大肠杆菌与沙门氏菌鉴定
猪大肠杆菌猪沙门氏菌
猪大肠杆菌&猪沙门氏菌猪大肠杆菌：猪大肠杆菌病是由大肠杆菌引起的肠道传染性疾病，主要侵害仔猪和断奶后的小猪，常引起严重腹泻、脑水肿、生长缓慢和死亡。
由于病原菌的类型不同以及猪的日龄、个体差异、发病率和症状不同该病主要分为三种：即仔猪黄痢、白痢和猪水肿病。
1仔猪黄痢1.1流行病学该病常发生于一周龄以内仔猪，以1-3日龄的仔猪多发。
带菌母猪是主要传染源，由粪便排出病原体，仔猪由于吸乳和到处乱舔，经消化道感染。
该病的发生无季节性，死亡率可达90%以上。
1.2临床症状仔猪出生后12小时内突然有1-2头出现衰弱、昏迷症状，并很快死亡。
接着有的仔猪排黄色稀粪，很快变成水样，具腥臭味。
每小时排粪数次，严重时肛门松弛，排粪失禁，清瘦，脱水，眼球下陷，昏迷死亡。
1.3病理变化皮肤苍白，肠道黏膜充血、出血，以十二指肠显著。
1.4诊断与防治⑴诊断根据发病以3日龄以内初生仔猪为主，排出黄色水样稀便，明显脱水，消瘦，发病率和死亡率都很高，可诊断为该病。
⑵防治①科学免疫：临产前用大肠杆菌疫苗注射母猪，15天、30天各免疫1次。
仔猪出生后及早让其吃上初乳，仔猪可通过吸食母乳获得母源抗体得到保护。
②产房严格消毒，保持干燥、洁净、温暖、通风良好，防止有害气体产生。
③一旦有病猪出现，应立即全窝给予庆大霉素、痢特灵、黄连素、磺胺脒等药物治疗。
2仔猪白痢2.1流行病学常发生于10-30日龄的仔猪，以20日龄以内仔猪多见，日龄越小死亡率越高。
该病的发病与外界环境相关，如气候突变、多雨潮湿、饲料变质或突然变换饲料，以及母乳缺乏或过浓，都可促进该病的发生。
2.2临床症状仔猪排乳白色或灰白色稀粪，呈糨糊状，具腥臭味。
病情加重则表现结膜和皮肤苍白，机体脱水消瘦，最后衰竭而死亡。
大肠杆菌和沙门氏菌的分离鉴定方案
大肠杆菌和沙门氏菌的分离鉴定方案实验原理：1、大肠杆菌的性质：大肠杆菌是G--无芽孢直杆菌，在大多数培养基上表现出不同的特性。
在麦康凯琼脂平板上是凸起光滑湿润的粉红菌落，革兰氏染色镜检为红色短杆菌。
三糖铁琼脂上的反应为斜面和底部都变黄，产气，不产生硫化氢。
生化特性为发酵葡萄糖、乳糖、甘露醇、麦芽糖，不发酵蔗糖。
MR试验，吲哚试验为阳性，VP试验为阴性，不产生H2S，不能利用枸椽酸盐。
半固体中沿穿刺线向四周生长。
2、沙门氏杆菌的性质：沙门氏杆菌是G-直杆菌。
在麦康凯平板上为细小半透明、圆形、无色小菌落，三糖铁斜面下层变黄色，上层仍为红色，穿刺处为变黑产生H2S。
能发酵葡萄糖产酸产气，能利用枸椽酸盐，不发酵乳糖不利用蔗糖肌醇，MR阳性，VP阴性，不产吲哚，不分解尿素。
实验材料：含有大肠杆菌和沙门氏菌的猪肝脏、培养基（琼脂平板培养基、三糖铁琼脂斜面培养基、麦康凯琼脂、生化培养基、SC）、器械（剪刀、记号笔、接种环、酒精灯、显微镜、试管、玻片、培养皿）、药品（消毒酒精、结晶紫、碘液、酸酒精、品红、松柏油）实验内容及操作程序：一、培养基制备：制备普通琼脂培养基、麦康凯平板、SC增菌培养基、生化培养基，制备方法见附1.二、标本制备：（1）取新鲜猪肝脏一小块，火焰表面消毒。
（2）用浸过消毒液的剪刀剪开一个小口于消过毒的猪肝脏。
（3）用接种环在剪开的肝脏小口沾取肝脏液，分别画线于麦康凯培养基和接种于SC中，37°C恒温培养24小时。
三、细菌分离培养：（1）取出培养了24小时的麦康凯平板。
挑选麦康凯平板上的凸起光滑湿润的粉红菌落染色镜检，看是否为红色短杆菌，若是，即疑似为大肠杆菌，则取其接种于另一麦康凯平板，37°C 恒温培养24小时。
（2）取出培养了24小时的SC增菌培养基，染色镜检，看是否有疑似沙门氏菌，有则取其中细菌画线接种于麦康凯平板上，37°C恒温培养24小时。
四、细菌的鉴定纯化：（1）检查疑似大肠杆菌的培养基是否长满了粉红色菌落，染色镜检。
大肠杆菌和沙门氏菌的分离鉴定方案
实验原理：1、大肠杆菌的性质:大肠杆菌是G无芽抱直杆菌，在大多数培养基上表现出不同的特性。
在麦康凯琼脂平板上是凸起光滑湿润的粉红菌落，革兰氏染色镜检为红色短杆菌。
三糖铁琼脂上的反应为斜面和底部都变黄，产气，不产生硫化氢。
生化特性为发酵葡萄糖、乳糖、甘露醇、麦芽糖，不发酵蔗糖。
MR试验，口引噪试验为阳性，VP试验为阴性，不产生H2S,不能利用xx酸盐。
半固体中沿穿刺线向四周生长。
2、沙门氏杆菌的性质：-沙门氏杆菌是G直杆菌。
在麦康凯平板上为细小半透明、圆形、无色小菌落，三糖铁斜面下层变黄色，上层仍为红色，穿刺处为变黑产生H2S。
能发酵葡萄糖产酸产气，能利用枸椽酸盐，不发酵乳糖不利用蔗糖肌醇，MR阳性，VP阴性，不产呵噪，不分解尿素。
实验材料：含有大肠杆菌和沙门氏菌的猪肝脏、培养基（琼脂平板培养基、三糖铁琼脂斜面培养基、麦康凯琼脂、生化培养基、SQ、器械（剪刀、记号笔、接种环、酒精灯、显微镜、试管、玻片、培养皿）、药品（消毒酒精、结晶紫、碘液、酸酒精、品红、松柏油）实验内容及操作程序：一、培养基制备：制备普通琼脂培养基、麦康凯平板、SC增菌培养基、生化培养基，制备方法见附1.二、标本制备：(1) 取新鲜猪肝脏一小块，火焰表面消毒。
(2) 用浸过消毒液的剪刀剪开一个小口于消过毒的猪肝脏。
(3) 用接种环在剪开的肝脏小口沾取肝脏液，分别画线于麦康凯培养基和接种于SC中，37 C恒温培养24小时。
三、细菌分离培养：(1) 取出培养了24小时的麦康凯平板。
挑选麦康凯平板上的凸起光滑湿润的粉红菌落染色镜检，看是否为红色短杆菌，若是，即疑似为大肠杆菌，则取其接种于另一麦康凯平板，37 C恒温培养24小时。
(2) 取出培养了24小时的SC增菌培养基，染色镜检，看是否有疑似沙门氏菌，有则取其中细菌画线接种于麦康凯平板上，37 C恒温培养24小时。
四、细菌的鉴定纯化：(1) 检查疑似大肠杆菌的培养基是否长满了粉红色菌落，染色镜检。
禽源大肠杆菌和沙门氏菌的分离鉴定与耐药性检测
李淑 芳 ，曹 慧 ，黄 燕霞 ，陈冬 杰 ，邹海鹏 ，迟 明 飞 ，陈伟垣 ，谢 文斌 （ 广东海洋大学动物 医学系，广东湛江 ５ ２ ４ ０ ８ ８ ）
摘 要 ：为 了解湛江 市禽源致病 菌大肠杆 菌和 沙门氏菌对 禽 肉产品 的污染程 度及其耐 药性 ，采集市售禽 肉中的肝脏样
３ ５ Ｅ． ｃ ｏ ｌ ｉ ｓ ｔ ｒ ａ ｉ ｎ ｓ ，７ ＥＨＥＣ Ｏ １ ５ ７ ：Ｈ７ ｓ ｔ ｒ ａ ｉ ｎ ｓ ａ ｎ ｄ ｌ １ Ｓ ａ ｌ ｍｏ ｎ ｅ ｌ ｌ ａ ｓ ｔ ｒ ａ ｉ ｎ ｓ ｗｅ ｒ ｅ ｉ ｄ ｅ ｎ ｔ ｉ ｉ ｆ ｅ ｄ ｂ ｙ ｂ ｉ ｏ ｃ ｈ ｅ ｍｉ ｃ ａ ｌ ｔ ｅ ｓ ｔ ． Ｔｈ ｅ ｉ ｓ ｏ ｌ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ｒ ａ ｔ ｅ ｏ ｆ Ｅ． ｃ ｏ ｌ ｉ ｗａ ｓ ４ ３ ． ２１ ％ ，ｔ ｈｅ ｉ ｓ ｏ ｌ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ｒ ａ ｔ ｅ ｏ ｆ Ｅ ＨＥ Ｃ ０ｌ ５ ７： Ｈ７ ｗａ ｓ ８ ． ６ ４ ％ ，ａ ｎ ｄ ｔ ｈ ｅ ｉ ｓ ｏ ｌ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ｒ ａ ｔ ｅ ｏ ｆ Ｓ ａ ｌ ｍｏ ｎ ｅ ｌ ｌ ａ ｗａ ｓ １ ３ ． ５ ８ ％． Ａ ｔ ｏ ａｌ ｔ ｏ ｆ ２ ｌ Ｅ． ｃ ｏ ｌ ｉ ｓ ｔ ｒ ａ ｉ ｎ ｓ ａ ｎ ｄ ｌ １ Ｓ ａ ｌ ｍｏ ｎ ｅ ｌ ｌ ａ ｓ ｔ ｒ ａ ｉ ｎ ｓ ｉ ｓ ｏ ｌ ａ ｔ ｅ ｄ ｉ ｎ
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沙门氏菌的检测方法
ＧｕｉｄｅｔｏＣｈｉｎｅｓｅＰｏｕｌｔｒｙ２００６年第２３卷第２４期禽业园地近年来，沙门氏菌食物中毒和动物感染沙门氏菌十分严重。
由肠炎沙门氏菌引起人的急性胃肠炎，在世界各国有增加的趋势，已成为国际公共卫生的一个重要课题。
沙门氏菌作为致病菌检测的一项重要指标，在公共卫生、食品卫生、畜牧兽医和出入境检验检疫中均有重要意义。
下面就对沙门氏菌的检测方法进行简单的介绍。
一常规方法从病料中分离培养为基础的常规方法，对这种方法的相关研究较多。
虽然该方法是迄今为止最确实的方法，但由于沙门氏菌常在肠系膜和膜淋巴结中而不在肠腔中出现等原因，故排泄到粪中去的细菌可以是间歇的和低密度的，所以有时必须重复分离并采取大量样品在增菌肉汤中培养。
此外，这种常规方法为确诊而进行的细菌学鉴定需要几人才能报告结果，因此该方法不够简便、准确和快速。
传统的沙门氏菌检测方法的改进内容主要集中在选择性培养基的选择上。
如由于沙门氏菌具有可特异性地分解丙烯乙二醇产酸，使中性红指示剂变红的生化特征，在分离培养基中加入丙烯乙二醇、５－溴－４－氯－３－吲哚－β－Ｄ呋喃半乳糖，可实现对沙门氏菌的分离与鉴定工作同步进行，使沙门氏菌检测所需时间从常规方法的４～６ｄ缩短至２ｄ；采用Ｓａｌｍｏｓｙｓｔ培养基进行增菌后，在Ｒａｍｂａｃｈ培养基上进行分离培养，可实现对沙门氏菌的快速检测，大大减少了检测中所需培养基种类，同时培养过程全部在３７℃下进行，操作简便。
二应用免疫酶标技术目前己有应用ＥＬＩＳＡ对猪沙门氏菌抗体进行检测的报道。
张艳红通过试验确定了快速检测肠炎沙门氏菌的竞争ＥＬＩＳＡ方法（Ｃ－ＥＬＩＳＡ）。
目前正在研制肠炎沙门氏菌特异性单克隆抗体Ｈｇｍ，两株单抗联合使用将会更准确地检测肠炎沙门氏菌。
杨爱萍的试验结果表明单抗直接ＥＬＩＳＡ法灵敏度高，特异性强，可避免人为因素造成的假阴性，且能在短时间内快速筛去大量的阴性样品。
检测时间比传统方法大为缩短，为加快产品流通提供了方便与可能。
大肠杆菌与沙门氏菌鉴定
大肠杆菌与沙门氏菌的鉴定08动检1班：魏静翟阿官李盼盼尚延丽田方方崔亚婷一、实验目的与要求1、通过本实验了解大肠杆菌及沙门氏菌的主要生化特性与培养特性2、掌握大肠杆菌与沙门氏菌的鉴别方法二、实验器材及试剂温箱、显微镜、载玻片、营养琼脂、接种环、灭菌平皿、麦康凯培养基、无菌试管、伊红美兰培养基、三糖铁培养基、革兰氏染色剂、棉签、火柴等三、实验内容1、直接镜检法：1）操作步骤：a）用棉签沾取适量样液直接涂在载玻片上b）用革兰氏染色剂染色c）显微镜下观察2）预期实验结果：a）大肠杆菌：大肠杆菌为革兰氏阴性菌，中等大小，两端略圆的短粗杆菌，成单个存在，也有成双排列；周身鞭毛，能运动，有时两端着色较浓，要注意与巴氏杆菌区分开来。
b）沙门氏菌：沙门氏菌也为革兰氏阴性菌，无芽孢，大小通常为0.7~1.5um*2.0~5.0um，菌端钝圆，散在，偶有短丝状，无荚膜，除鸡白痢沙门氏菌和鸡伤寒沙门氏菌外均有周身鞭毛，能运动，绝大多数菌株有菌毛。
2、分离培养法：将样液分别划线接种在麦康凯培养基、伊红美兰培养基上，温箱培养24h后观察生长情况，根据菌落的形态、颜色、大小等方面的差异来鉴别大肠杆菌和沙门氏菌。
1）麦康凯培养基（预期实验结果）：a）大肠杆菌：鲜桃红色或微红色，菌落中心呈深桃红色，圆形，扁平，边缘整齐，表面光滑，湿润；b）沙门氏菌：无色至浅橙色，透明或半透明，菌落中心有时为暗色。
2）伊红美兰培养基（预期实验结果）：a）大肠杆菌：紫黑色菌落，有的有金属光泽b）沙门氏菌：形态特征与在麦康凯培养基上的相似2、三糖铁培养基穿刺试验1）操作方法：将待检样液穿刺接种于三糖铁培养基中，培养18~24h后，取出观察2）预期实验结果：a）大肠杆菌：穿刺后不变黑，表面呈黄色b）沙门氏菌：穿刺底部有气体，穿刺后变黑，中间为黄色表面为红色3、乳糖发酵试验1）操作方法：将待检样液接种于乳糖发酵管内放于温箱内培养18h后，观察结果2) 预期实验结果：a）大肠杆菌：产酸产气b）沙门氏菌：不产酸产气。
大肠杆菌、沙门氏菌和志贺杆菌PFGE标准操作
福氏志贺菌
NotI
XbaI
SpeI
(50 U/sample) (50U/sample) (30U/sample)
8、用枪头吸出缓冲液 M，避免损伤胶块。 9、每管加入 200µl 混合液，轻轻在实验台上磕管子的底部，确保胶块在液面的 下面。 10、在 37℃水浴中孵育至少 2 小时。 步骤 5 加样
注：将酶置于冰上，用后立即放在－20℃保存。病原菌使用的限制性内切如表： 病原菌 第一种酶 （浓度） 大肠杆菌 O157 第二种酶 （浓度） 第三种酶 （浓度）
XbaI
(50U/sample)
BlnI/AvrII
SpeI
(30U/sample) (30U/sample)
非 O157 产志贺毒素 大肠杆菌 沙门氏菌
注：缓冲液要置于冰上。不同试剂供应商，相同试剂供应商的不同酶切缓冲液是 不通用的，所以应根据产品说明来配制缓冲体系，这里以 TaKaRa 为例。 3、 在每个 1.5ml 微量离心管中加入 200µl 缓冲液。 4、 小心地从 TE 中取出胶块放在干净的培养皿上。 5、 用刀片切下约 2mm 宽的胶块放入 1.5ml 微量离心管中。 确保胶块在液面下面。 将剩余的胶块放回原来的 TE 中。 6、将试管放在 37℃水浴中孵育 10-15 分钟。 7、在用稀释缓冲液孵育的过程中，以 XbalI 为例按照以下比例配制酶切反应体 系，混匀。 试剂 纯水 Buffer M BSA 酶（15U/µl） 总体积 µl/胶块 157µl 20µl 20µl 3µl 200µl µl/11 胶块 1727µl 220µl 220µl 33µl 2200µl
1、 确保电泳槽是水平的。如果不水平，调整槽底部的旋钮。 注：不要触碰电极。 2、 加入 2-2.2L 0.5×TBE,关上盖子。 3、 打开主机和泵的开关，确保泵设在－70（这时缓冲液的流速约 1L/分钟）和 缓冲液在管道中正常循环。
病料中可疑病原菌的分离
病料中可疑病原菌的分离、培养与鉴定病料：怀疑为大肠杆菌、沙门氏菌或葡萄球菌感染的鸡或鸭画线方法2.细菌的移植挑取平板中的单个菌落制菌片作G染色镜检确定单菌落接种普通琼脂和麦康凯斜面37℃ 24-48h生化鉴定细菌纯培养划线方法3.生化鉴定纯培养接种生理生化培养基37℃ 24-48h鉴定1.单糖发酵管接种：葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘露糖、蔗糖2. 生理生化培养基接种：(1)普通肉汤37℃ 24-48h生长观察及Indole试验(2)蛋白胨水37℃ 24-48h Indole 试验(3)葡萄糖蛋白胨水37℃ 24-48h MR/VP(4)三糖铁培养基37℃ 24-48h 观察底层/斜面是产酸,还是产碱，底层是否产气/H2S附:葡萄球菌形态染色：球形或稍呈椭圆形，直径1.0um左右，排列成葡萄状。
葡萄球菌无鞭毛，不能运动。
无芽胞，除少数菌株外一般不形成荚膜。
易被常用的碱性染料着色，革兰氏染色为阳性。
其衰老、死亡或被白细胞吞噬后，以及耐药的某些菌株可被染成革兰氏阴性。
培养特性：营养要求不高，在普通培养基上生长良好，在含有血液和葡萄糖的培养基中生长更佳，需氧或兼性厌氧，少数专性厌氧。
28~38℃均能生长，致病菌最适温度为37℃，PH为4.5~9.8，最适为7.4。
在肉汤培养基中24小时后呈均匀混浊生长，在琼脂平板上形成圆形凸起，边缘整齐，表面光滑，湿润，不透明的菌落。
不同种的菌标产生不同的色素，如金黄色、白色、柠檬色。
色素为脂溶性。
葡萄球菌在血琼脂平板上形成的菌落较大，有的菌株菌落周围形成明显的完全透明溶血环（β溶血），也有不发生溶血者。
凡溶血性菌株大多具有致病性。
生物学反应：多数葡萄球菌能分解葡萄糖、麦芽糖和蔗糖，产酸不产生气。
致病性菌株能分解甘露醇。
大肠杆菌大肠杆菌（Escherichia coli，E.coli）革兰氏阴性短杆菌，大小0.5×1～3微米。
周生鞭毛，能运动，无芽孢。
能发酵多种糖类产酸、产气。
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大
肠
杆
菌
与
沙
门
氏
菌
的
鉴
定
08动检1班：魏静翟阿官李盼盼
尚延丽田方方崔亚婷
一、实验目的与要求
1、通过本实验了解大肠杆菌及沙门氏菌的主要生化特性与培养特性
2、掌握大肠杆菌与沙门氏菌的鉴别方法
二、实验器材及试剂
温箱、显微镜、载玻片、营养琼脂、接种环、灭菌平皿、麦康凯培养基、无菌试管、伊红美兰培养基、三糖铁培养基、革兰氏染色剂、棉签、火柴等
三、实验内容
1、直接镜检法：
1）操作步骤：
a）用棉签沾取适量样液直接涂在载玻片上
b）用革兰氏染色剂染色
c）显微镜下观察
2）预期实验结果：
a）大肠杆菌：大肠杆菌为革兰氏阴性菌，中等大小，两端略圆的短粗杆菌，成单个存在，也有成双排列；周身鞭毛，能运动，有时两端着色较浓，要注意与巴氏杆菌区分开来。
b）沙门氏菌：沙门氏菌也为革兰氏阴性菌，无芽孢，大小通常为0.7~1.5um*2.0~5.0um，菌端钝圆，散在，偶有短丝状，无荚膜，除鸡白痢沙门
氏菌和鸡伤寒沙门氏菌外均有周身鞭毛，能运动，绝大多数菌株有菌毛。
2、分离培养法：
将样液分别划线接种在麦康凯培养基、伊红美兰培养基上，温箱培养24h后观察生长情况，根据菌落的形态、颜色、大小等方面的差异来鉴别大肠杆菌和
沙门氏菌。
1）麦康凯培养基（预期实验结果）：
a）大肠杆菌：鲜桃红色或微红色，菌落中心呈深桃红色，圆形，扁平，边缘整齐，表面光滑，湿润；
b）沙门氏菌：无色至浅橙色，透明或半透明，菌落中心有时为暗色。
2）伊红美兰培养基（预期实验结果）：
a）大肠杆菌：紫黑色菌落，有的有金属光泽
b）沙门氏菌：形态特征与在麦康凯培养基上的相似
2、三糖铁培养基穿刺试验
1）操作方法：
将待检样液穿刺接种于三糖铁培养基中，培养18~24h后，取出观察2）预期实验结果：
a）大肠杆菌：穿刺后不变黑，表面呈黄色
b）沙门氏菌：穿刺底部有气体，穿刺后变黑，中间为黄色表面为红色
3、乳糖发酵试验
1）操作方法：
将待检样液接种于乳糖发酵管内放于温箱内培养18h后，观察结果
2) 预期实验结果：
a）大肠杆菌：产酸产气
b）沙门氏菌：不产酸产气。