引物合成 PPT课件
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引物设计ppt
PCR引物设计
辅助软件：DNASIS
•回顾PCR原理
PCR的六大要素
• • • • • • 引物 DNA聚合酶 dNTPs 模板 缓冲液 Mg2+
DNA的表示方法
DNA有方向性，5’-------3‘ 大肠杆菌基因组大小：460万碱基对(bp)
基因的表示方法
• CDS:complement(4189888..4190658)‘板书 • CDS: (4189888..4190658)
原则4
预测引物自身的二级结构，3‘末端必须游离
在DNA聚合酶和dNTP存在的情况下，引物以自身为模 板，沿着3‘末端延伸
允许
允许
原则5
正反向引物之间不能互补配对
正向引物与正向引物也不能互补配对
反向引物与反向引物也不能互补配对
如何检查正反向互补配对
• 取正向引物的3’末端的四个碱基，反向互补 后，在正反向引物中查找 • 若查找得到说明有互补配对的情况存在， 引物要重新设计(删减或增加3’碱基数量）
基因是有方向性的，有时在这条链上，而有时在反向互补链上
起始密码子atg,编码甲硫氨酸
终止密码子：taa,tag,tga,不编码氨基酸
引物设计软件介绍
• DNASIS的功能：
• • • • 1.获得反向互补序列 2.搜索限制性内切酶位点 3.翻译情况 4.预测二级结构
• 引物：
• 要扩增模板DNA，首先要设计两条寡核 苷酸引物,实际上就是两段与待扩增靶DNA 序列互补的寡核苷酸片段，两引物间距离 决定扩增片段的长度，两引物的5’端决定扩 增产物的两个5’末端位置。由于引物是决定 PCR扩增片段长度、位置和结果的关键， 因此，引物设计也就更为重要。
Tm值的计算
辅助软件：DNASIS
•回顾PCR原理
PCR的六大要素
• • • • • • 引物 DNA聚合酶 dNTPs 模板 缓冲液 Mg2+
DNA的表示方法
DNA有方向性，5’-------3‘ 大肠杆菌基因组大小：460万碱基对(bp)
基因的表示方法
• CDS:complement(4189888..4190658)‘板书 • CDS: (4189888..4190658)
原则4
预测引物自身的二级结构，3‘末端必须游离
在DNA聚合酶和dNTP存在的情况下，引物以自身为模 板，沿着3‘末端延伸
允许
允许
原则5
正反向引物之间不能互补配对
正向引物与正向引物也不能互补配对
反向引物与反向引物也不能互补配对
如何检查正反向互补配对
• 取正向引物的3’末端的四个碱基，反向互补 后，在正反向引物中查找 • 若查找得到说明有互补配对的情况存在， 引物要重新设计(删减或增加3’碱基数量）
基因是有方向性的，有时在这条链上，而有时在反向互补链上
起始密码子atg,编码甲硫氨酸
终止密码子：taa,tag,tga,不编码氨基酸
引物设计软件介绍
• DNASIS的功能：
• • • • 1.获得反向互补序列 2.搜索限制性内切酶位点 3.翻译情况 4.预测二级结构
• 引物：
• 要扩增模板DNA，首先要设计两条寡核 苷酸引物,实际上就是两段与待扩增靶DNA 序列互补的寡核苷酸片段，两引物间距离 决定扩增片段的长度，两引物的5’端决定扩 增产物的两个5’末端位置。由于引物是决定 PCR扩增片段长度、位置和结果的关键， 因此，引物设计也就更为重要。
Tm值的计算
《PCR引物设计》课件
04
pcr引物的应用与案例分 析
pcr引物在基因克隆中的应用
01
pcr引物用于基因克隆的目的是为了获得目的基因的序列信息， 进而进行后续的基因功能和表达研究。
02
设计特异性引物，通过pcr技术，从基因或基因组中筛选出目的基因。
引物设计需考虑基因序列的特异性、扩增效率和避免非特异性
03
扩增等因素。
引物特异性优化
避免引物间的互补
引物之间不应存在互补序列，以避免形成引物二聚体或发夹 结构。
避免引物与模板扩增 和产物。
引物扩增效率的优化
引物与模板的匹配度
引物的3'端应与模板完全匹配，以提 高引物的扩增效率。
引物之间的匹配度
两个引物之间应有良好的匹配度，以 保证PCR反应的顺利进行。
引导合成
引物作为合成子链的起点，通过与 DNA聚合酶的结合，引导合成与 模板互补的DNA链。
决定产物长度
引物的设计决定了PCR产物的长度 ，通过选择合适的引物，可以控制 产物的大小和特异性。
pcr引物设计的基本原则
特异性
长度和序列
引物应与模板DNA具有高度的特异性，避 免与其他非目标DNA序列发生非特异性结 合。
pcr引物的未来发展方向与挑战
引物设计的自动化
随着生物信息学的发展，未来引物设计 可能更加自动化，减少人工干预和误差
。
标准化和质量控制
建立引物设计的标准化流程，加强引 物设计的质量控制，确保实验结果的
可靠性和可重复性。
新型引物设计策略
针对特定需求，开发新型引物设计策 略，提高PCR反应的特异性和灵敏度 。
引物灵敏度测试
03
测试引物在不同模板浓度下的扩增效率，选择灵敏度较高的引
《引物设计教程》课件
退火温度调整
适当提高退火温度有助于减少引物二 聚体的形成，因为较高的温度下二聚 体形成的概率降低。
引物特异性不高的解决策略
引物特异性验证
在引物设计完成后，应通过实验验证其特异性，确保引物只对目标序列有反应。
避免引物间的交叉反应
在设计引物时，应确保引物之间不存在交叉反应，避免与非目标序列的结合。
引物3’端的选择
Primer Premier
一款功能强大的引物设计软件，支持 多种PCR方法，可进行多参数搜索和 灵活的筛选功能。
Oligo
提供多种类型的寡核苷酸合成和设计 功能，包括引物、探针、适配体等。
GeneFisher
适用于已知序列的基因片段设计通用 引物。
BatchPrimer3
在线引物设计软件，支持多参数搜索 和灵活筛选功能。
02
引物设计的步骤
确定目标基因序列
目标基因序列的来源
可以是基因组、转录组、cDNA等。
目标基因序列的选择标准
选择基因序列时应考虑其功能、表达水平、变异程度等因素。
目标基因序列的获取方法
可以通过基因数据库、文献报道、实验测序等方法获得。
选择合适的引物序列
引物序列的设计原则
引物序列应具有特异性，避免与基因组其他序列发生非特 异性结合；长度一般在18-30bp之间；GC含量应适中， 一般在40%-60%之间。
引物长度一般在15～30碱基之间，过短可 能降低引物特异性，过长则可能导致引物 结合温度升高，不利于引物的特异性。
碱基分布均匀原则
避免二级结构原则
引物序列中的G+C含量在40%～60%之间 ，避免出现连续的4个以上的G或C。
引物自身及引物之间不能形成互补性二聚 体或发夹结构等二级结构。
适当提高退火温度有助于减少引物二 聚体的形成，因为较高的温度下二聚 体形成的概率降低。
引物特异性不高的解决策略
引物特异性验证
在引物设计完成后，应通过实验验证其特异性，确保引物只对目标序列有反应。
避免引物间的交叉反应
在设计引物时，应确保引物之间不存在交叉反应，避免与非目标序列的结合。
引物3’端的选择
Primer Premier
一款功能强大的引物设计软件，支持 多种PCR方法，可进行多参数搜索和 灵活的筛选功能。
Oligo
提供多种类型的寡核苷酸合成和设计 功能，包括引物、探针、适配体等。
GeneFisher
适用于已知序列的基因片段设计通用 引物。
BatchPrimer3
在线引物设计软件，支持多参数搜索 和灵活筛选功能。
02
引物设计的步骤
确定目标基因序列
目标基因序列的来源
可以是基因组、转录组、cDNA等。
目标基因序列的选择标准
选择基因序列时应考虑其功能、表达水平、变异程度等因素。
目标基因序列的获取方法
可以通过基因数据库、文献报道、实验测序等方法获得。
选择合适的引物序列
引物序列的设计原则
引物序列应具有特异性，避免与基因组其他序列发生非特 异性结合；长度一般在18-30bp之间；GC含量应适中， 一般在40%-60%之间。
引物长度一般在15～30碱基之间，过短可 能降低引物特异性，过长则可能导致引物 结合温度升高，不利于引物的特异性。
碱基分布均匀原则
避免二级结构原则
引物序列中的G+C含量在40%～60%之间 ，避免出现连续的4个以上的G或C。
引物自身及引物之间不能形成互补性二聚 体或发夹结构等二级结构。
PCR原理及其操作PPT课件
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34
① 变性温度与时间：
• 一般93℃～94℃，1min足以使模板 变性
– 若低于93℃则需延长时间 – 但温度不能过高，因为高温环境对酶的
活性有影响。
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35
② 退火(复性)温度与时间：
• 退火温度是影响PCR特异性的重要 因素
• 退火温度与时间，取决于引物的长度、 碱基组成及其浓度，还有靶基因序列 的长度
• 复性时间一般为30～60s，足以使引 物与模板之间完全结合
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37
③ 延伸温度与时间：
• 延伸温度：一般选择在70～75℃之间 – 常用温度为72℃ – 过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。
• 延伸反应时间：根据待扩增片段长度而定 – 1Kb以内的DNA片段，延伸时间1min（足够） – 3～4kb的靶序列需3～4min – 扩增10kb需延伸至15min
使
①双链DNA变成单链，
②单链DNA与人工合成的引物退火，
③DNA聚合酶使引物沿着单链模板延
伸为双链D精N选PAPT课。件
3
PCR反应体系
• 4种dNTP混合物 • 引物 • 模板DNA • Taq DNA聚合酶 • Mg2+
各200umol/L 各10～100pmol 0.1～2ug 2.5u 1.5mmol/L
此循环反复进行，可使目的DNA得 以迅速扩增。
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22
理 论 扩 增 率 ： 2n 递 增 （ n 为 循 环 次 数 ） ， 25 ～ 30 循 环 ， 目 标 DNA 可 增 加109倍。
实际扩增率：(１＋Ｘ)n，X为PCR的 实际扩增率，平均约为75%。
由 于 引 物 和 底 物 的 消 耗 ， 酶 活 力 的 下降等因素，扩增产物的增加，逐渐 由指数形式变为线性形式，所以实际 上进行30个循环后，扩增倍数一般可 达106～107。
第五章PCR引物设计-精选.ppt
ΔG值反映了引物与模板结合的强弱程度
引物与模板应具有较高的结合能量，这 样有利于引物与模板序列的整合。因此， 5´端与中间段的ΔG值应较高，引物3’端
的△G 值过高，容易在错配位点形成双链结构 并引发DNA 聚合反应。
算法：邻近热力学
例：ACGG 和其互补 TGCC 结合的ΔG： ΔG(ACGG)= ΔG(AC)+ ΔG(CG)+ ΔG(GG)
同时应预测将扩增的片段单链是否形二 级结构。如这个区域单链能形二级结构， 就避开它。如这一段不能形二级结构， 那就可以在这一区域设计引物。
若不能避开这一区域时，用7-deaza-2′脱氧GTP取代dGTP对扩增的成功是有帮 助的。
1、引物设计的原则
① 引物要跟模板紧密结合； ② 引物与引物之间不能有稳定的二聚体或发夹
引物设计要点（3）
引物的Tm值。Tm值最好接近72℃。过高（>72℃）
或过低（<37℃）都不利于引发反应。上下游引物的 Tm 不能相差太大。
长度为25mer以下的引物：Tm = 4℃(G + C)+ 2℃(A + T)
对于更长的寡聚核苷酸， Tm = 81.5 + 16.6 x Log10[Na+] + 0.41 (%GC) –
因密码子的第3位易发生简并，会影响扩增特 异性与效率。
引物的5′端
引物的5′端限定着PCR产物的长度，它对扩增特异性 影响不大。 引物5′端修饰包括：加酶切位点；标记生物素、荧光、 地高辛、Eu3+等；引入蛋白质结合DNA序列；引入 突变位点、插入与缺失突变序列和引入一启动子序列 等。
引物的GC含量一般为45-55%，过高或 过低都不利于引发反应。上下游引物的 GC含量不能相差太大。
引物与模板应具有较高的结合能量，这 样有利于引物与模板序列的整合。因此， 5´端与中间段的ΔG值应较高，引物3’端
的△G 值过高，容易在错配位点形成双链结构 并引发DNA 聚合反应。
算法：邻近热力学
例：ACGG 和其互补 TGCC 结合的ΔG： ΔG(ACGG)= ΔG(AC)+ ΔG(CG)+ ΔG(GG)
同时应预测将扩增的片段单链是否形二 级结构。如这个区域单链能形二级结构， 就避开它。如这一段不能形二级结构， 那就可以在这一区域设计引物。
若不能避开这一区域时，用7-deaza-2′脱氧GTP取代dGTP对扩增的成功是有帮 助的。
1、引物设计的原则
① 引物要跟模板紧密结合； ② 引物与引物之间不能有稳定的二聚体或发夹
引物设计要点（3）
引物的Tm值。Tm值最好接近72℃。过高（>72℃）
或过低（<37℃）都不利于引发反应。上下游引物的 Tm 不能相差太大。
长度为25mer以下的引物：Tm = 4℃(G + C)+ 2℃(A + T)
对于更长的寡聚核苷酸， Tm = 81.5 + 16.6 x Log10[Na+] + 0.41 (%GC) –
因密码子的第3位易发生简并，会影响扩增特 异性与效率。
引物的5′端
引物的5′端限定着PCR产物的长度，它对扩增特异性 影响不大。 引物5′端修饰包括：加酶切位点；标记生物素、荧光、 地高辛、Eu3+等；引入蛋白质结合DNA序列；引入 突变位点、插入与缺失突变序列和引入一启动子序列 等。
引物的GC含量一般为45-55%，过高或 过低都不利于引发反应。上下游引物的 GC含量不能相差太大。
PCR引物设计方法和原理PPT课件
分理想。要想得到效果很好的引物，在自动搜索的基础
上还要辅以人工分析。笔者认为引物设计软件的最佳搭
配是“Oligo”和“Premier”软件合并使用，以“Premier” 进行自动搜索，“Oligo”进行分析评价，如此可快速设计 出成功率很高的引物。
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12
感谢亲观看此幻灯片，此课件部分内容来源于网络， 如有侵权请及时联系我们删除，谢谢配合！
最新课件
5
四、PCR引物设计的原则
∆G 值是指DNA 双链形成所需的自由能 (internal stability, 用∆G 值反映) :选用3’端∆G 值较低（绝对值不超过9），而5’端和中间∆G 值相对较高的引物
引物二聚体(primer dimer)及发夹结构（duplex formation and hairpin）的能值 :超过 4.5kcal/mol易导致产生引物二聚体带，并且降 低引物有效浓度而使PCR 反应不能正常进行
PCR引物设计得目标片段 DNA测序 基因克隆 体外转录 突变 探针设计 分子标记
最新课件
2
二、引物设计的类型
常规PCR引物 PCR同源引物和简并引物 探针
最新课件
3
引物设计的步骤
下载DNA模板或蛋白质序列 进行同源比较，找到保守同源序列 设计引物
最新课件
4
四、PCR引物设计的原则
引物长度（primer length）: 18-27 bp GC钳(GC clamp}: 引物3’端出现3 个以上的连
续碱基，如GGG 或CCC，也会使错误引发机 率增加 3’末端碱基（3’End Sequence）: ＧＣＴ Tm 值(melting temperature) ：52~60℃ GC 含量（composition） ：40-60%
上还要辅以人工分析。笔者认为引物设计软件的最佳搭
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5
四、PCR引物设计的原则
∆G 值是指DNA 双链形成所需的自由能 (internal stability, 用∆G 值反映) :选用3’端∆G 值较低（绝对值不超过9），而5’端和中间∆G 值相对较高的引物
引物二聚体(primer dimer)及发夹结构（duplex formation and hairpin）的能值 :超过 4.5kcal/mol易导致产生引物二聚体带，并且降 低引物有效浓度而使PCR 反应不能正常进行
PCR引物设计得目标片段 DNA测序 基因克隆 体外转录 突变 探针设计 分子标记
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二、引物设计的类型
常规PCR引物 PCR同源引物和简并引物 探针
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3
引物设计的步骤
下载DNA模板或蛋白质序列 进行同源比较，找到保守同源序列 设计引物
最新课件
4
四、PCR引物设计的原则
引物长度（primer length）: 18-27 bp GC钳(GC clamp}: 引物3’端出现3 个以上的连
续碱基，如GGG 或CCC，也会使错误引发机 率增加 3’末端碱基（3’End Sequence）: ＧＣＴ Tm 值(melting temperature) ：52~60℃ GC 含量（composition） ：40-60%
PCR技术的原理及应用ppt课件
22
PCR的基本原理
• •
PPCCRR反过应程条件72℃
• PCR的特点
第2轮结束
23
模板DNA
第1轮扩增 第2轮扩增
• PCR反应条件
• 第PC3R轮过程扩增
• PCR的特点
PCR的基本原理
第4轮扩增 第5轮扩增
第6轮扩增
24
提纲
实时荧光定量PCR原理 实时荧光定量PCR的几种方法介绍 实时荧光定量PCR在医学和科研中的应用
PCR技术的原理及应用
1
PCR技术简史
• DNA的复制 • 核酸体外扩增的设想 • 聚合酶链反应的发明
DNA 解旋解链
5’ ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC 合成引物 TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG
3’
子链延长
3’ 解旋酶解链酶
5’
2
PCR技术简史
• DNA的复制 • 核酸体外扩增的设想 • 聚合酶链反应的发明
（℃）
55
22
DNA 2
形 成
子链延伸 DNA加倍
与引物复性
DNA双螺旋
重复1~3步 25~30轮
目的DNA片段 扩增100万倍以上
1
2
3
4
5
时间（min）
18
PCR的基本原理
DNA引物
• •
PPCCRR反过应程条件9550℃
• PCR的特点
引物1
引物2
19
PCR的基本原理
• •
DNA 5’ ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC
3’
解旋解链
GGAUC引G 物酶5‘
PCR的基本原理
• •
PPCCRR反过应程条件72℃
• PCR的特点
第2轮结束
23
模板DNA
第1轮扩增 第2轮扩增
• PCR反应条件
• 第PC3R轮过程扩增
• PCR的特点
PCR的基本原理
第4轮扩增 第5轮扩增
第6轮扩增
24
提纲
实时荧光定量PCR原理 实时荧光定量PCR的几种方法介绍 实时荧光定量PCR在医学和科研中的应用
PCR技术的原理及应用
1
PCR技术简史
• DNA的复制 • 核酸体外扩增的设想 • 聚合酶链反应的发明
DNA 解旋解链
5’ ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC 合成引物 TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG
3’
子链延长
3’ 解旋酶解链酶
5’
2
PCR技术简史
• DNA的复制 • 核酸体外扩增的设想 • 聚合酶链反应的发明
（℃）
55
22
DNA 2
形 成
子链延伸 DNA加倍
与引物复性
DNA双螺旋
重复1~3步 25~30轮
目的DNA片段 扩增100万倍以上
1
2
3
4
5
时间（min）
18
PCR的基本原理
DNA引物
• •
PPCCRR反过应程条件9550℃
• PCR的特点
引物1
引物2
19
PCR的基本原理
• •
DNA 5’ ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC
3’
解旋解链
GGAUC引G 物酶5‘
PCR原理ppt课件
1. 长片段DNA的PCR扩增 常规PCR长度为2kb以下。 长片段PCR扩增存在的问题： （1）随着扩增片段的延长，扩增效率降低 （2）高温会损坏模板DNA和PCR产物 （3）高温下其他二价离子的存在会促进DNA的裂解 （4）长片段DNA分子的变性比短片段困难，DNA聚合
酶与模板DNA的趋近和接合变得困难 （5）错配碱基的掺入导致DNA聚合酶的作用不能正常发
4）PCR 反应液的配制 最后加入 DNA 聚合酶。
早期的 PCR 仪没有带加热的盖子，要求在反应液上覆 盖一层矿物油，防止水分蒸发。
热启动（hot start）PCR操作方式可较好解决非特异性 扩增的问题。
5、反应体系
总体积
50-100 l
①缓冲液
②dNTP（底物）
③引物
④模板
⑤DNA聚合酶
①缓冲液：提供合适的PH值和DNA聚合酶的激活剂 10mM Tris·HCl （ pH8.3-9.0），1.5mM MgCl2， 50mM K+
⑤DNA聚合酶： 最常用的是Taq DNA聚合酶，最适反应温度75℃。
Pfu DNA聚合酶：是目前使用最广泛的具有 3‘-5’ 外切
活性的 PCR 酶，目前为止错配率最低的高温DNA聚合酶。
酶量增加使反应特异性下降;酶量过少影响反应产量。
6.PCR技术的特点 1）高度的灵敏性
PCR产物每轮循环增加一倍 30轮循环
2）随机扩增多态性（random ampification polymorphic DNA,RAPD ）
使用随机选择的核苷酸作为PCR反应体系中的引物，在较低 的复性温度下(36℃)进行PCR。由于非特异性引物与模板上的多 个位点结合而不是与某一限制性位点特异性结合，因此经过PCR 扩增反应后可以产生多个PCR产物。经凝胶电泳可以将上述多个 PCR反应产物分离，这样多态性的产物通常称为随机扩增多态性 DNA(random ampification polymorphic DNA,RAPD)
酶与模板DNA的趋近和接合变得困难 （5）错配碱基的掺入导致DNA聚合酶的作用不能正常发
4）PCR 反应液的配制 最后加入 DNA 聚合酶。
早期的 PCR 仪没有带加热的盖子，要求在反应液上覆 盖一层矿物油，防止水分蒸发。
热启动（hot start）PCR操作方式可较好解决非特异性 扩增的问题。
5、反应体系
总体积
50-100 l
①缓冲液
②dNTP（底物）
③引物
④模板
⑤DNA聚合酶
①缓冲液：提供合适的PH值和DNA聚合酶的激活剂 10mM Tris·HCl （ pH8.3-9.0），1.5mM MgCl2， 50mM K+
⑤DNA聚合酶： 最常用的是Taq DNA聚合酶，最适反应温度75℃。
Pfu DNA聚合酶：是目前使用最广泛的具有 3‘-5’ 外切
活性的 PCR 酶，目前为止错配率最低的高温DNA聚合酶。
酶量增加使反应特异性下降;酶量过少影响反应产量。
6.PCR技术的特点 1）高度的灵敏性
PCR产物每轮循环增加一倍 30轮循环
2）随机扩增多态性（random ampification polymorphic DNA,RAPD ）
使用随机选择的核苷酸作为PCR反应体系中的引物，在较低 的复性温度下(36℃)进行PCR。由于非特异性引物与模板上的多 个位点结合而不是与某一限制性位点特异性结合，因此经过PCR 扩增反应后可以产生多个PCR产物。经凝胶电泳可以将上述多个 PCR反应产物分离，这样多态性的产物通常称为随机扩增多态性 DNA(random ampification polymorphic DNA,RAPD)
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引物合成
主要内容
• 引物概念 • 应用领域 • 引物合成原理及方法 • 引物纯化方式 • 常见问题
引物
• 一小段单链DNA。
– Hd3a(cds): – 扩增长度：117bp，扩增范围：391-507；建议退火温度：59.1℃。 – sense:GGGCGTCAGACAGTGTACG – antisense:CTCGCGCTGGCAGTTGAAG – antisense probe:FAM-TTCAACACCAAGGACTTCGCCGAGC –TAMARA
引物合成OD数
• 1.客户需要合成多少OD数为宜？
–一般根据实验目的确定，一般PCR，2OD引物可以做 200-500次50ul标准。如果是做基因拼接或退火后的 拼接，1OD足够.
• 2.公司提供的OD数。
–按照客户要求的量合成，写在引物合成报告单上。 –如不注明，则默认提供2OD。 –一般公司会留有3个月以内客户引物的备份
• 可用于补发或检测
引物定量
• 准确性：酶标仪定量。 • 不准的原因:分装问题、系统误差(小于10%是允许的) • 引物丢失：
–先瞬离再开盖，防止引物干粉飞扬。
• 验证：2OD引物加1ml水，溶解混匀后取100ul,加900ul水，用 紫外线分光光度计（260nm）读数为0.2 。
引物溶解及浓度
全基因合成 根据实验要求定
反义核酸 根据实验要求定
修饰引物 根据实验要求定
纯度级别要求
OPC PAGE OPC, PAGE OPC OPC,PAGE,HPLC OPC,PAGE,HPLC PAGE PAGE PAGE, HPLC
常见问题
• 引物合成OD数 • 引物定量 • 引物溶解及浓度 • 引物Tm值
梯度确定。
• 报告单上两个Tm：
–Tm（0.05M Na+）:用于PCR –Tm（1M Na+）：杂交
• 成品引物以干粉形式，呈白色或无色絮状 (-20℃，1年) 。
• 保存浓度：100umol/L(-20℃，数周)。
–溶解方法：
• 按照报告单Note加水（或TE ph8.0） • 按以下公式计算：
V（ul）=OD数*33*10000/引物分子量
• 使用浓度：10-25pmol/ul
引物Tm值
• Tm值（解链温度:使50%的DNA发生变性时的温度） • =4（G+C）＋2（A+T） • 退火温度：取上下游引物的TM中间值+/-5℃做温度
• 引物合成技术在生命科学领域应用极为广泛，如PCR扩增、 DNA杂交、基因合成及DNA测序等。
引物合成方法及原理
• 合成方法：固相亚磷酰胺三酯法。
• 特点:
–高效 –快速的偶联 –起始反应物比较稳定
引物合成原理
将DNA固定在固相载体上由3‘→5’完成DNA 链的合成，相邻的核苷酸通过3‘→5’磷酸 二酯键连接。通过碱性高温处理，将连接 在载体上的引物切下来，通过OPC, PAGE 等纯化引物，成品引物用C18浓缩,脱盐， 沉淀,沉淀后的引物用水悬浮，测定OD260定 量，根据定单要求分装。
修饰及标记引物
• 30多种引物修饰及标记类型：
–稀有碱基修饰：硫代修饰、甲基化 –引物5′端的修饰及标记 –引物3′端的修饰及标记 –双标记探针 –分子信标
• 发货时间：3-5个工作日。
引物纯化方式
• C18柱脱盐 • OPC 纯化 • PAGE纯化 • HPLC纯化
• C18柱脱盐：（简易反相柱）。
• HPLC纯化：用高效液相色谱的原理，纯度可 以大于99%。主要用于长链和修饰引物的纯 化.成本较高，批量生产效率不高。
应用
引45base
一般PCR扩增
>45 base
诊断PCR扩增
< 40base
DNA测序
20base左右
亚克隆，点突变 根据实验要求定
基因构建 根据实验要求定
引物合成流程
DNA合成仪
• DNA合成仪有很多种, 主要都是由ABI/PE 公司生 产，无论采用什么机器合成，合成的原理都相同， 主要差别在于合成产率的高低，试剂消耗量的不 同和单个循环用时的多少。
• Doctor Oligo-192 6台,美国Biolytic公司
• 世界上最好的高通量DNA/RNA合成仪!
–有效地去除盐分
–不能有效去除比目的片段短的小片段
–一般不会对普通PCR反应产生影响
–不能用于测序、克隆
• OPC纯化:根据DNA保护基和Cartridge柱中树 脂间的亲合力作用的原理进行纯化目的DNA 片段。纯度大于95%。适用于40mer以下引物 的纯化。
• PAGE纯化：用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，对 DNA片段进行分离，然后从凝胶中回收目的 DNA的方法。纯度大于95%，对长链Oligo DNA (大于50mer)的纯化特别有效。
主要内容
• 引物概念 • 应用领域 • 引物合成原理及方法 • 引物纯化方式 • 常见问题
引物
• 一小段单链DNA。
– Hd3a(cds): – 扩增长度：117bp，扩增范围：391-507；建议退火温度：59.1℃。 – sense:GGGCGTCAGACAGTGTACG – antisense:CTCGCGCTGGCAGTTGAAG – antisense probe:FAM-TTCAACACCAAGGACTTCGCCGAGC –TAMARA
引物合成OD数
• 1.客户需要合成多少OD数为宜？
–一般根据实验目的确定，一般PCR，2OD引物可以做 200-500次50ul标准。如果是做基因拼接或退火后的 拼接，1OD足够.
• 2.公司提供的OD数。
–按照客户要求的量合成，写在引物合成报告单上。 –如不注明，则默认提供2OD。 –一般公司会留有3个月以内客户引物的备份
• 可用于补发或检测
引物定量
• 准确性：酶标仪定量。 • 不准的原因:分装问题、系统误差(小于10%是允许的) • 引物丢失：
–先瞬离再开盖，防止引物干粉飞扬。
• 验证：2OD引物加1ml水，溶解混匀后取100ul,加900ul水，用 紫外线分光光度计（260nm）读数为0.2 。
引物溶解及浓度
全基因合成 根据实验要求定
反义核酸 根据实验要求定
修饰引物 根据实验要求定
纯度级别要求
OPC PAGE OPC, PAGE OPC OPC,PAGE,HPLC OPC,PAGE,HPLC PAGE PAGE PAGE, HPLC
常见问题
• 引物合成OD数 • 引物定量 • 引物溶解及浓度 • 引物Tm值
梯度确定。
• 报告单上两个Tm：
–Tm（0.05M Na+）:用于PCR –Tm（1M Na+）：杂交
• 成品引物以干粉形式，呈白色或无色絮状 (-20℃，1年) 。
• 保存浓度：100umol/L(-20℃，数周)。
–溶解方法：
• 按照报告单Note加水（或TE ph8.0） • 按以下公式计算：
V（ul）=OD数*33*10000/引物分子量
• 使用浓度：10-25pmol/ul
引物Tm值
• Tm值（解链温度:使50%的DNA发生变性时的温度） • =4（G+C）＋2（A+T） • 退火温度：取上下游引物的TM中间值+/-5℃做温度
• 引物合成技术在生命科学领域应用极为广泛，如PCR扩增、 DNA杂交、基因合成及DNA测序等。
引物合成方法及原理
• 合成方法：固相亚磷酰胺三酯法。
• 特点:
–高效 –快速的偶联 –起始反应物比较稳定
引物合成原理
将DNA固定在固相载体上由3‘→5’完成DNA 链的合成，相邻的核苷酸通过3‘→5’磷酸 二酯键连接。通过碱性高温处理，将连接 在载体上的引物切下来，通过OPC, PAGE 等纯化引物，成品引物用C18浓缩,脱盐， 沉淀,沉淀后的引物用水悬浮，测定OD260定 量，根据定单要求分装。
修饰及标记引物
• 30多种引物修饰及标记类型：
–稀有碱基修饰：硫代修饰、甲基化 –引物5′端的修饰及标记 –引物3′端的修饰及标记 –双标记探针 –分子信标
• 发货时间：3-5个工作日。
引物纯化方式
• C18柱脱盐 • OPC 纯化 • PAGE纯化 • HPLC纯化
• C18柱脱盐：（简易反相柱）。
• HPLC纯化：用高效液相色谱的原理，纯度可 以大于99%。主要用于长链和修饰引物的纯 化.成本较高，批量生产效率不高。
应用
引45base
一般PCR扩增
>45 base
诊断PCR扩增
< 40base
DNA测序
20base左右
亚克隆，点突变 根据实验要求定
基因构建 根据实验要求定
引物合成流程
DNA合成仪
• DNA合成仪有很多种, 主要都是由ABI/PE 公司生 产，无论采用什么机器合成，合成的原理都相同， 主要差别在于合成产率的高低，试剂消耗量的不 同和单个循环用时的多少。
• Doctor Oligo-192 6台,美国Biolytic公司
• 世界上最好的高通量DNA/RNA合成仪!
–有效地去除盐分
–不能有效去除比目的片段短的小片段
–一般不会对普通PCR反应产生影响
–不能用于测序、克隆
• OPC纯化:根据DNA保护基和Cartridge柱中树 脂间的亲合力作用的原理进行纯化目的DNA 片段。纯度大于95%。适用于40mer以下引物 的纯化。
• PAGE纯化：用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，对 DNA片段进行分离，然后从凝胶中回收目的 DNA的方法。纯度大于95%，对长链Oligo DNA (大于50mer)的纯化特别有效。