来的分子标记 技术称为蛋白质标记，最常用的技术是蛋白质电 泳及与其配套的专一性染色，如曾经广为采用的 等位酶分析，是通过同一基因位点上不同等位基 因编码的同种酶的不同分子形式，使得酶谱分析 具有相关的遗传学意义，酶谱的变化反应了等位 基因和位点的变化。等位酶技术为植物的种群遗 传学和进化研究作出了重要的贡献。但由于等位 酶缺乏足够的变异，在技术上存在一定的局限性， 如今已逐渐被DNA标记所取代。
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探针的标记(labeling)
利用放射性同位素（32P-dCTP）等对探针 进行标记，以跟踪探针。
同位素标记：利用DNA聚合酶 （Klenow），在DNA复制的过程中，把32PdCTP合成到DNA片段上。
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预杂交
杂交液 + 鲑精DNA ( sheared salmon sperm DNA, SSS DNA )
杂交液: 20 X SSPE
250 ml
100 X Denhardt’s 50 ml
10% (w/v) SDS
50 ml
Make up to 1000 ml
65C保温，2小时以上。
常用分子标记技术原理及应用
单链制备
通过加热或化学方法 将双链DNA变性为 单链。
凝胶电泳
将单链DNA在聚丙 烯酰胺凝胶上进行电 泳，并观察迁移率变 化。
结果分析
通过比较正常和突变 DNA的迁移率，确 定是否存在基因突变。
应用实例
遗传病诊断
SSCP技术可用于检测与遗传病相关的 基因突变，如囊性纤维化、镰状细胞 贫血等。
肿瘤研究
特点
高分辨率、高灵敏度、可重复性和可 靠性，能够检测出微小的基因组差异 ，广泛应用于遗传育种、生物多样性 保护、人类医学等领域。
分子标记技术的应用领域
遗传育种
通过分子标记技术对动植物进行遗传资源鉴定、品种纯度 鉴定、遗传连锁分析和基因定位等，提高育种效率和品质。
生物多样性保护
利用分子标记技术对物种进行遗传结构和亲缘关系分析， 评估物种的遗传多样性和濒危程度，为保护生物多样性提 供科学依据。
人类医学
分子标记技术在人类医学中用于疾病诊断、药物研发、个 体化医疗等方面，有助于提高疾病的预防、诊断和治疗水 平。
常用分子标记技术简介
RFLP（限制性片段长度多态性）
SSR（简单序列重复）
利用限制性内切酶对DNA进行切割，产生 不同长度的片段，通过电泳和染色检测多 态性。
利用串联重复的DNA序列多态性进行标记 ，通过PCR扩增和电泳检测多态性。
分子标记辅助育种
利用AFLP技术标记控制重要性状 的基因，辅助育种者快速筛选具 有优良性状的个体。
植物分子生态学研
究
利用AFLP技术分析植物种群遗传 结构、物种演化和生态适应性等 方面的研究。
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SSR技术
原理
简单序列重复标记（SSR）是一种基于PCR的分子标记技 术，利用微卫星序列的重复单元进行扩增，通过检测等位 基因的长度多态性来识别基因组中的变异。
分子标记
DNA分子标记 分子标记
是指能反映基因组某种变异特征的DNA片段。 片段。 是指能反映基因组某种变异特征的 片段
因为生物各种性状的差异主要是遗传物质DNA的差异造成， 的差异造成， 因为生物各种性状的差异主要是遗传物质 的差异造成 因而通过DNA分子标记可以直接检测基因组的遗传变异，它 分子标记可以直接检测基因组的遗传变异， 因而通过 分子标记可以直接检测基因组的遗传变异 更能准确揭示同一物种内不同种、变种、品种、品系间个体 更能准确揭示同一物种内不同种、变种、品种、 的差异。
分子标记是指能反映生物个体多态性的生物 大分子。 大分子。
广义的分子标记包括两类， 广义的分子标记包括两类，即：同工酶标记和 DNA标记，狭义的分子标记仅指 标记， 标记。 标记 狭义的分子标记仅指DNA标记。 标记
同工酶标记
编也有其内在的局限性。 同工酶标记也有其内在的局限性。由于翻译后的 修饰作用、组织特异性和发育阶段性， 修饰作用、组织特异性和发育阶段性，特别是相 对较少的多态性位点， 对较少的多态性位点，使其在应用上受到一定的 限制。 限制。
微卫星DNA（Microsatellite）又称简单 （ 微卫星 ） 重复序列（ 重复序列（Simplified Sequence Repeats） ）
SSR广泛分布于真核生物基因组中，是一种 广泛分布于真核生物基因组中，是一种1~6 广泛分布于真核生物基因组中 个碱基组成的长度为几十个核苷酸的简单重复 序列，在重复序列的两端， 序列，在重复序列的两端，往往是相对保守的 限制性内切酶位点。 限制性内切酶位点。 可根据其两端特异序列设计引物通过PCR反应， 反应， 可根据其两端特异序列设计引物通过 反应 检测简单重复序列重复单位书不同的DNA区域 检测简单重复序列重复单位书不同的 区域 的多肽性。 的多肽性。
分子标记技术原理方法及应用-图文
分子标记技术原理方法及应用-图文一、遗传标记的类型及发展遗传标记(geneticmarker):指可追踪染色体、染色体某一节段、某个基因座在家系中传递的任何一种遗传特性。
它具有两个基本特征，即可遗传性和可识别性；因此生物的任何有差异表型的基因突变型均可作为遗传标记。
包括形态学标记、细胞学标记、生化标记和分子标记四种类型。
形态学标记：主要包括肉眼可见的外部形态特征，如：矮秆、紫鞘、卷叶等；也包括色素、生理特性、生殖特性、抗病虫性等有关的一些特性。
优点:形态学标记简单直观、经济方便。
缺点:(1)数量在多数植物中是很有限的;(2)多态性较差，表现易受环境影响;(3)有一些标记与不良性状连锁;(4)形态标记的获得需要通过诱变、分离纯合的过程，周期较长细胞学标记：植物细胞染色体的变异：包括染色体核型（染色体数目、结构、随体有无、着丝粒位置等）和带型（C带、N带、G带等）的变化。
优点:能进行一些重要基因的染色体或染色体区域定位。
缺点:(1)材料需要花费较大的人力和较长时间来培育，难度很大;(2)有些变异难以用细胞学方法进行检测生化标记：主要包括同工酶和等位酶标记。
分析方法是从组织蛋白粗提物中通过电泳和组织化学染色法将酶的多种形式转变成肉眼可辩的酶谱带型。
优点:直接反映了基因产物差异，受环境影响较小。
缺点:(1)目前可使用的生化标记数量还相当有限;(2)有些酶的染色方法和电泳技术有一定难度分子标记：主要指能反映生物个体或种群间基因组中某种差异特征的DNA片段，它直接反映基因组DNA间的差异，也叫DNA标记。
(1)数量多，高多态性，信息量大(2)与生长发育无关，取材不受限制(3)能明确辨别等位基因(4)均匀分布于整个基因组(5)选择中性，不影响目标性状的表达(6)检测手段简单、快速(7)成本低廉(8)稳定，重复性好(9)共显性遗传在遗传学研究中广泛应用的DNA分子标记已经发展了很多种，一般依其所用的分子生物学技术大致可以分为三大类：第一类是以分子杂交为核心的分子标记，包括RFLP、DNA指纹技术等，这类分子标记被称为第一代分子标记；几种主要的ＤＮＡ分子标记二、几种常见分子标记的原理及方法1.RFLP2.RAPD3.AFLP4.SSR5.ISSR6.SNP1.RFLP：RetrictionFragmentLengthPolymorphimbyBottein(1980)基本原理：物种的基因组DNA在限制性内切酶作用下，产生相当多的大小不等的片段，用放射性同位素标记的DNA作探针，把与被标记DNA相关的片段检测出来，从而构建出多态性图谱。
《分子标记技》PPT课件
a. OPA08-280bp; b OPA08-310bp; c OPA08-400bp
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RAPD标记的特征 Characteristics of RAPD
❖ ① 引物很短（10 base） ② 只有1种引物参与反应 ③ 引物在染色体上随机结合 ④ 退火温度低一般为35-37℃ ⑤ 当两引物在互补的模板DNA链上的结合 位点距离小于2.0kb便可扩增出该区域
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Examples of RFLP Analysis
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Examples of RFLP Analysis in Citrus
❖ By Cheng et al, 2003. (Published in PMBR) 华中农业大学柑橘课题组
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RAPD(随机扩增多态性DNA)
➢ 1986年，美国PE-Cetus公司 的Mullis等人发明了聚合酶链 反应（PCR）
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RAPD实验操作 Manipulation of RAPD
❖ 四、反应体系：在25ul反应体系中加入：
成分
体积（浓度）
模板DNA 随机引物
1ul (50ng) 1ul (约5pmol)
10xPCR Buffer
2.5ul
MgCl2
2ul
dNTP
1ul
Taq酶
1单位（U）
加ddH2O
至 25ul
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第一节 园艺植物遗传标记概述
一、遗传标记
➢遗传标记特点
1.多态性高，标记数目多，提供的信息量大； 2.共显性遗传，能区分纯合基因型和杂合基因型； 3.表现中性，不影响目标性状表达，与不良性状无 必然连锁；
第七章 分子标记辅助选择 PPT课件
第七章 分子标记辅助选择
一、质量性状的标记辅助选择 二、数量性状的标记辅助选择 三、标记辅助选择的应用研究 四、标记辅助选择的发展策略
➢选择是指在一个群体中选择符合要求的基因型。
➢传统育种通过表现型间接对基因型进行选择， 存在许多缺陷。
➢分子标记为实现对基因型的直接选择提供了可 能，通过对分子标记基因型的检测，就能获知目 标基因的基因型。
直接依据个体的基因型进行选择，即对每个 目标QTL利用其两侧相邻标记或单个紧密连锁 的标记进行选择，这是才真正的标记辅助选择。
数量性状QTL标记辅助选择的困难：初级定 位，效应小的QTL未被检测。
用3个相邻的连锁标记进行跟踪选择(保证QTL位于 目标区段内)
QTL位于染色体中部
QTL位于染色体末端
6、可提高回交育种效率
利用传统回交方法将一个野生种的优良基因转移 到栽培品种中，回交20代以上还有可能带有100个以 上的其它非期望基因。如果是数量性状位点（QTL） 的转移，由于上位效应问题和连锁累赘更为复杂，将 更加困难。
利用分子标记可以允许选择出那些含有重组染色 体（打破了连锁累赘）的个体，从而帮助减小不需要 的染色体片断，从而提高育种效率至少10倍以上。另 外，对隐性性状可以进行不间断的回交（传统回交中 是隔代回交），从而提高基因的回交转移速度。
2）、双标记选择
❖ 同时用两侧相邻的两个标记对目标基因
进行跟踪选择，可大大提高选择的正确
率。
M1 Q M2 ╳ m1 q m2
M1 Q M2 亲本型：比例高
M1 q M2 双交换型：比例低
在单交换间无干扰的情况下，在F2代通过选择 标记基因型MlM2/MlM2而获得目标基因型Q／Q的概 率为：
在两标记间的图距固定的情况下，r1＝r2(亦即目标 基因正好位于两标记之间的中点)为最坏的情形，这 时的选择正确率为最小。 在实际情况中，单交换间一般总存在干扰，使得双交 换概率更小，因而双标记选择的正确率要比理论期望 值更高。
一、质量性状的标记辅助选择 二、数量性状的标记辅助选择 三、标记辅助选择的应用研究 四、标记辅助选择的发展策略
➢选择是指在一个群体中选择符合要求的基因型。
➢传统育种通过表现型间接对基因型进行选择， 存在许多缺陷。
➢分子标记为实现对基因型的直接选择提供了可 能，通过对分子标记基因型的检测，就能获知目 标基因的基因型。
直接依据个体的基因型进行选择，即对每个 目标QTL利用其两侧相邻标记或单个紧密连锁 的标记进行选择，这是才真正的标记辅助选择。
数量性状QTL标记辅助选择的困难：初级定 位，效应小的QTL未被检测。
用3个相邻的连锁标记进行跟踪选择(保证QTL位于 目标区段内)
QTL位于染色体中部
QTL位于染色体末端
6、可提高回交育种效率
利用传统回交方法将一个野生种的优良基因转移 到栽培品种中，回交20代以上还有可能带有100个以 上的其它非期望基因。如果是数量性状位点（QTL） 的转移，由于上位效应问题和连锁累赘更为复杂，将 更加困难。
利用分子标记可以允许选择出那些含有重组染色 体（打破了连锁累赘）的个体，从而帮助减小不需要 的染色体片断，从而提高育种效率至少10倍以上。另 外，对隐性性状可以进行不间断的回交（传统回交中 是隔代回交），从而提高基因的回交转移速度。
2）、双标记选择
❖ 同时用两侧相邻的两个标记对目标基因
进行跟踪选择，可大大提高选择的正确
率。
M1 Q M2 ╳ m1 q m2
M1 Q M2 亲本型：比例高
M1 q M2 双交换型：比例低
在单交换间无干扰的情况下，在F2代通过选择 标记基因型MlM2/MlM2而获得目标基因型Q／Q的概 率为：
在两标记间的图距固定的情况下，r1＝r2(亦即目标 基因正好位于两标记之间的中点)为最坏的情形，这 时的选择正确率为最小。 在实际情况中，单交换间一般总存在干扰，使得双交 换概率更小，因而双标记选择的正确率要比理论期望 值更高。
分子标记技术
CAPACITY
RFLPs
HiSpeed sequ
DArT SNPs Multi-SSRs SRAP, TRAP SSRsAFLPs RAPDs
1985
1990
1995
2000
2 分子标记来源于DNA水平的突变
突变(Mutation)是指DNA水平的可遗传的变异，不
管这种DNA变异能不能导致可检测的表型或生化改 变，突变产生的变异是自然选择的基础，可遗传 的突变在群体中扩散从而产生多态性。
7. 近10年来，在人类基因组研究计划的 推动下，分子标记的研究与应用得到迅 速的发展。
分子标记的历史
第一代分子标记技术
RFLP （Restriction Fragment Length Polymorphism，限制性片段长度多态性）
第二代分子标记技术
RAPD（Random Amplified Polymorphic DNA，
RFLP
原理：
DNA
限制性内切酶酶切
电泳
转移到硝酸纤维素滤膜
同位素或非放射标记（如地高辛等）的探针杂交
胶片放射自显影，显示酶切片段大小
RFLP的应用
1.遗传学图的构建 结合RFLP连锁图， 任何能用RFLP探针检测出的基因及其 DNA片段都可以通过回交，快速有效地 进行转移。
2.基因定位 利用RFLP技术能够准确地 标记定位种质中的目标基因，结合杂交， 回交及组织培养等技术就可以快速有效的 将所需目标基因的DNA片段引入栽培品 种中，实现品种改良。
都有害； ✓ 探针的制备、保存和发放也很不方便； ✓ 分析程序复杂、技术难度大、费时、成本高。
2.随意扩增多态性DNA标记—RAPD
Random Amplified Polymorphismic DNA
分子标记技术的类型原理及应用 ppt课件
优点 缺点
准确、直观 技术非常复杂
PPT课件
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复旦大学
简单序列重复(SSR)
简单序列重复(SSR)即微卫星DNA
微卫星是指以少数几个核苷酸( 1~ 6 个) 为单位 多次串联重复的DNA序列。
微卫星由核心序列和两侧的保守侧翼序列构成
。保守的侧翼序列使微卫星特异地定位于染色体某
一区域，核心序列重复数的差异则形成微卫星的高
2.扩增片段经琼脂糖凝胶电泳或聚丙烯酰胺电泳分
离；
3.溴化乙锭染色或银染等专一性染色技术即可记录
RAPD 指纹；
4.进行DNA 多态性分析。 PPT课件
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复旦大学
随机扩增多态性DNA(RAPD)
RAPD所用的一系列随机引物其序列各不相同， 结合位点不同，扩增得到的DNA片段的区域不同。
如果基因组的这些区域发生DNA片断或碱基的 插入、缺失等突变， 就可能导致这些特定结合位 点、扩增片断发生相应的变化。而使RAPD扩增产 物在电泳图谱中DNA带数增加、减少或片断长度 发生相应变化。从而可以检测出基因组DNA在这 些区域的多态性。
缺点
标记技术需要酶切, 对DNA 质量要求高；
RFLP 的多态性程度偏低；
分子杂交时会用到放射性同位素，对人体和环境
都有害；
探针的制备、保存和发放也很不方便；
分析程序复杂、技术难度大、费时、成本高。
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复旦大学
染色体原位杂交(CISH)
染色体原位杂交在原位杂交技术中应用最广泛 ，它是一种基于Southern 杂交的分子标记技术。
PPT课件
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复旦大学
3.通过接头序列和PCR引物3’末端的选择性碱基的 识别，扩增那些两端序列能与选择性碱基配对的 限制性酶切片段； 4.通过聚丙烯酰胺凝胶电泳，将特异的限制性片段 分离开来； 5.然后利用成像系统和分析软件检测凝胶上DNA 指纹的多态性。
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分子标记的选择
❖ 理想的分子标记应该符合的标准是：多态性高； 共显性遗传，在二倍体生物中能区分纯合与杂合 状态；在基因组中频繁出现，甚至贯穿分布于整 个基因组；选择中性；容易获得；容易操作，自 动化程度高；重复性好；所获得的数据能进行交 流和比较。
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二、蛋白质标记
❖ 在蛋白质多态性研究基础上发展起来的分子标记 技术称为蛋白质标记，最常用的技术是蛋白质电 泳及与其配套的专一性染色，如曾经广为采用的 等位酶分析，是通过同一基因位点上不同等位基 因编码的同反应了等位 基因和位点的变化。等位酶技术为植物的种群遗 传学和进化研究作出了重要的贡献。但由于等位 酶缺乏足够的变异，在技术上存在一定的局限性， 如今已逐渐被DNA标记所取代。
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分子标记的优越性表现为：（1）分子信息
是可遗传的，而只有在遗传上可传递的属性才能 提供评估系统发育的信息；（2）数量极多，遍 布整个基因组，可检测座位几乎无限；（3）分 子标记能提供共同的尺度；（4）分子数据能将 从共同祖先遗传下来的同源性和由于趋同进化从 不同祖先演变而来的相似性区分开来表现为中性， 不影响目标性状的表达；（5）任何生物有机质 包括动物、植物和微生物有许多共同的分子属性， 因此分子数据可提供共同尺度来直接比较任何有 机体任何分类层次之间相对水平的遗传变异 ； （6）分子标记技术可应用于各个生物门类，并 都可用于比较和综合分析。
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第二类是以聚合酶链式反应（Polymerase chain reaction ,简称PCR反应）为核心的分子标记技术，包 括：
★随机扩增多态性DNA标记（Random amplification polymorphism DNA, 简称RAPD标记）；
★简单序列重复标记（Simple sequence repeat, 简称SSR标记） 或简单序列长度多态性（Simple sequence length polymorphism, 简称SSLP标记）；
★扩展片段长度多态性标记（Amplified fragment length polymorphism, 简称AFLP标记）；
★序列标签位点（Sequence tagged sites, 简称STS标记）；
★序列特征化扩增区域（Sequence charactered amplified region, 简称SCAR标记）等；
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三、DNA分子标记的种类
分子标记大多以电泳谱带的形式表现，大致可 分为三大类。
第一类是以分子杂交为核心的分子标记技术， 包括：
★限制性片段长度多态性标记（Restriction fragment length polymorphism, 简称RFLP标记）；
★ DNA指纹技术（DNA Fingerprinting）； ★原位杂交（in situ hybridization）等；
生物体样品的选取
动植物生物体由不同的器官和组织构成。应 选用生物体中生长旺盛的器官、组织和细胞提取 DNA，如植物幼苗或新长出的叶片、动物的血等。 DNA提取的效果由DNA的质量和得率来评价。选用 适当的生物器官和组织是获得高质量和高得率 DNA的保证。取样后应尽快在低温中保存，长时 间保存应在超低温中保存。
第一讲 分子标记技术
一、分子标记的概述
❖ 广义的分子标记(molecular marker)是指可遗传的 并可检测的DNA序列或蛋白质。
❖ 蛋白质标记包括种子贮藏蛋白和同工酶（指由一 个以上基因位点编码的酶的不同分子形式）及等 位酶（指由同一基因位点的不同等位基因编码的 酶的不同分子形式）。
❖ 狭义的分子标记概念只是指DNA标记，而这个界 定现在被广泛采纳：能反映生物个体或种群间基 因组中某种差异特征的DNA片段，它直接反映基 因组DNA间的差异。
（2）数量极多，遍布整个基因组，可检测座位 几乎无限；
（3）多态性高，自然界存在许多等位变异，无 须人为创造；
（4）表现为中性，不影响目标性状的表达；
（5）许多标记表现为共显性的特点，能区别纯 合体和杂合体。
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五、常用的分子标记
第一类分子标记 以分子杂交为核心的分子标记技术
一）限制性片段长度多态性标记（Restriction fragment length polymorphism, RFLP）
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❖ DNA指纹分析研究是一种重要的分子标记技术， 它包括RFLP（restriction fragment length polymorphism）、RAPD（randomly amplified polymorphic DNA）、AFLP（amplified fragment length polymorphism）、SSR（simple sequence repeat）和ISSR（inter-simple sequence repeat）等 这些在PCR基础上发展起来的检测DNA多态性的 分子标记技术。
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第三类是一些新型的分子标记，如：
★单核苷酸多态性（Single nuleotide polymorphism, 简称SNP标记）；
★表达序列标签（Expressed sequences tags, 简称EST标记）等。
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四、分子标记的特点
（1）直接以DNA的形式表现，在生物体的各 个组织、各个发育阶段均可检测到，不受季节、 环境限制，不存在表达与否等问题；
该技术由Grodzicker等于1974年创立。 由于DNA分子中限制性内切酶酶切识别序列中 出现碱基的插入、缺失、置换、倒位而导致酶切位 点的增减所引起的基因型限制性片段长度的差异。
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基本原理
❖ 基因组DNA用已知的限制性内切酶消化后，产生 许多大小不等的DNA片段，电泳分离、Southern 印迹转移到硝酸纤维膜上，用放射性标记的探针 与膜上变性的酶切DNA进行杂交，放射自显影， 即可显示出不同材料的多态性图谱，即显示出所 分析的DNA序列间的RFLP。
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❖ 基本步骤：
DNA提取→用DNA限制性内切酶消化
→凝胶电泳分离限制性片段
→将这些片段按原来的顺序和位置转移到易操作
的滤膜上
→用放射性同位素或非放射性物质标记的DNA作
探针与膜上的DNA杂交（称 Southern杂交）
→放射性自显影或酶学检测显示出不同材料对该
探针的限制性酶切片段多态性。
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