蛋白质的分离和纯化
蛋白质的分离与纯
溶液中加入一定量的中性盐如[NH4]2SO4 A 由于 [NH4]2SO4的亲水性比蛋白质亲水性大，能与大 量的水分子结合，使蛋白质表面水膜退化、消失； B [NH4]2SO4解离，中和了蛋白质颗粒所带的电荷，破 坏蛋白质表面电荷层而沉淀析出
（二）有机溶剂沉淀蛋白质： • 凡能与水以任意比例混合的有机溶剂， 如乙醇、甲醇、丙酮等，均可用于沉淀 蛋白质。 • 沉淀原理是：① 脱水作用；② 使水的 介电常数降低，蛋白质溶解度降低。 • 为了防止蛋白质在分离过程中发生变性， 有机溶剂浓度不能太高 (30%-50%) ，而且 需要在低温条件下进行。
Ion exchange chromatography 离子交换层析（2）
Ion exchange chromatography 离子交 换层析（3）
Ion-exchange chromatography exploits differences in the sign and magnitude of the net electric charges of proteins at a given pH. The column matrix is a synthetic polymer containing bound charged groups; those with bound anionic groups are called cation exchangers, and those with bound cationic groups are called anion exchangers. Ion-exchange chromatography on a cation exchanger is shown here. The affinity of each protein for the charged groups on the column is affected by the pH (which determines the ionization state of the molecule) and the concentration of competing free salt ions in the surrounding solution. Separation can be optimized by gradually changing the pH and/or salt concentration of the mobile phase so as to create a pH or salt gradient.
简述蛋白质分离纯化的基本方法
简述蛋白质分离纯化的基本方法蛋白质是有机体重要的组成部分，由氨基酸编码，执行了多种生物功能，例如促进新陈代谢，生物合成，免疫等。
为了获得高纯度的蛋白质，必须将其从其他成分中分离和纯化。
这就是蛋白质纯化。
蛋白质纯化的基本方法包括：一、分子大小法蛋白质主要通过分子过滤器来分离和纯化。
该过程基于分子间的亲和性原理，通过过滤器膜的通透性以及不同蛋白质的大小差异将蛋白质从溶液中分离出来。
二、萃取技术萃取技术是基于蛋白质的共沉淀特性，通过不同的有机溶剂来区分和分离蛋白质，将沉淀的蛋白组分收集后，再进行精细回收。
三、离子交换技术离子交换技术也是基于蛋白质的离子属性，采用各类加压装置，以及特殊离子交换模块以及合成模块，来实现将收集物分离筛选后回收。
四、双模立体技术双模立体技术是采用两种不同的液体体系，如水基和有机溶剂基，在不同的状态或浓度下对蛋白质进行再离析技术，从而实现蛋白质的有效分离纯化。
五、凝胶精分技术凝胶精分技术是改良和发展起来的一种新型蛋白质分离纯化技术，主要基于交叉链结构，可以基本上实现同一类分子配体分子完整地分离纯化。
六、共晶引擎技术共晶引擎技术可基于共晶相邻能量差异，通过电荷，配体结合等不同形式来改变分子的邻近能量，从而有效的将蛋白质分离出来。
以上就是蛋白质分离纯化的基本方法，可以从不同的角度神明蛋白质的性质，以达到有效的提纯的目的。
蛋白质的分离纯化对解析有机体内蛋白质的结构和功能，也极为重要。
目前，已经有很多高级的技术和模块来实现蛋白质分离纯化，例如蛋白质分子调控，杂交等。
通过有效利用上述方法，可以有效精细和完整得提纯高纯度的蛋白质。
蛋白质的分离与纯化
（1）凝胶的选择：
。
（2）方法： 配置凝胶悬浮液：计算并称取一定量的凝胶浸泡于 中充分溶胀
后，配成
。
（3）凝胶色谱柱的装填方法
① 固定：将色谱柱处置固定在支架上
② 装填：将
一次性的缓慢倒入 内，装填时轻轻敲动色谱柱，
使凝胶填装均匀。
③ 洗涤平衡: 装填完毕后，立即用缓冲液洗脱瓶，在 高的操作压下，用
3、具体过程：
相对分子质量 较小的蛋白质
（1）
（2） （3） （4）
（5）
相对分子质量 较大的蛋白质
A B
A
的蛋白质由于
作用进入凝胶颗粒内部而被滞
留；
的蛋白质被排阻在凝胶颗粒外面，在了里之间
迅速通过。
B（1）
混合物上柱；
（2）洗脱开始，
的蛋白质扩散进入凝胶颗粒内；
的蛋白质被排阻于凝胶颗粒之外；
（3）
子
以及分子本身 、
的不同使带电分子产
生不同的
，从而实现样品中各种分子的分离。
3、分类： 琼脂糖凝胶电泳 聚丙稀酰胺凝胶电泳。
测定（ 蛋白质相对分子质量 ）通常用十二烷基硫酸钠（SDS）—聚丙稀酰胺凝胶
电泳。蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于它所带静电荷的多少以及分子的
大小等因素。为了消除静电荷对迁移率的影响可以在凝胶中加入
(4) 透析
2. 凝胶色谱制作
1）凝胶色谱柱的制作
① 取长40厘米，内径1.6厘米的玻璃管，两端需用砂纸磨平。
② 底塞的制作：打孔 挖出凹穴
安装移液管头部 覆
盖尼龙网，再用100目尼龙纱包好。
a、选择合适的的橡皮塞，中间打孔；
b、在橡皮塞顶部切出锅底状的 ，在0.5ml的 头部切
蛋白质的分离纯化方法
蛋白质的分离纯化方法根据分子大小不同进行分离纯化蛋白质是一种大分子物质,并且不同蛋白质的分子大小不同,因此可以利用一些较简单的方法使蛋白质和小分子物质分开,并使蛋白质混合物也得到分离。
根据蛋白质分子大小不同进行分离的方法主要有透析、超滤、离心和凝胶过滤等。
透析和超滤是分离蛋白质时常用的方法。
透析是将待分离的混合物放入半透膜制成的透析袋中,再浸入透析液进行分离。
超滤是利用离心力或压力强行使水和其它小分子通过半透膜,而蛋白质被截留在半透膜上的过程。
这两种方法都可以将蛋白质大分子与以无机盐为主的小分子分开。
它们经常和盐析、盐溶方法联合使用,在进行盐析或盐溶后可以利用这两种方法除去引入的无机盐。
由于超滤过程中,滤膜表面容易被吸附的蛋白质堵塞,以致超滤速度减慢,截流物质的分子量也越来越小。
所以在使用超滤方法时要选择合适的滤膜,也可以选择切向流过滤得到更理想的效果离心也是经常和其它方法联合使用的一种分离蛋白质的方法。
当蛋白质和杂质的溶解度不同时可以利用离心的方法将它们分开。
例如,在从大米渣中提取蛋白质的实验中,加入纤维素酶和α-淀粉酶进行预处理后,再用离心的方法将有用物质与分解掉的杂质进行初步分离[3]。
使蛋白质在具有密度梯度的介质中离心的方法称为密度梯度(区带)离心。
常用的密度梯度有蔗糖梯度、聚蔗糖梯度和其它合成材料的密度梯度。
可以根据所需密度和渗透压的范围选择合适的密度梯度。
密度梯度离心曾用于纯化苏云金芽孢杆菌伴孢晶体蛋白,得到的产品纯度高但产量偏低。
蒋辰等[6]通过比较不同密度梯度介质的分离效果,利用溴化钠密度梯度得到了高纯度的苏云金芽孢杆菌伴孢晶体蛋白。
凝胶过滤也称凝胶渗透层析,是根据蛋白质分子大小不同分离蛋白质最有效的方法之一。
凝胶过滤的原理是当不同蛋白质流经凝胶层析柱时,比凝胶珠孔径大的分子不能进入珠内网状结构,而被排阻在凝胶珠之外,随着溶剂在凝胶珠之间的空隙向下运动并最先流出柱外;反之,比凝胶珠孔径小的分子后流出柱外。
蛋白质的分离、纯化和鉴定
三、蛋白质的胶体性质与蛋பைடு நூலகம்质沉淀
蛋白质是亲水胶体。 1. 蛋白质是亲水胶体。 水化层与双电层使蛋白质成为稳定的亲水胶体。 水化层与双电层使蛋白质成为稳定的亲水胶体。
球状的水溶性蛋白疏水基团借疏水作用聚合在分 子内部， 子内部，而亲水基团则分布于表面与周围水分子 结合形成水化层； 结合形成水化层； 水化层 同时蛋白质表面的可解离基团带有相同的净电荷， 同时蛋白质表面的可解离基团带有相同的净电荷， 与其周围的反离子构成稳定的双电层。 与其周围的反离子构成稳定的双电层。 双电层
影响盐析的因素有： 影响盐析的因素有： 温度 pH值 值 蛋白质浓度 常用的中性盐主要有硫酸铵， 常用的中性盐主要有硫酸铵，优点是温度系数小而溶 解度大 。
※ 有机溶剂沉淀反应
：用与水互溶的乙醇、丙酮等夺取 用与水互溶的乙醇、
水膜，降低介电常数，增加蛋白质之间的相互作用， 水膜，降低介电常数，增加蛋白质之间的相互作用，使 蛋白质颗粒凝集而沉淀。不同蛋白质所需溶剂浓度不同， 蛋白质颗粒凝集而沉淀。不同蛋白质所需溶剂浓度不同， 可进行分级沉淀，但易引起变性，与有机溶剂浓度、 可进行分级沉淀，但易引起变性，与有机溶剂浓度、作 用时间和沉淀温度有关。 用时间和沉淀温度有关。 例如：丙酮沉淀。使用丙酮沉淀时，必须在 ～ ℃ 例如：丙酮沉淀。使用丙酮沉淀时，必须在0～4℃低温 下进行，丙酮用量一般 倍于蛋白质溶液体积 倍于蛋白质溶液体积。 下进行，丙酮用量一般10倍于蛋白质溶液体积。蛋白质 被丙酮沉淀后，应立即分离。除了丙酮以外， 被丙酮沉淀后，应立即分离。除了丙酮以外，也可用乙 醇沉淀。 醇沉淀。
（2）不可逆沉淀
在强烈沉淀条件下，不仅破坏了蛋白质胶体溶液的稳定性， 在强烈沉淀条件下，不仅破坏了蛋白质胶体溶液的稳定性， 而且也破坏了蛋白质的结构和性质， 而且也破坏了蛋白质的结构和性质，产生的蛋白质沉淀不可 能再重新溶解于水。 能再重新溶解于水。 由于沉淀过程发生了蛋白质的结构 和性质的变化，所以又称为变性沉淀。 和性质的变化，所以又称为变性沉淀。 如加热沉淀、强酸碱沉淀、 如加热沉淀、强酸碱沉淀、重金属盐 沉淀和生物碱沉淀等都属于不可逆沉淀。 沉淀和生物碱沉淀等都属于不可逆沉淀。
蛋白质的分离纯化
蛋白质的分离纯化一，蛋白质（包括酶）的提取大部份蛋白质都可溶于水、稀盐、稀酸或碱溶液，少数与脂类结合的蛋白质那么溶于乙醇、丙酮、丁醇等有机溶剂中，因些，可采纳不同溶剂提取分离和纯化蛋白质及酶。
（一）水溶液提取法稀盐和缓冲系统的水溶液对蛋白质稳定性好、溶解度大、是提取蛋白质最常用的溶剂，通常用量是原材料体积的1-5倍，提取时需要均匀的搅拌，以利于蛋白质的溶解。
提取的温度要视有效成份性质而定。
一方面，多数蛋白质的溶解度随着温度的升高而增大，因此，温度高利于溶解，缩短提取时间。
但另一方面，温度升高会使蛋白质变性失活，因此，基于这一点考虑提取蛋白质和酶时一般采用低温（5度以下）操作。
为了避免蛋白质提以过程中的降解，可加入蛋白水解酶抑制剂（如二异丙基氟磷酸，碘乙酸等）。
下面着重讨论提取液的pH值和盐浓度的选择。
1、pH值蛋白质，酶是具有等电点的两性电解质，提取液的pH值应选择在偏离等电点两侧的pH 范围内。
用稀酸或稀碱提取时，应防止过酸或过碱而引起蛋白质可解离基团发生变化，从而导致蛋白质构象的不可逆变化，一般来说，碱性蛋白质用偏酸性的提取液提取，而酸性蛋白质用偏碱性的提取液。
2、盐浓度稀浓度可促进蛋白质的溶，称为盐溶作用。
同时稀盐溶液因盐离子与蛋白质部分结合，具有保护蛋白质不易变性的优点，因此在提取液中加入少量NaCl等中性盐，一般以摩尔。
升浓度为宜。
缓冲液常采用磷酸盐和碳酸盐等渗盐溶液。
（二）有机溶剂提取法一些和脂质结合比较牢固或分子中非极性侧链较多的蛋白质和酶，不溶于水、稀盐溶液、稀酸或稀碱中，可用乙醇、丙酮和丁醇等有机溶剂，它们具的必然的亲水性，还有较强的亲脂性、是理想的提脂蛋白的提取液。
但必需在低温下操作。
丁醇提取法对提取一些与脂质结合紧密的蛋白质和酶专门优越，一是因为丁醇亲脂性强，专门是溶解磷脂的能力强；二是丁醇兼具亲水性，在溶解度范围内（度为10%，40度为%）可不能引发酶的变性失活。
另外，丁醇提取法的pH及温度选择范围较广，也适用于动植物及微生物材料。
蛋白质的分离、纯化
胰岛素的分离纯化
胰岛素是一种由胰腺分泌的激素， 具有降低血糖的作用。胰岛素的 分离纯化通常采用离子交换色谱
和结晶法。
胰岛素的分离纯化对于治疗糖尿 病具有重要意义。纯化的胰岛素 可以用于注射，帮助糖尿病患者
控制血糖水平。
在胰岛素的分离纯化过程中，需 要特别注意避免蛋白质的聚集和 变性，以确保产品的安全性和有
利用半透膜，根据不同物质之间的分 子大小和形状差异进行分离。
色谱分离
利用不同物质在固定相和流动相之间 的吸附、分配等作用力差异进行分离。
蛋白质的纯度鉴定
化学分析
电泳分析
利用蛋白质中的特定化学基团进行定量分 析，如测定氨基酸组成和序列、测定肽键 等。
利用不同蛋白质在电场中的迁移率差异进 行分离，再通过染色或放射自显影等技术 进行检测。
有机溶剂沉淀法
利用有机溶剂降低水的介电常数，使 蛋白质发生沉淀。常用的有机溶剂有 乙醇、丙酮等。
离心法
高速离心法
利用高速旋转产生的离心力使溶液中 的悬浮颗粒沉降，从而实现蛋白质的 分离。
超速离心法
在高速离心的基础上，利用密度梯度 离心技术，将不同密度的蛋白质进行 分离。
膜分离法
微滤
利用微孔滤膜，将溶液中的悬浮颗粒和微生物截留，从而实现蛋白质的分离。
蛋白质在水中的溶解度 受pH、离子强度、温度 等因素影响。不同蛋白 质具有不同的溶解度。
蛋白质的分离纯化方法
沉淀法
利用蛋白质的溶解度差异，通过改变 某些条件（如pH、离子强度、温度 等）使蛋白质沉淀析出。
离心分离
利用离心机的高速旋转产生的离心力， 根据不同物质之间的密度和沉降系数 差异进行分离。
膜分离
血红蛋白的分离纯化通常采用色谱技术，如凝胶过滤色谱和离子交换色谱。这些技术可以根据蛋白质 的大小、电荷和疏水性等性质进行分离。
蛋白质的分离和纯化的方法
蛋白质的分离和纯化的方法
蛋白质分离纯化常用方法有：
1、沉淀；
2、电泳：蛋白质在高于或低于其等电点的溶液中是带电的，在电场中能向电场的正极或负极移动。
根据支撑物不同，有薄膜电泳、凝胶电泳等。
3、透析：利用透析袋把大分子蛋白质与小分子化合物分开的方法。
4、层析：
a.离子交换层析，利用蛋白质的两性游离性质，在某一特定PH时，各蛋白质的电荷量及性质不同，故可以通过离子交换层析得以分离。
如阴离子交换层析，含负电量小的蛋白质首先被洗脱下来f
b.分子筛，又称凝胶过滤。
小分子蛋白质进入孔内，滞留时间长，大分子蛋白质不能时入孔内而径直流出。
5、超速离心：既可以用来分离纯化蛋白质也可以用作测定蛋白质的分子量。
不同蛋白质其密度与形态各不相同而分开。
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1、下列关于DNA和血红蛋白的提取与分离属 于的叙述中，错误的是 (A ) A.可用蒸馏水涨破细胞的方法从猪红细胞中 提取到DNA和蛋白质 B.用不同浓度的NaCl溶液反复溶解于析出 DNA可去除部分杂质 C.透析法分离蛋白质的依据是利用蛋白质不 能通过半透膜的特性 D.进一步分离与纯化血红蛋白可用凝胶色谱 法、离心法、电泳法等
（3）分离血红蛋白溶液
将搅拌好的混合溶液中速长时离 心后，试管中的溶液分为4层。 第一层为无色透明的甲苯层， 第二层为脂溶性物质的沉淀层， 第三层是血红蛋白的水溶液， 第四层是其他杂质的暗红色沉淀 物。
将试管中的液体用滤纸过滤，除去之溶性 沉淀层，于分液漏斗中静置片刻后，分出 下层的红色透明液体。
6、下列有关“血红蛋白提取和分离”的相关 叙述中，正确的是 ( D) A.用蒸馏水进行红细胞的洗涤，其目的是去 除细胞表面杂蛋白 B.将血红蛋白溶液进行透析，其目的是去除 相对分子质量较大的杂质 C.血红蛋白释放时加入有机溶剂，其目的是 使血红蛋白溶于有机溶剂 D.整个过程不断用磷酸缓冲液处理，是为了 维持血红蛋白的结构
1、在装填凝胶柱时，不能有气泡存在的原因 ( A) • A、气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次 序，降低分离效果 • B、气泡阻碍蛋白质的运动 • C、气泡与蛋白质发生化学反应 • D、气泡在装填凝胶的时候，使凝胶不紧密
2、样品的加入和洗脱的操作不正确的是 A • A 加样前，打开色谱柱下端的流出口，使柱 内凝胶面上的缓冲液缓慢下降到凝胶面的下面 • B．加样后，打开下端出口，使样品渗入凝胶 床内 • C．等样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口 • D．用吸管小心的将1ml透析后的样品加到色谱 柱的顶端，不要破坏凝胶面
1、洗涤红细胞的目的是
A.去除血清 C.除去血小板 B.去除杂蛋白 D.除去水
B
2、选用红细胞作为分离蛋白质的实验材料， 有何好处 （ A ） • A.血红蛋白是有色蛋白 B.红细胞无细胞核 • C.红细胞蛋白质含量高 D.红细胞DNA含 量高
3、为了提取血红蛋白，从学校附近的屠宰场 取新鲜的猪血，对猪血处理的正确操作是 ( A ) A.要在采血容器中预先加入抗凝血剂柠檬酸 钠 B.重复洗涤直到上清液呈红色为止 C.将离心后的血细胞加入清水缓慢搅拌 D.取血回来后，马上进行高速长时间离心
3.纯化--凝胶色谱法
去除相对分子量大的杂质蛋白
凝胶色谱柱的装填
凝胶的前处理：配置凝胶悬浮液：计算并称取一 定量的凝胶浸泡于蒸馏水或洗脱液中充分溶胀后，配 成凝胶悬浮液。 凝胶色谱柱的装填方法：A、固定：将色谱柱装 置固定在支架上。B、装填：将凝胶悬浮液一次性的 装填入色谱柱内，装填时轻轻敲动色谱柱，使凝胶填 装均匀。 注意：1、凝胶装填时尽量紧密，以降低凝胶颗粒之 间的空隙。 2、装填凝胶柱时不得有气泡存在：因为 气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效 果。
4、在血红蛋白的整个提取过程中，不断用磷 酸缓冲液处理的目的是 ( ) D A.防止血红蛋白被O2氧化 B.血红蛋白是一种碱性物质，需要酸中和 C.磷酸缓冲液会加速血红蛋白的提取过程 D.让血红蛋白处在稳定的pH范围内，维持其 结构和功能
5、下面关于对血红蛋白提取和分离的样品的 A ） 处理措施中，错误的是 （ A.采集血样后要高速短时间离心获得血细胞 B.洗涤三次后如上清液仍有黄色，可增加洗 涤次数，否则血浆蛋白无法除净。 C.在蒸馏水和甲苯的作用下，细胞破裂，释 放出血红蛋白 D.释放血红蛋白后再经过离心，就可以使血 红蛋白和其他杂质分离开来
3.蛋白质分离的方法：
（1）透析法
3.凝胶色谱法
(1)凝胶：
由多糖类化合物（如葡聚糖、琼脂糖）构成的 多孔球体，内含许多贯穿的通道
(2)原理：大分子通过多孔凝胶颗粒的 间隙，路程短，流动快；小分子穿过多 孔凝胶颗粒内部，路程长，流动慢。
(3)作用：使样品中分子大小不同的蛋白 质按顺序分离出来
下图中最早洗脱下来的是什么？为什么？
偏碱性溶液 透析液（中性缓冲液） 有机溶剂
一、蛋白质的分离
1.抽提方法：
（1）酸性蛋白质： 偏碱性溶液 （2）水溶性蛋白质：透析液（中性缓冲液） （3）脂溶性蛋白质：有机溶剂
二、常用的分离方法
1.离心沉降法 2.薄膜透析法
3.凝胶色谱法
4.电泳法
1.离心沉降法
原理：通过控制离心 速率，使得分子大小、 密度不同的物质发生 分层沉降，从而分离 出不同种类蛋白质。
低速离心：防止白细胞沉淀。 缓慢搅拌：防止红细胞破裂释放出血红蛋白。 柠檬酸钠：防止血液凝固。
（2）血红蛋白的释放 在蒸馏水和甲苯作用下，红细胞破裂释放 出血红蛋白。 注：加入蒸馏水后红细胞液体积与原血液 体积要相同。 甲苯：溶解细胞膜，有利于血红蛋白的释放 和分离。 蒸馏水作用：使红细胞吸水胀破
50cm高
样品加入与洗脱
①调节缓冲液面：打开下端出口，使柱内缓冲液缓慢下降 到与凝胶面平齐，关闭出口。
②滴加透析样品：吸管吸1ml样品加到色谱柱的顶 端，滴加样品时，吸管管口贴着管壁环绕移动加样， 同时注意不要破坏凝胶面。
③样品渗入凝胶床：加样后打开下端出口，使样品渗入凝 胶床内，等样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口。 ④洗脱：小心加入pH=7.0 的20mmol/l的磷酸缓冲液到适当 高度，连接缓冲液洗脱瓶，打开下端出口进行洗脱。 ⑤收集：待红色的蛋白质接近色谱柱底端时，用试管收集 流出液，每5ml收集一试管，连续收集。（在分离过程中，如 果红色区带均匀一致的移动，说明色谱柱制作成功）
• 相对分子质量不同的蛋白质在凝胶中 的进行过程可表示为图中哪一个 B
4.电泳
(1)概念：带电粒子在电场作用下发生迁移的过 程。 (2)泳动速度和方向：
方向：向着与其所带电荷相反的电极移动。 速度：带电分子的迁移速度跟各种分子带电性质 的差异以及分子本身的大小,形状有关。
一般来说，带电颗粒所带净电荷越多， 直径越小，越接近于球形，则在电场中的泳 动速度越快；反之，则越慢。 电泳分离时，电荷量相差越大的物质相距越远。
分子量 直径大小
大 大于凝胶颗粒空 隙直径，被阻挡 在颗粒的外面 垂直向下移动 较快 较短 先从凝胶柱洗脱 出来
小 小于凝胶颗粒空 隙直径，可以进 入颗粒内部 垂直向下移动， 无规则扩散进入 颗粒内部 较慢 较长 后从凝胶柱洗脱 出来
运动方式 运动速度 运动路径 洗脱次序
• 用凝胶色谱法分离蛋白质时，分子量 大的蛋白质 D • A．路程较长，移动速度较慢 B．路程较长，移动速度较快 • C．路程较短，移动速度较慢 D．路程较短，移动速度较快
2、下列关于血红蛋白提取和分离实验中样品 处理步骤的描述，正确的是 ( C ) A.红细胞的洗涤：加入蒸馏水，缓慢搅拌， 低速短时间离心 B.血红蛋白的释放：加入生理盐水和甲苯， 置于磁力搅拌器上充分搅拌 C.分离血红蛋白：将搅拌好的混合液离心、 过滤后，用分液漏斗分离 D.透析：将血红蛋白溶液装入透析袋，然后 置于pH为4.0的磷酸缓冲液中透析12h
3、以下关于血红蛋白提取和分离的过程及原 理叙述正确的是 (C ) A.红细胞洗涤过程中要加入5倍体积的蒸馏水， 重复洗涤三次 B.将血红蛋白溶液放在质量分数为O.9％的 NaCl溶液透析12小时 C.凝胶装填在色谱柱内要均匀，不能有气泡 存在 D.蛋白质通过凝胶时，相对分子质量较大的 移动速度慢
1、下列操作正确的是（ D ） • A. 分离红细胞时采用低速长时间离心 • B. 红细胞释放出血红蛋白只需要加入蒸馏 水就可 • C. 分离血红蛋白溶液是低速短时间离心 • D. 透析时要用20mmol/l的磷酸缓冲液，透 析12h
2、在蛋白质的提取和分离中，关于对样品处理 过程中，分析无误的是 （ D ） A 洗涤红细胞的目的是去除血浆中的葡萄糖、无 机盐 B 洗涤时离心速度过小，时间过短，白细胞等会 沉淀，达不到分离的效果 C 洗涤过程选用0.1%的生理盐水 D 透析的目的是去除样品中相对分子质量较小的 杂质
离心时相对分子质量大的 物质先沉淀。
2.薄膜透析法
（1）原理：利用蛋白质分子不能透过半透 膜的特性，可将蛋白质与其他小分子化合 物分离开。 （2）方法：将待分离的蛋白质溶液装入用 半透膜制成的透析袋内，再将透析袋放入 透析液中便可进行透析ห้องสมุดไป่ตู้ 半透膜能使小分子自由进出，而大分子保 留在袋内。
小分子杂质（无机盐、单糖、二糖 及氨基酸等）从透析袋中出来，而蛋 白质留在袋内。
• 下列有关蛋白质提取和分离的说法，错误 的是 ( D ) • A.透析法分离蛋白质的原理是利用蛋白质 不能通过半透膜的特性 • B.采用透析法使蛋白质与其他小分子化合 物分离开来 • C.离心沉降法通过控制离心速率使分子大 小、密度不同的蛋白质分离 • D.蛋白质在电场中可以向与其自身所带电 荷相同的电极方向移动
蛋白质的分离和纯化
一、蛋白质的分离
原理 1.根据细胞的结构特点，选择不同的破碎细胞 的方法（如研磨法、超声波法、酶解法等），使各种 蛋白质释放出来。 2.根据蛋白质各种特性的差异，如分子的形状和 大小、所带电荷的性质和多少、溶解度、吸附性质 和对其他分子的亲和力等等，可以用来分离不同种 类的蛋白质。 Q:下列蛋白质如何提取？ 酸性蛋白质； 水溶性蛋白质； 脂溶性蛋白质；
2.粗分离---薄膜透析法
取1mL的血红蛋白溶液装入透析袋中，将透析袋 放入盛有300mL的物质的量的浓度为20mmol/L的磷酸 缓冲液（PH=7）中，透析12h。透析可以去除样品中 分子量较小的杂质，或用于更换样品的缓冲液。
【注】缓冲液作用：抵制外界酸、碱对溶液pH 的影响而保持pH稳定。 使用PH=7的磷酸缓冲液，有利于维持血 红蛋白的正常特性。
4.纯度鉴定---SDS-聚丙烯酰胺凝胶 电泳
（以血红蛋白的分离纯化为例） 三、蛋白质提取分离的程序
蛋白质的提取和分离一般分为四步： （1）样品处理：包括洗涤红细胞；血红蛋 白释放；分离血红蛋白溶液。 （2）粗分离：薄膜透析法除去分子较小的 杂质。 （3）纯化：通过凝胶色谱法将分子量较大 的杂质蛋白质除去。 （4）纯度鉴定：通过聚丙烯酰胺凝胶电泳 鉴定。