蛋白质的分离纯化1
蛋白质分离纯化的注意事项
蛋白质分离纯化的注意事项蛋白质分离纯化是生物学和生物化学研究中常用的一个步骤，它用于将混合的蛋白质溶液中的目标蛋白质分离出来并去除杂质。
蛋白质分离纯化的注意事项有很多，下面将详细介绍。
1. 样品的制备：蛋白质的分离纯化前，首先需要对样品进行合适的制备。
采集样品时要避免污染、破坏或降解蛋白质。
样品的pH、温度和离心速度等因素对蛋白质的稳定性有重要影响，因此需要根据实验需要进行适当的处理。
2. 分离纯化方法的选择：根据不同的蛋白质性质和研究目的，选择合适的分离纯化方法。
常用的方法包括离心法、沉淀法、过滤法、电泳法、层析法等。
在选择方法时要考虑到分离纯化的效果、时间、成本、操作难度等因素。
3. 分离纯化条件的优化：在选择分离纯化方法后，需要对实验条件进行优化。
例如，选择合适的缓冲液和pH，优化温度和离心速度，调整柱层析的流速和梯度，以及优化电泳条件等。
优化条件可以提高蛋白质的分离纯化效果。
4. 对蛋白质的保存和稳定性需小心处理：蛋白质容易受到温度、pH、氧化和降解等因素的影响而失活。
因此，在整个分离纯化的过程中，要注意进行低温处理，避免酶的降解和氧化反应的发生。
此外，还可以使用蛋白质稳定剂，如甘油、蔗糖或明胶等，来延长蛋白质的保存时间。
5. 删除杂质的步骤：蛋白质分离纯化的一个重要目标是去除杂质。
去除杂质的方法包括胶体沉淀、盐析、有机溶剂沉淀、离心沉淀等。
选择适当的去除杂质的方法，能够提高分离纯化的纯度。
6. 纯化后的保存：在完成蛋白质的分离纯化后，必须妥善保存纯化蛋白质。
纯化蛋白质容易受到冻融循环、氧化和结构变化等因素的影响，因此需要在低温下保存，并加入适当的保护剂以避免降解。
7. 纯度和活性的鉴定：对于蛋白质分离纯化后的样品，需要进行纯度和活性的鉴定。
常用的鉴定方法包括SDS-PAGE凝胶电泳、Western blotting、质谱分析、酶活分析等。
这些鉴定方法能够确定纯化蛋白质的纯度和活性，从而确定分离纯化的效果是否达到预期目标。
蛋白质的分离纯化方法
1、透析和超过滤 w利用蛋白质分子不能透过半透膜将其 与小分子物质分开 w半透膜为玻璃纸或纤维素材料
加
压
血液透析
血液
透析液
小分子溶出 小分子被带出
透析机
利用蛋白质分子不能穿越半透膜的性质,将蛋白提取液置 于透析袋中,透析袋置于纯水,蒸馏水,或缓冲液中,蛋白质 溶液中的小分子物质穿越半透膜,从而实现纯化蛋白质的 目的.
• 从离心管底部钻空,分段收集 样品,实现蛋白质分离
3、凝胶过滤
凝胶一般由葡聚糖制 成,含有很多微孔
小分子蛋白质进入微 孔内,因而滞流时间长
大分子蛋白质不能进 入微孔而径直流出
3、凝胶过滤
（二）利用溶解度差别的纯化方法
1.等电点沉淀 调整溶液pH 不同蛋白在各自 pI处依次沉淀
2.盐溶和盐析 3.有机溶剂分级分离法
w降低介电常数 w争夺水化膜
等电聚焦电泳
双向电泳
（三）利用电荷差异
离子交换层析 蛋白质按照在相应pH条
件下所带电荷的不同而 以不同的速率向下移动 带有更多负电荷的蛋白 质以更快的速率被洗脱 分段收集渗出液,实现蛋 白质的分离
（四）利用对配体的特异生物学 亲和力的纯化方法
具有பைடு நூலகம்强的专一性
亲和色谱颗粒
利用压力或离心力,强 行使水或其他小分子 溶质透过半透膜,而使 蛋白质留在膜上,以达 到纯化的目的(脱盐和 浓缩)
2、密度梯度离心
• 将蔗糖溶液加入离心管中进行 离心建立蔗糖梯度
• 仔细将蛋白质样品(混合物)加 入蔗糖梯度的顶端,再次离心 沉降
• 当蛋白质达到和自己相同的密 度梯度时停止移动
• 于是在不同的蔗糖梯度中存在 的蛋白质不同
蛋白质的分离纯化方法一
楚雄师范学院化学与生命科学系
范树国
2.聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）
3.毛细管电泳
楚雄师范学院化学与生命科学系
范树国
4.等电聚焦电泳
等电聚焦电泳法测定蛋白质pI
5.SDS-PAGE
6.离子交换层析
离子交换纤维素： 离子交换交联葡聚糖：兼有分子筛效应 离子交换交联琼脂糖：
楚雄师范学院化学与生命科学系
楚雄师范学院化学与生命科学系
范树国
普通电泳、等电聚焦、 双向电泳、脉冲电泳、 毛细管电泳 从电泳结果分：自由界 面电泳、区带电泳、盘 状电泳 从装置上分： 圆盘电 泳（柱状）、水平板电 泳、垂直板电泳。 从支持物分： 自由界 面电泳、纸电泳（或薄 膜电泳）、凝胶电 泳（ PAGE ，琼脂糖胶， 淀粉胶等）
沉降的速度与颗粒的重量、密度和形状有关。离心后按其沉降 的速度不同，彼此分开形成区带。再进行光学定位，针刺或冰 冻切片采样分析。
蔗糖密度梯度
聚蔗糖密度梯度
楚雄师范学院化学与生命科学系
范树国
3.凝胶过滤
交联葡聚糖（Sephadex）;聚丙烯酰胺凝胶（Bio-Gel P ）；琼脂糖凝胶（Sepharose，Bio-Gel A）
稳定蛋白质胶体溶液的主要因素 ①蛋白质表面极性基团形成的水化膜将蛋白质颗粒彼此隔开， 不会互相碰撞凝聚而沉淀。 ②两性电解质非等电状态时，带同种电荷，互相排斥不致聚集 而沉淀。
一旦电荷被中和或水化膜被破坏，蛋白质颗粒聚集，便从溶液 中析出沉淀。
楚雄师范学院化学与生命科学系
范树国
（二）蛋白质的沉淀
①盐析法 向蛋白质溶液中加入大量的中性盐[（NH4）2SO4、 Na2SO4、NaCl]，使蛋白质脱去水化层而聚集沉淀。 ②有机溶剂沉淀法 破坏水化膜，降低介电常数。 ③重金属盐沉淀 pH大于等电点时，蛋白质带负电荷，可与 重金属离子（Hg2+. Pb2+. Cu2+ 等）结成不溶性沉淀 ④生物碱试剂和某些酸类沉淀法 pH小于等电点时，蛋白质 带正电荷，易与生物碱试剂和酸类的负离子生成不溶性沉淀。 生物碱试剂：是指能引起生物碱沉淀的一类试剂，单宁酸、 苦味酸、钨酸。酸 类：三氯乙酸、磺基水杨酸。 ⑤加热变性沉淀 往往是不可逆的。
蛋白质的分离纯化(1)
白质的净电荷为零时的pH称等电点（pI）。
蛋白质等离子点： 没有其他盐类干扰时, 蛋白质质子供体基团解离出来
的质子数与质子受体基团结合的质子数相等时的pH称为等 离子点。
二、蛋白质的紫外吸收性质
蛋白质溶液能吸收一定波长的紫外光，主要是由带 芳香环的氨基酸决定的。其在280nm处对紫外吸收能力 的强弱顺序为：
电
电
泳
泳
方
方
向
向
等电聚焦电泳
SDS-PAGE
双向电泳后的凝胶经染色蛋白呈现二维分布图，水平方向反映 出蛋白在pI上的差异，而垂直方向反映出它们在分子量上的差别。
所以双向电泳可以将分子量相同而等电点不同的蛋白质以及等 电点相同而分子量不同的蛋白质分开。
5.层析聚焦(P310)
是根据蛋白质的等电点差异分离蛋白质混合物的柱层析方法。
(polyacrylaminde gel electrophoresis) 电泳
PAGE
样品浓缩成很薄的起始区带（0.1mm）
它以聚丙烯酰胺 凝胶为支持物，一般 制成凝胶柱或凝胶板 （不连续体系）。
浓缩胶 分离胶
凝胶的浓度（孔径大小）、 缓冲液组分和离子强度、 pH以及电场强度都是不同的
分离成单区带
依次洗脱收集后， 通过紫外吸收法测定吸 收峰。
这样大小不同的蛋白 质就被分离开来了。
（二）根据蛋白质溶解度不同的纯化方法
（蛋白质的胶体和沉淀性质）
主要方法： 1：等电点沉淀和PH值控制 2：蛋白质的盐溶和盐析 3：有机溶剂分级分离法 4：改变温度
1.等电点沉淀和PH值控制
即在不改变其它条件的情况下，PH处于等电点时的蛋白质 溶解度达到最低点。而位于等电点两侧的PH条件下蛋白质的溶
2009-1蛋白质的分离纯化)
目前经常使用的凝胶有
线形的 -1,6葡聚糖 交联葡聚糖 Sephadex 聚丙烯酰胺凝胶 (Bio-gel P) 1-氯-2,3-环氧丙烷
交联度大,网孔小,分级 分子量的范围偏窄,凝胶 颗粒吸水值也小,机械性 能好
商品名后的数字103为 该凝胶的排阻极限
丙烯酰胺(单体)
甲叉双丙烯酰胺(交联剂)
1、前处理：
动物材料：应先剔除结缔组织和脂肪组织
种子材料：应先去壳甚至去种皮以免受单宁等物质的污染， 油料种子：最好先用低沸点的有机溶剂如乙醚等脱脂。
组织和细胞的破碎
动物组织和细胞：
电动捣碎机（Waring blender） 匀浆器破碎 超声波处理（u1trasonication） 研磨的方法破碎 纤维素酶处理 超声波震荡 与砂研磨 高压挤压 溶菌酶处理（以分解肽聚糖）等
盐析沉淀的蛋白质保持着它的天然构象，能再溶解。
3、有机溶剂分级分离法
与水互溶的有机溶剂（如甲醇、乙醇和丙酮等）能使蛋白质 在水中的溶解度显著降低。 原因 改变了介质的介电常数
与蛋白质直接争夺水化水，致使蛋白质聚集而沉淀。
在室温下，这些有机溶剂不仅能引起蛋白质沉淀，而且伴 随着变性。
如果预先将有机溶剂冷却到−40℃至−60℃，然后在不
植物组织和细胞：
细菌细胞的破碎：
提取蛋白液
水溶性蛋白用中性缓冲溶液抽提， 酸性蛋白用稀碱性溶液抽提，
脂溶性蛋白用表面活性剂抽提等。
2、粗分级分离
盐析 方法 等电点沉淀 有机溶剂分级分离 蛋白质提取液体积较大，则可采用 超过滤 凝胶过滤 冷冻真空干燥 或其他方法（如聚乙二醇浓缩法） 特点 简便 处理量大 既能除去大量杂质（包 括脱盐），又能浓缩蛋 白质溶液
质存在于原液中，两次沉淀即可得到最大量的酶，而且由于在第
蛋白质的分离与纯化
（1）凝胶的选择：
。
（2）方法： 配置凝胶悬浮液：计算并称取一定量的凝胶浸泡于 中充分溶胀
后，配成
。
（3）凝胶色谱柱的装填方法
① 固定：将色谱柱处置固定在支架上
② 装填：将
一次性的缓慢倒入 内，装填时轻轻敲动色谱柱，
使凝胶填装均匀。
③ 洗涤平衡: 装填完毕后，立即用缓冲液洗脱瓶，在 高的操作压下，用
3、具体过程：
相对分子质量 较小的蛋白质
（1）
（2） （3） （4）
（5）
相对分子质量 较大的蛋白质
A B
A
的蛋白质由于
作用进入凝胶颗粒内部而被滞
留；
的蛋白质被排阻在凝胶颗粒外面，在了里之间
迅速通过。
B（1）
混合物上柱；
（2）洗脱开始，
的蛋白质扩散进入凝胶颗粒内；
的蛋白质被排阻于凝胶颗粒之外；
（3）
子
以及分子本身 、
的不同使带电分子产
生不同的
，从而实现样品中各种分子的分离。
3、分类： 琼脂糖凝胶电泳 聚丙稀酰胺凝胶电泳。
测定（ 蛋白质相对分子质量 ）通常用十二烷基硫酸钠（SDS）—聚丙稀酰胺凝胶
电泳。蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于它所带静电荷的多少以及分子的
大小等因素。为了消除静电荷对迁移率的影响可以在凝胶中加入
(4) 透析
2. 凝胶色谱制作
1）凝胶色谱柱的制作
① 取长40厘米，内径1.6厘米的玻璃管，两端需用砂纸磨平。
② 底塞的制作：打孔 挖出凹穴
安装移液管头部 覆
盖尼龙网，再用100目尼龙纱包好。
a、选择合适的的橡皮塞，中间打孔；
b、在橡皮塞顶部切出锅底状的 ，在0.5ml的 头部切
蛋白质分离纯化的一般程序
蛋白质分离纯化的一般程序可分为以下几个步骤:(一)材料的预处理及细胞破碎分离提纯某一种蛋白质时,首先要把蛋白质从组织或细胞中释放出来并保持原来的天然状态,不丧失活性。
所以要采用适当的方法将组织和细胞破碎。
常用的破碎组织细胞的方法有: 1. 机械破碎法这种方法是利用机械力的剪切作用,使细胞破碎。
常用设备有,高速组织捣碎机、匀浆器、研钵等。
2. 渗透破碎法这种方法是在低渗条件使细胞溶胀而破碎。
3. 反复冻融法生物组织经冻结后,细胞内液结冰膨胀而使细胞胀破。
这种方法简单方便,但要注意那些对温度变化敏感的蛋白质不宜采用此法。
4. 超声波法使用超声波震荡器使细胞膜上所受张力不均而使细胞破碎。
5. 酶法如用溶菌酶破坏微生物细胞等。
(二) 蛋白质的抽提通常选择适当的缓冲液溶剂把蛋白质提取出来。
抽提所用缓冲液的pH、离子强度、组成成分等条件的选择应根据欲制备的蛋白质的性质而定。
如膜蛋白的抽提,抽提缓冲液中一般要加入表面活性剂(十二烷基磺酸钠、tritonX-100等),使膜结构破坏,利于蛋白质与膜分离。
在抽提过程中,应注意温度,避免剧烈搅拌等,以防止蛋白质的变性。
(三)蛋白质粗制品的获得选用适当的方法将所要的蛋白质与其它杂蛋白分离开来。
比较方便的有效方法是根据蛋白质溶解度的差异进行的分离。
常用的有下列几种方法:1. 等电点沉淀法不同蛋白质的等电点不同,可用等电点沉淀法使它们相互分离。
2. 盐析法不同蛋白质盐析所需要的盐饱和度不同,所以可通过调节盐浓度将目的蛋白沉淀析出。
被盐析沉淀下来的蛋白质仍保持其天然性质,并能再度溶解而不变性。
3. 有机溶剂沉淀法中性有机溶剂如乙醇、丙酮,它们的介电常数比水低。
能使大多数球状蛋白质在水溶液中的溶解度降低,进而从溶液中沉淀出来,因此可用来沉淀蛋白质。
此外,有机溶剂会破坏蛋白质表面的水化层,促使蛋白质分子变得不稳定而析出。
由于有机溶剂会使蛋白质变性,使用该法时,要注意在低温下操作,选择合适的有机溶剂浓度。
蛋白质的分离纯化
蛋白质的分离纯化一，蛋白质（包括酶）的提取大部份蛋白质都可溶于水、稀盐、稀酸或碱溶液，少数与脂类结合的蛋白质那么溶于乙醇、丙酮、丁醇等有机溶剂中，因些，可采纳不同溶剂提取分离和纯化蛋白质及酶。
（一）水溶液提取法稀盐和缓冲系统的水溶液对蛋白质稳定性好、溶解度大、是提取蛋白质最常用的溶剂，通常用量是原材料体积的1-5倍，提取时需要均匀的搅拌，以利于蛋白质的溶解。
提取的温度要视有效成份性质而定。
一方面，多数蛋白质的溶解度随着温度的升高而增大，因此，温度高利于溶解，缩短提取时间。
但另一方面，温度升高会使蛋白质变性失活，因此，基于这一点考虑提取蛋白质和酶时一般采用低温（5度以下）操作。
为了避免蛋白质提以过程中的降解，可加入蛋白水解酶抑制剂（如二异丙基氟磷酸，碘乙酸等）。
下面着重讨论提取液的pH值和盐浓度的选择。
1、pH值蛋白质，酶是具有等电点的两性电解质，提取液的pH值应选择在偏离等电点两侧的pH 范围内。
用稀酸或稀碱提取时，应防止过酸或过碱而引起蛋白质可解离基团发生变化，从而导致蛋白质构象的不可逆变化，一般来说，碱性蛋白质用偏酸性的提取液提取，而酸性蛋白质用偏碱性的提取液。
2、盐浓度稀浓度可促进蛋白质的溶，称为盐溶作用。
同时稀盐溶液因盐离子与蛋白质部分结合，具有保护蛋白质不易变性的优点，因此在提取液中加入少量NaCl等中性盐，一般以摩尔。
升浓度为宜。
缓冲液常采用磷酸盐和碳酸盐等渗盐溶液。
（二）有机溶剂提取法一些和脂质结合比较牢固或分子中非极性侧链较多的蛋白质和酶，不溶于水、稀盐溶液、稀酸或稀碱中，可用乙醇、丙酮和丁醇等有机溶剂，它们具的必然的亲水性，还有较强的亲脂性、是理想的提脂蛋白的提取液。
但必需在低温下操作。
丁醇提取法对提取一些与脂质结合紧密的蛋白质和酶专门优越，一是因为丁醇亲脂性强，专门是溶解磷脂的能力强；二是丁醇兼具亲水性，在溶解度范围内（度为10%，40度为%）可不能引发酶的变性失活。
另外，丁醇提取法的pH及温度选择范围较广，也适用于动植物及微生物材料。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
避免极端的pH
造成蛋白化学成分的改变
高pH
一些氨基酸残基（Gln and Asn）的脱氨作用 丝氨酸及苏氨酸（Ser and Thr）残基的β－消去反应 肽键的部分水解 引起蛋白的沉淀及变性。 修饰的磷酸基团丢失.
低pH
缓冲液
选择一种缓冲液使其可以有效的覆盖想要pH范围。 一些缓冲液（如Tris-HCl）的pH可以发生改变。对
1.1 蛋白质(Proteins)的概念 1.2 蛋白质的理化特性 1.3 其它
1.1 蛋白质 （Proteins）
蛋白质由二十种标准氨基酸组成. 所有的氨基酸均有一共同的中心结构（α-碳原子）,并由
肽单位形成蛋白质的骨架.
氨基酸的侧链可以是非极性的，极性的，或者带电荷的.
Ala Val Ile Pro Phe Trp Met Gly Ser Thr Cys Tyr Asn Gln Lys Arg His Asp Glu
等电点沉淀能富集特定pI值的蛋白
相同pI值的分子可以聚集 反应由两个因素引发
疏水相互作用 偶极子相互作用
通过透析从而到达溶质交换-除去沉淀剂
•有各种不同截留分子量的透析膜——(3-100 kDa cut off).
•商业上也有到达脱盐及浓缩的离心透析装置
离心(Centrifugation)
去污剂能使蛋白变性而且 在细胞破碎以后必需除去.
压力破碎 （French Press）
细胞放在不锈钢的容器
中.压力破碎器配有一
合适的活塞,其在高压
下迫使细胞挤破后通过
底部的小孔.
匀浆(Homogenization)
细胞被置于一密闭的容器中
(常为玻璃).匀浆器配有一
非常合适的插头,通过其上
下及左右的往复运动来破碎
高级生物化学
——蛋白质的分离纯化（I）
邱晓挺
qiuxiaoting@
1. 蛋白质的背景介绍
2. 蛋白质分离、纯化的目的
3. 蛋白质(粗)分离:
(I)从细胞和组织 ——天然蛋白的提取
(II)表达蛋白的提取 4. 蛋白质的纯化－色谱(液相) Chromatography
1. 背景介绍
蛋白的溶解性依赖于离子强度
高离子强度可造成蛋白的聚集或沉淀 低离子强度能影响酶的稳定性
一些蛋白对一定的离子(Na+, K+, Cl-, SO42-)有选择性（偏好性） 0.1-0.2mol/L NaCl or KCl模拟生理状 况下的离子强度.
还原剂(Reducing agents)
细胞破碎(Cell Disruption)
化学破碎: 碱, 有机溶剂,去污剂 酶学手段: 溶菌酶, 葡聚糖酶,几丁质酶(常 适用于含细胞壁的细菌及植物细胞) 物理方法: 渗透压震荡, 冻溶 机械方法: 超声,匀浆,湿磨,压力
化学破碎（Chemical Disruption）
去污剂,如: Trition X100 能溶解细胞膜而使蛋 白透过细胞.
每个蛋白与盐浓度的相关溶解性曲线不尽相同 : Log S(mg/ml) = - Ks(ionic strength/2) ——Ks and are constants.
盐溶、盐析 （Salting In and Salting Out）
不同的盐对于蛋白的溶解性会有不同
(NH4)2SO4是蛋白盐析时最常用的试剂.
•丙酮,乙醇及甲醇也是非常好的脂溶性的溶剂
而被经常用在脱脂处理, 这些脱脂处理常常先
于蛋白的纯化.
•主要的不足之处——常导致蛋白的变性 • 聚乙二醇的运用可以克服这一不足.
等电点及pH沉淀
(Isoelectric Point and pH Precipitation).
•蛋白在与其pI相同 的pH环境中有最低的 溶解性
重组蛋白基因在大肠杆菌， 昆虫细胞， 哺乳动物细胞 或植物细胞中表达。
也用差速离心及色谱方法纯化。
在重组的蛋白中可以添加‘Tags’以便于纯化。
3.1
蛋白质粗分离:(I)从细胞和组织
——提 取
了解有关蛋白的必备知识
哪个物种合适？ 丰度及活力特点 大小，成本及物种的可获得状况 哪个组织合适? 对于特定的细胞哪个组织丰富 组织中哪种细胞中有这类蛋白 纯化过程中的作为应该与特定的方案相关 非常有益的信息 大小 组成
细胞碎片
Total Proteins
非目的蛋白
Analytical Tests
盐析 ——在高浓度时, 由于盐与H2O竞争结合蛋 白,添加盐常降低蛋白的溶解性 高盐会除去球形蛋白的溶剂分子从而造 成盐析(蛋白沉淀).
硫酸铵沉淀 （Ammonium sulfate precipitation ）
利用盐破坏离子相互 作用,且促进蛋白表面 的疏水相互作用
盐溶、盐析 (Salting in / Salting out)
水平离心机 (Swinging-Arm Centrifugation)
差速离心(Differential Centrifugation)
For example:
超滤(Ultrafiltration)
离心超滤
压滤
3.2 蛋白质(粗)分离:(II)表达蛋白
用生折叠为一特定的形状或者保持一定的 柔性。
多数蛋白的密度在1.3－1.4g/cm3 细胞经常添加磷酸基团,糖基及酰基等到侧链 上以改变蛋白的形状及活性。
1.2 蛋白质的理化特性
每个蛋白质均有特定的等电点. 由其可解离的侧链基团所决定——在一定的pH值 下，每个蛋白的荷电状况不尽一致
虽然很多蛋白质（水溶性的球蛋白）其大部分的 极性侧链基团（亲水基团）折叠在外部，但是其 表面仍有部分的疏水性区域。
1.3 其它
蛋白质是细胞生物功能的执行者 酶
细胞内外物质的运输
结构支撑物
免疫系统
细胞与细胞以及细胞与外界环境信息传递
2. 蛋白质分离、纯化的目的
活力的生化分析 蛋白的翻译后修饰（Post-translational modifications) 相互作用和蛋白的装配(Interactions and assembly) 三维结构(3-dimensional structure) 生物功能分析(Analysis of biological function) 药物开发(Drug development) ------
可加速蛋白的失活.
二硫苏糖醇(DTT) 储液—— -20℃
0.5-5.0mmol/L
Tris (2-carboxyethyl) phosphine
TCEP
蛋白酶抑制剂 （Protease inhibitors）
蛋白酶在动物组织及微生物中很普遍。 分离蛋白在较低的温度条件下（如4℃ ） 抑制剂的选择取决于何种蛋白酶的存在， PMSF(苯甲基磺酰氟)——对抗丝氨酸蛋白酶;
氧化作用会发生.半胱氨酸,甲硫氨酸及 色氨酸的氧化. 巯基还原剂经常被应用(1-10mM)
β-巯基乙醇（ β-mercaptoethanol） 二硫苏糖醇(DTT) 还原型的谷胱甘肽（Glu-Cys-Gly） TCEP
β-巯基乙醇: 5-20mmol/L , 储存液——4℃ !! 在加入buffer中24h内, β-巯基乙醇被氧化.其后
回收PCR产物并将基因克隆至表达载体
提取表达载体进行酶切鉴定是否含目的基因
Y 将表达载体转化至表达菌株 诱导表达目的蛋白
Harvest Cells
培养介质
Cell Disruption
Centrifugation Filtration Enzymatic Chemical Physical
Purification Steps Pure Protein
3. 蛋白质分离、纯化方法
离心(Centrifugation) 过滤(Filtration) 沉淀(Precipitation) 色谱(Chromatography) 电泳(Electrophoresis)∯
∯: 常用于小规模（分析目的）制备
策
略
从有机体中获得纯的蛋白 尽可能的用较少的步骤 尽可能少的丢失活力
此，必须小心，以免发生错误或变性你的蛋白。
应当在buffer所使用的温度下调节溶液的pH值
eg. Tris buffer
25℃
0℃
pKa
pKa
8.06
8.85
•保证缓冲液能与后续的过程（比如色谱）相容
•已知较好的非常有用的缓冲液(HEPES, PIPES, etc)。
离子强度（Ionic strength）
破碎细胞 沉淀 (丢弃)
上清 离心
细胞裂解
细胞裂解物： 蛋白,核酸及小分子
不需要的分子
多步纯化
纯蛋白
从组织细胞中进行蛋白分离流程图
组织破碎(Tissue disruption)
除去不要的组织 搅碎 匀浆（homogenization） 研磨(vessel for extraction)
理论上, 盐析时需要的盐的量直接与蛋白表面的电荷及非离 子的极性氨基酸相关. 沉淀想要的蛋白,必需的(NH4)2SO4的浓度源于实验的经验值. 一般地, 蛋白越大, 需要沉淀蛋白的盐浓度越低.
有机溶剂沉淀
(Precipitation With Organic Solvents)
•极性的有机溶剂,如:脂肪族的 醇类及酮类, 降低蛋白的溶解性. 方式 1. 减少蛋白表面的水化层和增加疏水性的表面 促进聚集. 2.降低溶液的介电常数 降低蛋白的溶解性. •最常用的有:甲醇, 乙醇, 丙酮及聚乙二醇.