蛋白质分离纯化的新技术及技术要点(1)
蛋白质的分离纯化方法(参考资料)
蛋白质的分离纯化方法2.1根据分子大小不同进行分离纯化蛋白质是一种大分子物质,并且不同蛋白质的分子大小不同,因此可以利用一些较简单的方法使蛋白质和小分子物质分开,并使蛋白质混合物也得到分离。
根据蛋白质分子大小不同进行分离的方法主要有透析、超滤、离心和凝胶过滤等。
透析和超滤是分离蛋白质时常用的方法。
透析是将待分离的混合物放入半透膜制成的透析袋中,再浸入透析液进行分离。
超滤是利用离心力或压力强行使水和其它小分子通过半透膜,而蛋白质被截留在半透膜上的过程。
这两种方法都可以将蛋白质大分子与以无机盐为主的小分子分开。
它们经常和盐析、盐溶方法联合使用,在进行盐析或盐溶后可以利用这两种方法除去引入的无机盐。
由于超滤过程中,滤膜表面容易被吸附的蛋白质堵塞,以致超滤速度减慢,截流物质的分子量也越来越小。
所以在使用超滤方法时要选择合适的滤膜,也可以选择切向流过滤得到更理想的效果离心也是经常和其它方法联合使用的一种分离蛋白质的方法。
当蛋白质和杂质的溶解度不同时可以利用离心的方法将它们分开。
例如,在从大米渣中提取蛋白质的实验中,加入纤维素酶和α-淀粉酶进行预处理后,再用离心的方法将有用物质与分解掉的杂质进行初步分离[3]。
使蛋白质在具有密度梯度的介质中离心的方法称为密度梯度(区带)离心。
常用的密度梯度有蔗糖梯度、聚蔗糖梯度和其它合成材料的密度梯度。
可以根据所需密度和渗透压的范围选择合适的密度梯度。
密度梯度离心曾用于纯化苏云金芽孢杆菌伴孢晶体蛋白,得到的产品纯度高但产量偏低。
蒋辰等[6]通过比较不同密度梯度介质的分离效果,利用溴化钠密度梯度得到了高纯度的苏云金芽孢杆菌伴孢晶体蛋白。
凝胶过滤也称凝胶渗透层析,是根据蛋白质分子大小不同分离蛋白质最有效的方法之一。
凝胶过滤的原理是当不同蛋白质流经凝胶层析柱时,比凝胶珠孔径大的分子不能进入珠内网状结构,而被排阻在凝胶珠之外,随着溶剂在凝胶珠之间的空隙向下运动并最先流出柱外;反之,比凝胶珠孔径小的分子后流出柱外。
蛋白质的分离纯化方法
蛋白质的分离纯化方法蛋白质是细胞中的重要生物大分子，具有多样的结构和功能。
为了研究蛋白质的性质和功能，需要将蛋白质从混合样品中分离纯化出来。
蛋白质的分离纯化方法有很多种，主要包括离心法、电泳法、层析法和亲和纯化法等。
下面将逐一介绍这些方法及其原理。
1. 离心法离心法是利用离心机将混合物中的蛋白质分离出来。
首先将细胞裂解，得到细胞裂解液，然后进行离心，以将细胞器、胞外物质和亲粒子（如蛋白质颗粒）分离。
离心可以根据不同物质的相对密度和大小进行分层分离，快速旋转离心机可以很好地分离出不同密度的颗粒。
2. 电泳法电泳法是将带电的蛋白质沿着电场移动，根据蛋白质的带电性质和大小分离的方法。
蛋白质可以根据电荷性质分为阴离子蛋白和阳离子蛋白，也可以根据亲水性质分为亲水性蛋白和疏水性蛋白。
电泳法常用的有SDS-PAGE、等电聚焦电泳等。
其中，SDS-PAGE可以根据蛋白质的分子量进行分离。
3. 层析法层析法是通过蛋白质与载体之间的亲和性或者分离介质之间的亲和性进行分离的方法。
层析法主要分为凝胶层析、离子交换层析、亲合层析和大小排阻层析等。
凝胶层析法是利用凝胶的网格结构来分离蛋白质，如凝胶过滤层析、凝胶过渡层析等。
离子交换层析法是利用蛋白质对离子交换树脂的吸附性质进行分离。
亲合层析法是通过亲和柱中的配体与蛋白质的亲和作用进行分离。
大小排阻层析法是根据蛋白质的分子量和形状进行分离。
4. 亲和纯化法亲和纯化法是利用特定的亲合剂与目标蛋白质之间的特异性亲和性进行分离纯化的方法。
亲和纯化主要包括亲和柱层析法、浸没纯化法、亲和剂电泳法等。
亲和柱层析法是将具有亲和填料的柱子与样品接触，通过洗脱再生的操作，将目标蛋白质从其他组分中分离纯化出来。
浸没纯化法是将特定亲合剂浸泡在蛋白质混合物中，使其与目标蛋白质发生亲和结合，然后以特定条件洗脱目标蛋白质。
亲和剂电泳法是负载亲和剂的凝胶片上进行电泳，使蛋白质与亲和剂结合，再通过电泳将其分离纯化出来。
蛋白质提取与纯化技术
蛋⽩质提取与纯化技术蛋⽩质提取与纯化技术选择材料及预处理以蛋⽩质和结构与功能为基础，从分⼦⽔平上认识⽣命现象，已经成为现代⽣物学发展的主要⽅向，研究蛋⽩质，⾸先要得到⾼度纯化并具有⽣物活性的⽬的物质。
蛋⽩质的制备⼯作涉及物理、化学和⽣物等各⽅⾯知识，但基本原理不外乎两⽅⾯。
⼀是得⽤混合物中⼏个组分分配率的差别，把它们分配到可⽤机械⽅法分离的两个或⼏个物相中，如盐析，有机溶剂提取，层析和结晶等；⼆是将混合物置于单⼀物相中，通过物理⼒场的作⽤使各组分分配于来同区域⽽达到分离⽬的，如电泳，超速离⼼，超滤等。
在所有这些⽅法的应⽤中必须注意保存⽣物⼤分⼦的完整性，防⽌酸、硷、⾼温，剧烈机械作⽤⽽导致所提物质⽣物活性的丧失。
蛋⽩质的制备⼀般分为以下四个阶段：选择材料和预处理，细胞的破碎及细胞器的分离，提取和纯化，浓细、⼲燥和保存。
微⽣物、植物和动物都可做为制备蛋⽩质的原材料，所选⽤的材料主要依据实验⽬的来确定。
对于微⽣物，应注意它的⽣长期，在微⽣物的对数⽣长期，酶和核酸的含量较⾼，可以获得⾼产量，以微⽣物为材料时有两种情况：（1）得⽤微⽣物菌体分泌到培养基中的代谢产物和胞外酶等；（2）利⽤菌体含有的⽣化物质，如蛋⽩质、核酸和胞内酶等。
植物材料必须经过去壳，脱脂并注意植物品种和⽣长发育状况不同，其中所含⽣物⼤分⼦的量变化很⼤，另外与季节性关系密切。
对动物组织，必须选择有效成份含量丰富的脏器组织为原材料，先进⾏绞碎、脱脂等处理。
另外，对预处理好的材料，若不⽴即进⾏实验，应冷冻保存，对于易分解的⽣物⼤分⼦应选⽤新鲜材料制备。
蛋⽩质的分离纯化⼀，蛋⽩质（包括酶）的提取⼤部分蛋⽩质都可溶于⽔、稀盐、稀酸或碱溶液，少数与脂类结合的蛋⽩质则溶于⼄醇、丙酮、丁醇等有机溶剂中，因些，可采⽤不同溶剂提取分离和纯化蛋⽩质及酶。
（⼀）⽔溶液提取法稀盐和缓冲系统的⽔溶液对蛋⽩质稳定性好、溶解度⼤、是提取蛋⽩质最常⽤的溶剂，通常⽤量是原材料体积的1-5倍，提取时需要均匀的搅拌，以利于蛋⽩质的溶解。
蛋白质分离纯化的技术
蛋白质分离纯化的技术前言蛋白质是生物体内非常重要的大分子有机物质，具有各种生物学功能，如结构支持、催化反应、传递信息、运输物质及免疫防御。
而蛋白质的研究和应用，早已成为生命科学的热门领域。
然而，大多数生物体中的蛋白质都混杂着众多的其他大分子物质，为了研究或应用某种特定蛋白质，就需要将它从其它物质中分离纯化出来。
今天我们就要来讲一讲蛋白质分离纯化的技术。
一、蛋白质分离的基本原理蛋白质分离的基本原理是利用不同的性质来分离具有不同特性的蛋白质。
蛋白质的各种性质包括分子大小、分子形状、电荷、亲疏水性、氨基酸序列等。
根据这些不同的性质，分别选择不同的分离纯化方法，可以实现不同程度的分离纯化效果。
二、蛋白质分离纯化技术的分类根据分离方式的不同，蛋白质分离纯化技术可以分为以下几类：1. 分子筛层析：分子筛层析是根据蛋白质的分子大小、形状来进行分离，其原理是在一定的缓冲液中，将特定孔径大小的陶瓷或聚合物微球填充进层析柱，根据蛋白质的分子大小，从层析柱中流出不同的蛋白质。
这种方法可以使蛋白质得到较好的分离纯化，但需要考虑蛋白质的保护。
2. 表面等电聚焦（IEF）：表面等电聚焦是根据蛋白质的等电点来进行分离，其原理是在聚丙烯酰胺凝胶电泳板上加上一组垂直于电泳方向的电场，在酸性一端放置一种酸性缓冲液，碱性一端放置一种碱性缓冲液，中间分别加入样品，蛋白质会在等电点处停留，使得不同等电点的蛋白质得到了分离和收获。
这种方法可以进行多品种、高分辨率的蛋白质分离。
3. 亲和层析：亲和层析是根据蛋白质与其他化合物的特异性相互作用进行分离，其原理是特定的化合物置于层析柱中，当特定的蛋白质与化合物结合时，蛋白质就可以纯化出来。
如在层析柱中放入钙离子，就可以纯化出骨钙蛋白，并且可以通过控制钙离子浓度来实现蛋白质的分离。
4. 透析：透析是将样品分子分离于透析膜之内或之外的方法。
通常将混合物放置于透析袋内，在培养基、缓冲液等适当环境中，透析袋内的小分子会从透析膜渗透出去，而较大的蛋白质则被留在透析袋内。
蛋白质分离和纯化技术的研究和应用
蛋白质分离和纯化技术的研究和应用蛋白质是生物体内最基本的分子，其担负着细胞结构与功能、物质转运、信号传递等重要生理功能。
由于生物样品中蛋白质种类众多、含量差异较大，为了深入揭示蛋白质的生物学功能和结构特性，必须对蛋白质进行精确分离和纯化。
本文将介绍蛋白质分离和纯化技术的研究和应用。
一、蛋白质分离技术蛋白质分离是指将复杂的蛋白质混合物进行分离，得到不同种类的纯化蛋白质的过程。
在蛋白质分离的基础上，再进行进一步纯化，能够更好地揭示蛋白质的生物学特性。
（一）凝胶电泳凝胶电泳是当前最常用的蛋白质分离技术之一。
它基于蛋白质的电荷、大小、形状和亲疏水性等性质，利用电场将蛋白质分子沿着凝胶移动，实现分子大小的分离。
凝胶电泳具有分离效果好、操作简单易行、样品消耗量小以及可视化等优点。
（二）液相色谱液相色谱（Liquid chromatography）是一种通过化学亲和性、分子大小、极性与非极性等属性分离物质的分离技术。
常用的液相色谱有透析液相色谱、醚基、硅烷基、反相、离子交换、凝胶过滤等类型。
其中反相色谱在蛋白质分离中尤为重要，它基于不同蛋白质在疏水性基质表面的分配系数不同，以蛋白质的亲水性为基础进行分离。
二、蛋白质纯化技术蛋白质纯化是指在获得蛋白质的基础上，通过不同的纯化技术去除其中的杂质，得到纯度高的蛋白质分子。
蛋白质的纯化技术主要分为两类：非特异性纯化和特异性纯化。
（一）非特异性纯化非特异性纯化是指利用物理化学性质对样品进行分步纯化，将目标分子与混杂物质逐步分离开来的方法。
常用的非特异性纯化技术有盐析、凝胶过滤和透析等。
其中，盐析技术是常用的一种非特异性纯化技术，它利用富集目标蛋白质对盐的结合能力高于混杂蛋白质的特性，将混杂蛋白质和目标蛋白质分离。
（二）特异性纯化特异性纯化是指通过蛋白质与配体、抗体等生物学活性团之间的特异作用进行分离纯化的方法。
常用的特异性纯化技术包括亲和层析、免疫亲和层析等。
其中，亲和层析是一种重要的特异性纯化技术，它通过识别目标蛋白质与固定于固相材料上的亲和基团之间的特异性互作来分离纯化蛋白质。
蛋白质的纯化的方法及原理
蛋白质的纯化的方法及原理蛋白质的纯化是从其来源中去除其他有机物和无机物，使其成为纯净的蛋白质样品的过程。
蛋白质纯化的方法可以根据需要选择，其中常用的方法包括盐析、凝胶过滤、电泳、金属柱层析、亲和层析、离子交换层析、逆相高效液相色谱等。
下面将详细介绍这些方法及其原理。
一、盐析盐析是利用不同浓度的盐溶液对蛋白质溶液进行逐渐稀释，从而使蛋白质发生沉淀的过程。
纯化蛋白质的关键是利用蛋白质与溶剂中离子之间的相互作用来控制蛋白质的溶解和沉淀过程。
在盐析中，通过选择离子强度和种类可以调整蛋白质溶液中所需溶剂化离子的浓度，达到沉淀和纯化蛋白质的目的。
二、凝胶过滤凝胶过滤是一种分子筛分离方法，利用不同孔径的凝胶进行分离。
凝胶的孔径能够排除较大分子，如核酸和细胞碎片，而较小分子，如蛋白质则能通过孔隙，实现纯化。
该方法简单易行，不需要任何特殊设备，适用于中小分子量的蛋白质纯化。
三、电泳电泳是利用蛋白质在电场中的移动性差异进行分离和纯化的方法。
常用的电泳方法有平板电泳、SDS-PAGE（聚丙烯酰胺凝胶电泳）和Western blotting （免疫印迹法）等。
电泳能够根据蛋白质的电荷、分子大小和不同的电场力，在凝胶中分离蛋白质，使其形成带状。
通过切割所需蛋白质的带状区域，可以实现对目标蛋白质的纯化。
四、金属柱层析金属柱层析是利用金属离子与蛋白质之间的亲和性进行分离的方法。
金属柱通常被配制成金属离子亲和基质，并固定在柱子上。
目标蛋白质通过与金属离子发生亲和作用而被保留在柱中，其他杂质则从柱中流出。
通过调节洗脱缓冲液的离子浓度和pH值，可实现对目标蛋白质的纯化。
五、亲和层析亲和层析是利用配体与其特异性结合的蛋白质进行分离和纯化的方法。
通常将配体固定在柱子上，待蛋白质样品通过柱子时，目标蛋白质与配体结合，其他杂质则流失。
通过改变洗脱缓冲液的条件，如离子浓度、pH值和络合剂的添加，可以实现目标蛋白质的纯化。
六、离子交换层析离子交换层析是一种利用蛋白质与离子交换基质之间的相互作用进行分离和纯化的方法。
分离纯化蛋白质的方法及原理
分离纯化蛋白质的方法及原理本页仅作为文档封面，使用时可以删除This document is for reference only-rar21year.March分离纯化蛋白质的方法及原理（一）利用分子大小1、透析：原理：利用蛋白质分子不能透过半透膜的性质，使蛋白质和其他小分子物质如无机盐、单糖、水等分开。
方法：将待提纯蛋白质放在透析袋中放在蒸馏水中进行涉及的问题：如何加快透析过程（1）加大浓度差，及时更换透析液（2）利用磁力搅拌器常用的半透膜：玻璃纸、火棉和其他材料合成2、超过滤：原理：利用压力和离心力，强行使其他小分子和水通过半透膜，而蛋白质留在膜上3、凝胶过滤层析：原理：当不同分子大小的蛋白质混合物流进凝胶层析柱时，比凝胶网孔大的分子不能进入珠内网状结构，排阻在凝胶珠以外，在凝胶珠缝隙间隙中向下移动。
而比孔小的分子不同程度地进入凝胶珠内，这样由于不同大小分子所经历的路径不同而到分离。
结果：大分子先被洗脱下来，小分子后被洗脱下来（二）利用溶解度差别4、等电点沉淀：原理：不同蛋白质具有不同的等电点，当蛋白质混合物调到其中一种蛋白质的等电点时，这种蛋白质大部分和全部被沉淀下来.。
5、盐析与盐溶：原理：低浓度时，中性盐可以增加蛋白质溶解度这种现象称为盐溶.当离子强度增加，足够高时，例如饱和或半饱和程度，很多蛋白质可以从水中沉淀出来，这种现象称为盐析（三）根据电荷不同6、SDS-PAGE 全称十二烷基硫酸钠—聚丙烯酰胺凝胶电泳原理：通过加热和SDS可以使蛋白质变性，多亚基的蛋白质也解离为单亚基，处理后的样品中肽链是处于无二硫键连接的，分离的状态。
电泳时SDS-蛋白质复合物在凝胶中的迁移率不再受蛋白质原有电荷和形状的影响，而主要取决于蛋白质分子量。
所以SDS-PAGE常用来分析蛋白质的纯度和大致测定蛋白质的分子量。
7、离子交换层析：原理：氨基酸分离常用阳离子交换树脂，树脂被处理成钠型，将混合氨基酸上柱，氨基酸主要以阳离子形式存在，在树脂上与钠离子发生交换，而被挂在树脂上。
蛋白质分离纯化与鉴定技术
体积排阻层析介质的选择
分子量分离范围
3000-70000
Sepharose
Sephadex
Superdex
凝胶类型
颗粒大小
SELECTION GUIDE BY TECHNICAL OVERVIEW - Gel Filtration Useful Useful Fractionation Fractionation Range (Mr) Range (Mr) Product Superdex Prepacked HR, PC and PE columns Superdex Peptide<ENDREF< FONT> Superdex 75<ENDREF< FONT> Superdex 200<ENDREF< FONT> Superdex prep grade Superdex 30 prep grade<ENDREF< FONT> Superdex 75 prep grade<ENDREF< FONT> Superdex 200 prep grade<ENDREF< FONT> Superose Prepacked HR and PC columns Superose 12<ENDREF< FONT> Superose 6<ENDREF< FONT> Superose prep grade Lab packs Superose 12 prep grade<ENDREF< grade<ENDREF< Superose 6 prep FONT> FONT> Sephacryl 1 × 103 - 3 × 105 5 × 103 - 5 × 106 up to 3 × 105 up to 1 × 106 1 × 103 - 3 × 105 5× 103 -5× 106 NA NA 100-7 000 (peptides) 3× 1× 1037 × 104 105 5× 1× 104 -6× NA 102 103 -3× -1× 104 105 (Proteins) (Dextrans)
蛋白质分离纯化的新技术和技术要点
蛋白质分离纯化的新技术及技术要点浅述蛋白质分离纯化的新技术摘要：本文主要介绍了浊点萃取法、置换色谱法、亲和层析法、亲和色谱法、凝胶电泳、双水相萃取等蛋白质的最新分离纯化技术，综和近年来国内外的一些研究结果，结合实际应用的例子，分析了各种分离纯化方法的优点，同时指出其不足之处。
文章最后展望了蛋白质分离纯化技术的发展趋势。
关键词：分离纯化蛋白质进展生物技术的发展非常迅速，基因工程、蛋白质工程、发酵工程等生物技术，已经能设计、制造、生产人们急需的多种蛋白质。
和其它生物产品的生产过程一样蛋白质的生产过程一般也分为上、中、下游过程。
上、中游过程是运用生物技术生产目标产物，下游过程是指对含有目标产物的物料进行处理、分离、纯化、加工目标产物。
本文主要综和近年来国内外的研究结果，介绍了蛋白质的最新分离纯化技术。
2. 蛋白质的分离纯化方法：2.1 浊点萃取法(CPE)：2.1.1 概念及原理：浊点萃取法(cloud point extraction，CPE)〔1〕是近年来出现的一种新兴的液—液萃取技术，它不使用挥发性有机溶剂，不影响环境。
它以中性表面活性剂胶束水溶液的溶解性和浊点现象为基础，改变实验参数引发相分离，将疏水性物质与亲水性物质分离。
目前该法已成功地应用于金属螯合物、生物大分子的分离与纯化及环境样品的前处理中[2-5]。
CPE 法除了利用增溶作用外，还利用了表面活性剂另一个重要性质——浊点现象。
溶液静置一段时间(或离心)后会形成两个透明的液相：一为表面活性剂相(约占总体积的5％)；另一为水相(胶束浓度等于CMC)。
外界条件(如温度)向相反方向变化，两相便消失，再次成为均一溶液。
溶解在溶液中的疏水性物质如膜蛋白，与表面活性剂的疏水基团结合，被萃取进表面活性剂相，亲水性物质留在水相，这种利用浊点现象使样品中疏水性物质与亲水性物质分离的萃取方法就是浊点萃取。
图1显示了由温度变化引发的这种相分离现象。
温度的改变，引起水化层的破坏，增强了表面活性剂的疏水性。
蛋白质分离与纯化技术
化工学院生物工程一班胡冠南 3010207234蛋白质分离与纯化技术蛋白质（protein）是生命的物质基础，没有蛋白质就没有生命。
因此，它是与生命及与各种形式的生命活动紧密联系在一起的物质。
机体中的每一个细胞和所有重要组成部分都有蛋白质参与。
所以研究蛋白质的结构与功能是研究生物科学的基础。
蛋白质分离纯化是用生物工程下游技术从混合物之当中分离纯化出所需要得目的蛋白质的方法。
由于深入研究蛋白质的结构与功能需要用到高纯度的蛋白质，因此蛋白质分离与纯化技术是生物产业中的核心技术。
然而该技术难度、成本均高；例如一个生物药品的成本75%都花在下游蛋白质分离纯化当中。
所以对该项技术的改良与创新在实际应用中具有重要意义。
一．蛋白质分离的准备从正常生物基质中提取各种蛋白质均需要有特定的条件。
如果不能满足这一条件，蛋白将很快失去生物学活性，其生物半衰期也将迅速降低。
因此，在蛋白质的特性研究中，确定提取条件是一个关键问题。
在不同的实验中所通到的困难各不相同，有的困难是如何抵抗外源性蛋白酶的作用而维持蛋白质的稳定，在有些实验中的困难是如何维持酶的活性。
在不同的实验中要针对不同的情况来解决不同的问题。
然而对蛋白质研究而言却有着一些共同的参数。
缓冲液可以抗衡蛋白质溶液中pH值的改变，选择合适的缓冲液对于维持—定pH 值下蛋白质的稳定及保证实验的重复性十分重要。
pH和pKa是描述缓冲液的两个重要概念。
pH值是指溶液中氢离子浓度的负对数，pH＝-log(H+)。
pKa值是溶液中酸解离常数的负对数值。
溶液的pH值与pKa值越接近表明溶液的缓冲能力越强，离pKa值越远则缓冲能力越弱。
表1 常用缓冲液的pKa值a：三羟甲基氨基甲烷；b：N-2-羟乙基哌嗪-N’-2-乙磷酸；c：3-（N-吗啉代）丙磺酸；d：N，N’-双（2-乙磺酸）哌嗪；e：2-（N-吗啉代）乙磺酸。
※一般原则1）有条件时，应对pKa相近的一些缓冲液进行试验，以避免有的缓冲液与所研究的蛋白质之间发生不良的相互作用。
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蛋白质分离纯化的新技术及技术要点浅述蛋白质分离纯化的新技术摘要：本文主要介绍了浊点萃取法、置换色谱法、亲和层析法、亲和色谱法、凝胶电泳、双水相萃取等蛋白质的最新分离纯化技术，综和近年来国内外的一些研究结果，结合实际应用的例子，分析了各种分离纯化方法的优点，同时指出其不足之处。
文章最后展望了蛋白质分离纯化技术的发展趋势。
关键词：分离纯化蛋白质进展生物技术的发展非常迅速，基因工程、蛋白质工程、发酵工程等生物技术，已经能设计、制造、生产人们急需的多种蛋白质。
和其它生物产品的生产过程一样蛋白质的生产过程一般也分为上、中、下游过程。
上、中游过程是运用生物技术生产目标产物，下游过程是指对含有目标产物的物料进行处理、分离、纯化、加工目标产物。
本文主要综和近年来国内外的研究结果，介绍了蛋白质的最新分离纯化技术。
2. 蛋白质的分离纯化方法：2.1 浊点萃取法(CPE)：2.1.1 概念及原理：浊点萃取法(cloud point extraction，CPE)〔1〕是近年来出现的一种新兴的液—液萃取技术，它不使用挥发性有机溶剂，不影响环境。
它以中性表面活性剂胶束水溶液的溶解性和浊点现象为基础，改变实验参数引发相分离，将疏水性物质与亲水性物质分离。
目前该法已成功地应用于金属螯合物、生物大分子的分离与纯化及环境样品的前处理中[2-5]。
CPE 法除了利用增溶作用外，还利用了表面活性剂另一个重要性质——浊点现象。
溶液静置一段时间(或离心)后会形成两个透明的液相：一为表面活性剂相(约占总体积的5％)；另一为水相(胶束浓度等于CMC)。
外界条件(如温度)向相反方向变化，两相便消失，再次成为均一溶液。
溶解在溶液中的疏水性物质如膜蛋白，与表面活性剂的疏水基团结合，被萃取进表面活性剂相，亲水性物质留在水相，这种利用浊点现象使样品中疏水性物质与亲水性物质分离的萃取方法就是浊点萃取。
图1显示了由温度变化引发的这种相分离现象。
温度的改变，引起水化层的破坏，增强了表面活性剂的疏水性。
2.1.2 蛋白质分离纯化中的应用：CPE 法可用于分离膜蛋白、酶、动物、植物和细菌的受体，还可以替代一些分离方法如硫酸铵分级法作为纯化蛋白的第一步，与色谱方法联用。
另外，CPE 法分离纯化蛋白质已经可以实现大规模操作。
Minuth等人成功地进行了胆固醇氧化酶浊点萃取的中试研究。
虽然使用离心分离器可以使CPE大规模连续进行，但商品离心分离器用于CPE 的效率和容量仍需进一步研究。
而且，他们发现相分离操作受细胞培养时产生的表面活性物质影响较大，体系两相间密度差较小，表面张力较小，含产物的表面活性剂相的流变学行为较复杂，操作较难。
表1列出了CPE法近几年来在蛋白质分离纯化中的应用。
(1) CPE法用于分离纯化膜蛋白膜蛋白(内嵌膜蛋白、外围膜蛋白)硫水性强、难溶于水，抽提内嵌膜蛋白时，既要削弱它与膜脂的硫水性结合，又耍使它保持硫水基在外的天然状态，较难分离纯化。
由于表面活性刑具有两亲性，它一直作为腹蛋白理想的增溶剂。
增溶时，膜蛋白琉水部分嵌入胶束的硫水核中而与膜脱离，又保持了膜蛋白表面的废水结构。
相分离后，膜蛋白与表面活性剂共同析出，与亲水性蛋白质分离。
所以，CPE 法在分离纯化膜蛋白方面极有优势。
(2) 与其它分析技术的联用CPE 可以作为高效液相色谱(HPLC)、流动注射分析(FIA)、毛细管电泳(CE)等仪器分析的样品前处理方法，提高检出灵敏度。
表面活性别可以防止样品吸附在玻璃容器上，易于与FI A中的载液及HPLC中的有机流动相或胶束流动相混合，可以直接进样。
但是在很多应用中需要除去表面活性剂后再与仪器联用。
将萃取物与表面活性剂分离的方法很多。
对于CMC ＞1mM 的表面活性剂如两性离子表面活性剂可用透析法，但操作时间较长(24h左右)。
对于CMC 较小的表面活性剂可通过色谱柱分离除去，如凝胶柱、毛纫管柱等，分离出的表面活性剂可以再利用，也可以作焚烧处理。
但CPE作为HPLC 的样品前处理方法有两个缺点：第一，常用的表面活性剂在UV区域有很强的背景吸收。
第二，操作时间较长，从色谱柱上需用几个小时洗脱表面活性剂。
表面活性剂的洗脱可能会干扰分析物的测定[3]。
2.2 置换色谱法：2.2.1 概念及分离机理：置换色谱(displacement chromatography)〔6〕作为一种非线性色谱技术，是指样品输入色谱柱后，用一种与固定相作用力极强的置换剂(displacer)通人色谱柱，去替代结合在固定相表面的溶质分子。
样品在置换剂的推动下沿色谱柱前进，使样品中各组分按作用力强弱的次序，形成一系列前后相邻的谱带，并在置换剂的推动下流出色谱柱[7]。
置换色谱的分离行为与样品组分和置换剂在实验条件下的吸附等湿线有直接的联系。
置换色谱要求样品组分及置换剂的吸附等湿线应为Langmuir 型，而且置换剂相对于被分离的各组分应有最强的吸附能力，其吸附等温线位于所有组分的吸附等温线的上方[7]，见图1(A)。
根据物料平衡方程，置换剂在柱中的移动速度uD有下列关系：式中uD 为流动相的线速，ф为相比，qD 和cD 分别为置换剂在固定相和流动相中的浓度，qD／cD 是直线OD的斜率，称之为操作线(operating line)。
当操作线的斜率小于被分离组分等温线的起始斜率，样品才能进行置换展开，最终形成如图l(中的置换序列，这是在理想的情况下(假定无轴向扩散及二次化学平衡)获得的置换色谱图。
每一组分形成矩形的平台(P lateau)洗脱峰，相邻各组分的平台洗脱峰组成了一个台阶状的色谱图。
此时，样品中不同的组分以置换剂的速度前进，即达到等速状态(isobathic co nditions)：uD＝u2；u3＝u4式中u2、u3、u4 指被置换的三组分的速度2.2.2 影响置换色谱分离的因素：（1）置换剂置换剂的选择是置换色谱能否成功地分离和纯化目标产物的关键因素之一〔7,8〕。
对于蛋白质生物大分子的置换色谱来说，多离子型的置换剂与离子交换续料相结合是目前常用的分离方式。
传统观点认为分子量相对大的聚电解质是较合适的置换剂，因为它们对固定相的结合比分离物更强，如羧甲基葡聚糖(CMD)、硫酸葡聚糖、羧甲基淀粉(CMS)〔9〕、硫酸鱼精蛋、肝素、多硫酸戊聚糖(PPS)等。
近期的研究表明，低分子量的化合物作为置换剂则更有优势，因为即使置换剂与蛋白质产物的峰有叠加，在后处理过程中，低分子量置换剂则较容易从目标产物中分离；同时，合成低分子量置换剂成本较低，色谱柱再生过程也比分子量大的置换剂快。
（2）固定相理想的固定相应具备以下条件：样品及置换剂在固定相上应有较强的吸附作用，且吸附是可逆的；样品及置换剂在固定相上的吸附等温线应为Langmuir 型；样品各组分在固定相上的吸附能力应有较大差别，以保证置换色谱带的交叠部分尽可能小而获得良好的产率；有较好的化学稳定性，可适用于不同pH 值的缓冲液和有机溶剂；有较大的比表面及吸附容量；有较好的机械强度，而且容易再生。
置换色谱中的环境不同，置换效果也不一样，即使是选用同样的硅胶，由于来源和制备方法上的差异也会影响置换效率。
反相色谱中使用的烷基硅胶柱常被应用于置换色谱。
同其它硅胶固定相相比，烷基硅胶柱由于柱容量低及非选择性吸附等缺点，很少被用于洗脱色谱，但它却可以用于置换色诺，并成功地分离了对映异构体。
1、问题：电渗纯化蛋白质，结果几乎没得到蛋白，请问哪位有高见今夜纯化蛋白，本以为唾手可得，结果却大失所望....我用SDS-PAGE分离，KCL显带，割胶，而后电渗分离，测OD 值极低，请问哪位有这方面的经验或其它方法，望赐教。
解决：多挖点胶，收集起来，放在1.5 离心管里，用PBS捣烂，4度过夜。
然后离心，收集上清即可。
最后，把上清冻成干粉。
2、问题：蛋白质提纯的方法：SDS-PAGE and N-terminal amino acid sequence analysis.（dahuaidang）SDS polyacrylamid e gel electrophoresis (SDS-PAGE) was performed in 12% acrylamide and 0.1% SDS with adiscontinuous Tris-glycine buffer system. Purified enzyme was subjected to SDS-PAGE a nd electroblotted toImmobilo-PSQ 0.45μm polyvinylidene fluoride membrane (Millipore). A fter the membrane was stained withPonceau S (Sigma), the enzyme protein was cut out and washed with methanol. The mem brane strip holding the protein was subjected to automatic Edman degradation for sequenci ng of the N-terminal aminol acids using anApplied Biosystems 477A protein sequencer (Parkin Elmer).3、问题：蛋白质纯化，装柱，过柱应注意事项有哪些？（dahuaidang）现在要进行蛋白质纯化，有关装柱和过柱的注意事项有哪些呀？还有，需要测序的蛋白质样品，大概需要多少，样品要求有哪些。
柱子sephadex-200,和DEAE-纤维互素。
第一，手工装柱一般只适宜于大量蛋白质的提取。
分子筛柱一般在盐析以后用效率才高，因为它的分媛实汀Ｒ话阄叶荚蕹捎茫龋校蹋弥 颍疲校蹋弥?Gelfitration column).如果手工装柱，长度应是内径的６０－８０倍，一般柱长应在1.2-2米，对于软胶，走一次柱须１２小时以上，对硬胶，也需５－６小时。
第二，仪器检测器灵敏度调整：最重要的是确定仪器工作正常，信号相应正常。
可用在检测器出口通气泡和检测器入口注射有色样品的方法确认仪器正常和估计灵敏度。
第三，均匀, 无气泡，平衡充分，分子筛要注意长度与直径比。
测序的蛋白量' 我用的方法的量是SDS-PAGE第四，如果是测序的话,跑SDS-PAGE,把染出的蛋白质带,挖下来.,直接拿去做质谱,只要你有钱国家生物医学分析中心。
还有就是要保证挖的是一个蛋白质带,不能含杂蛋白质的,不然,把杂蛋白质测了怎么办。
第五，测序跟质谱不是一回事儿的。
做质谱可以做分子量和质谱图，但是未必是序列。