重组蛋白分离纯化方法选择的基因原则
重组蛋白质的表达与纯化
重组蛋白质的表达与纯化重组蛋白质是指通过基因工程技术将目标蛋白的基因导入到宿主细胞中，使其在宿主中表达并纯化得到的蛋白质。
这项技术应用广泛，被广泛用于生物制药、医学研究以及工业生产等领域。
下面将详细介绍重组蛋白质的表达与纯化过程。
一、重组蛋白质表达过程1. 选择表达宿主重组蛋白质表达宿主的选择十分重要。
常用的表达宿主包括大肠杆菌（E. coli）、酵母（yeast）、哺乳动物细胞等。
不同的表达宿主具有不同的特点和适用范围。
例如，大肠杆菌是最常用的表达宿主之一，具有高表达水平、易操作、成本低等特点。
2.构建表达载体表达载体是将目标基因导入宿主细胞的载体。
常用的表达载体有质粒、病毒载体等。
质粒是最常用的表达载体，它可轻松被细菌胞内扩增，并在细胞内产生大量目标蛋白。
3.转染和表达将构建好的表达载体导入到宿主细胞中，实现转染。
转染有多种方法，如电穿孔法、化学法、微粒子轰击法等。
转染后，宿主细胞会开始表达目标基因，合成目标蛋白。
4.优化表达条件为了提高重组蛋白质的产量和纯度，需要对表达条件进行优化。
常见的优化方法包括调节培养基成分、改变培养条件、优化诱导剂浓度等。
二、重组蛋白质的纯化过程1.细胞破碎与分离表达宿主中产生的重组蛋白质往往与其他细胞组分混合在一起，需要通过细胞破碎与分离来获取目标蛋白。
细胞破碎方法包括机械法、超声法、高压法等。
分离方法包括离心、电泳、柱层析等。
2.柱层析柱层析是常用的蛋白质纯化方法之一，它基于蛋白质在柱中不同吸附剂上的亲和力差异来实现分离纯化。
常用的柱层析方法有离子交换层析、亲和层析、凝胶过滤层析等。
3.其他纯化方法除了柱层析外，还有许多其他的纯化方法可供选择。
例如，凝胶电泳、过滤、冷冻干燥等。
这些方法通常用于进一步提纯和去除杂质，以获得纯度更高的重组蛋白质。
三、重组蛋白质应用与挑战重组蛋白质的应用广泛，涉及到生物制药、医学研究、农业等领域。
例如，通过重组蛋白质技术，可以生产用于治疗疾病的药物，如人胰岛素、白介素等。
蛋白质纯化的一般原则及方法选择
随着分子生物学的发展，越来越多的科研人员熟练掌握了分子生物学的各种试验技术，并研制成套试剂盒，使基因克隆表达变得越来越容易lIl。
但分子生物学的上游工作往往并非是最终目的，分子克隆与表达的关键是要拿到纯的表达产物，以研究其生物学作用，或者大量生产出可用于疾病治疗的生物制品。
相对与上游工作来说，分子克隆的下游工作显得更难，蛋白纯化工作非常复杂，除了要保证纯度外，蛋白产品还必须保持其生物学活性。
纯化工艺必须能够每次都能产生相同数量和质量的蛋白，重复性良好。
这就要求应用适应性非常强的方法而不是用能得到纯蛋白的最好方法去纯化蛋白。
在实验室条件下的好方法却可能在大规模生产应用中失败，因为后者要求规模化，且在每日的应用中要有很好的重复性。
本文综述了蛋白质纯化的基本原则和各种蛋白纯化技术的原理、优点及局限性，以期对蛋白纯化的方法选择及整体方案的制定提供一定的指导。
1 蛋白纯化的一般原则蛋白纯化要利用不同蛋白间内在的相似性与差异，利用各种蛋白间的相似性来除去非蛋白物质的污染，而利用各蛋白质的差异将目的蛋白从其他蛋白中纯化出来。
每种蛋白间的大小、形状、电荷、疏水性、溶解度和生物学活性都会有差异，利用这些差异可将蛋白从混合物如大肠杆菌裂解物中提取出来得到重组蛋白。
蛋白的纯化大致分为粗分离阶段和精细纯化阶段二个阶段。
粗分离阶段主要将目的蛋白和其他细胞成分如DNA、RNA等分开，由于此时样本体积大、成分杂，要求所用的树脂高容量、高流速，颗粒大、粒径分布宽．并可以迅速将蛋白与污染物分开，防止目的蛋白被降解。
精细纯化阶段则需要更高的分辨率，此阶段是要把目的蛋白与那些大小及理化性质接近的蛋白区分开来，要用更小的树脂颗粒以提高分辨常用的离子交换柱和疏水柱，应用时要综合考虑树脂的选择性和柱效两个因素。
选择性指树脂与目的蛋白结合的特异性，柱效则是指蛋白的各成分逐个从树脂上集中洗脱的能力，洗脱峰越窄，柱效越好。
仅有好的选择性，洗脱峰太宽，蛋白照样不能有效分离。
蛋白质分离纯化
2. 3 等电聚焦
依据：在pH梯度中的平衡位置。
用两性电解质，多乙烯多胺与丙烯酸的同系多异构体 混合物。在电场作用下，形成连续平滑的pH梯度， 而酶样品在其中也形成相同的等电点pH梯度。 分辩率高，pI相差0.01 pH的酶与蛋白质可分离 。
注意：在pI附近蛋白质容易沉淀，影响分离的数量和 质量。
1 蛋白质的分离方法
（1）以大小或质量为依据： 离心（300000g)、凝胶过滤（Sephadex交联葡聚糖、
Bio-Gel交联聚丙烯酰胺）、透析、超过滤
（2）以电荷为依据： 离子交换色谱（低离子强度、适当pH） DEAE-
Sephadex、 CM- Sephadex、 DEAE-纤维素、CM-纤维 素；电泳（电荷、分子大小、分子形状）、纤维素粉末、 淀粉、聚丙烯酰胺；等电聚焦（pH梯度中的平衡位置）
（3）以溶解度变化为依据
3.1 盐析--改变pH(等电点沉淀法) 3.2 盐析--改变离子强度 3.3 PEG沉淀法
3.1 改变pH (等电点沉淀法)
调整pH至酶的等电点。
原理： 溶解度随分子引力加大而减小，其他条
件相同，当pH在等电点附近时,分子引力最大， 蛋白质就沉淀。
一般不单独使用，配合其他方法使用。
3.2 改变离子强度
• 盐溶现象：加入离子有助于分散大分子上 所带的电荷而使溶解度提高。
• 盐析：离子强度提高到超过某一数值，带 电分子将会沉淀下来。
1. 在蛋白质溶液中加入大量中性盐，以破坏蛋白质 的胶体性质，使蛋白质从溶液中沉淀析出，称为盐 析。 2. 常用的中性盐有：硫酸铵、氯化钠、硫酸钠等。 3. 盐析时，溶液的pH在蛋白质的等电点处效果最好。 4. 盐析沉淀蛋白质时，通常不会引起蛋白质的变性。
重组蛋白的概述
重组蛋白的概述1.概述分离纯化组成了基因工程的下游处理（downstream processing）阶段，这一过程又和上游过程紧密相联系，上游过程的诸方面影响到下游的分离纯化，所以在进行目标蛋白质表达纯化时要统一考虑和整体设计，并充分考虑上游因素对下游的影响，如是否带有亲和标签，是否进行分泌表达。
目前应用最广泛的表达系统有三大类，分别是大肠杆菌表达系统、酵母表达系统和CHO细胞表达系统，不同的表达系统和培养方法显著影响下游的处理过程，目标蛋白表达是否形成包涵体，目标蛋白表达的定位（胞内、细胞内膜、周质空间和胞外），蛋白表达的量都依赖于所选择的表达系统。
选择将所表达的蛋白分泌到细胞外或周质空间可以避免破碎细胞的步骤，并且由于蛋白质种类少，目标蛋白容易纯化；而在细胞质内表达蛋白，可能是可溶性表达，可能形成包涵体，可溶性的蛋白往往需要复杂的纯化步骤，而包涵体易于分离，纯度较高，但回收具有生物活性的蛋白却变的相当困难，需要对聚集的蛋白进行变复性，通常活性蛋白的得率比较低，表1列出了不同策略对表达、纯化的影响，对于其中的有些缺点可以通过一定的方法进行克服和避免，如利用DNA重组技术给外源蛋白加上一个亲和纯化的标签，有助于可溶性外源蛋白的选择性纯化，并能保护目标蛋白不被降解（96）。
表 1 重组蛋白不同表达策略的优点和缺点表达策略优点缺点分泌表达至细胞外增强正确二硫键的形成降低蛋白酶对表达蛋白的降解可获得确定的N末端显著减少杂蛋白水平，简化纯化不需要细胞破碎表达水平低多数蛋白不能进行分泌表达表达蛋白需要进行浓缩细胞周质空间表达增强正确二硫键的形成可获得确定的N末端显著减少杂蛋白水平，简化纯化好些蛋白不能分泌进入周质空间没有大规模选择性的释放周质空间蛋白的技术周质蛋白酶可引起重组蛋白酶解胞内包涵体表达包涵体易于分离保护蛋白质不被降解蛋白质不具有活性对宿主细胞生长没有大的影响，通常可获得高的表达水平需要体外的折叠和溶解，得率较低具有不确定N末端胞内可溶性蛋白表达不需要体外溶解和折叠一般具有正确的结构和功能高水平的表达常难以得到需要复杂的纯化可发生蛋白质的酶解具有不确定的N末端在细胞的提取物中，除了目标蛋白外，还含有其它各种性质的蛋白、核酸、多糖等。
重组蛋白质的分离纯化 (1)
重组蛋白质的分离纯化摘要：90年代以来基因重组技术得到很大的发展，基因工程产品的分离纯化的成本约占其全部成本的60%～80%，因此重组蛋白的分离纯化技术越来越重要。
本文主要介绍了沉淀、液液萃取、层析等常用分离重组蛋白方法的原理及应用，旨在为开展蛋白质的制备及其应用研究提供理论依据。
关键词：重组蛋白质；分离；纯化；沉淀；液液萃取；层析；包涵体随着基因重组技术的发展，出现了很多基因工程产品，而作为基因工程技术的下游工程中的基因重组蛋白的分离纯化技术越来越显示其重要性。
据有人统计,基因工程产品的分离纯化成本约占到其全部成本的60%～80%[1]。
由此可见产品的分离纯化是获得目的产物的关键一步，也是比较困难的一步，它标志着生物产业的高低。
纯化重组蛋白质和普通蛋白质的不同就在于要选择合适的表达系统，因为表达系统决定了细胞培养过程中产物的性质以及可能产生的杂蛋白，而纯化重组蛋白质的主要目的是去除杂蛋白质，通常对一种重组蛋白质的纯化会采用多个系统[2]。
但是重组蛋白有几种不同的表达形式，如细胞外的分泌表达；细胞内可溶性表达以及包涵体形式的存在，因此对于重组蛋白的纯化要依据其表达形式的不同，采取不同的纯化工艺。
与传统方式相似，重组蛋白的分离纯化也是利用其物理和化学性质的差异，即以分子的大小、形状、溶解度、等电点、亲疏水性以及与其它分子的亲和性等性质建立起来的。
目前主要的纯化方法有浓缩沉淀法，层析和电泳技术。
重组蛋白质在分离纯化的过程中，必须维持一定的浓度和生物活性形式，以及防止被降解。
因此从生物体中有效分离纯化重组蛋白质一直是个难题。
90 年代以来,国内外许多科学工作者在蛋白质分离纯化技术和工艺上进行了大量的研制和开发,将原有的纯化技术水平提高到一个新的高度。
本文将简单介绍一些传统的分离纯化方法，并介绍近10 年来重组蛋白分离纯化中的新进展和一些新出现的技术。
1 沉淀分离技术1.1 盐析法其原理是蛋白质在高浓度盐溶液中，随着盐浓度的逐渐增加，由于蛋白质水化膜被破坏、溶解度下降而从溶液中沉淀出来。
重组蛋白分离纯化方法选择的基因原则
多种分离纯化技术的联合运用
在进行重组蛋白的纯化时，通常需要综合使用多种技术，一般来 说，在选择分离纯化方法时应遵循下列原则：
应选择不同分离纯化机理的方法联合使用 应首先选择能除去含量最多杂质的方法 应尽量选择高效的分离方法 应将最费时、成本最高的分离纯化方法安排在最后阶段
合适分离纯化介质的选择
常用的蛋白质分离纯化介质有Sephadex和Seperose。理想的分 离纯化介质应具有下列性质：
采用包涵体型战略表达重组蛋白，应先离心回收包涵体； 采用融合型战略表达重组蛋白，一般是胞内可溶性的，拟首先选 用亲和层析进行纯化 表达在细胞膜和细胞壁之间的间隙中的蛋白质，应用低浓度的溶 菌酶处理，然后再用渗透压休克法释放重组蛋白。
针对不同性质的重组蛋白选择不同的层析类型
等电点处于极端区域（pI≤5 或 pI≥8）的重组蛋白应首选离子 交换法进行分离，这样很容易除去几乎所有的杂蛋白；
对目标蛋白具有较高的分离效率 对目标蛋白不会造成变性 化学性能和机械性能稳定，重复性好 价格低廉
ห้องสมุดไป่ตู้
分离纯化过程的规模化
蛋白质分离纯化的实验室工艺、技术、方法在大规模产业化过程 未必合适，如：
实验室方法在工程上可能难以实现（超声波破细胞壁） 实验室方法在大规模生产中可能成本过高（超速离心） 因此，在很多情况下，实验室的技术路线不等于生产工艺。
重组蛋白特异性的配体、底物、抗体、糖链等都是首选亲合层析 纯化方法的重要条件，原则是它们与目标蛋白之间的解离常数应在合 适的范围内（10-8- 10-4 mol / L）；
疏水层析和反相层析是根据蛋白质的疏水性差异进行分离的； 凝胶过滤层析是根据蛋白的分子量和体积差异进行分离的； 径向层析是近年来发展起来的集层析分离和膜分离于一体的一种 复合技术，在流量、负荷量等参数方面显示出极大的优越性。
重组蛋白质的表达纯化和结构鉴定
重组蛋白质的表达纯化和结构鉴定在生物医学领域中，重组蛋白质凭借其广泛的应用前景成为了研究热点。
然而，要想获得高纯度的重组蛋白质，并对其结构进行准确的鉴定，需要经历一系列复杂而细致的实验步骤。
本文将从表达、纯化和结构鉴定三个方面介绍重组蛋白质的研究过程。
一、表达重组蛋白质的表达是研究重组蛋白质最初的关键步骤之一。
通常采用大肠杆菌（Escherichia coli）作为表达宿主。
首先，需要将目标基因克隆至表达载体中，确保其与启动子、转录因子等相互配合，并携带一定的标签，如His 标签、GST 标签等。
接着，将修饰好的表达载体转化至大肠杆菌中，采用选择性培养基筛选出目标菌株。
最后，将筛选得到的菌株进行大规模培养，促使目标基因在细胞内表达。
二、纯化获得表达目标蛋白的菌株后，需要将蛋白从细胞中纯化出来。
首先，采用超声波或高压颠破细胞壁，释放出蛋白质。
接着，通过离心等手段将蛋白质与其他细胞组分分离。
此时，可以利用目标蛋白质特异性的亲和层析柱，如镍柱、葡聚糖柱等，吸附目标蛋白质，并通过逆向洗脱等方法，得到高纯度的目标蛋白质。
三、结构鉴定获得纯度较高的重组蛋白质后，需要对其结构进行进一步的鉴定。
常用的结构鉴定方法包括X射线晶体学、核磁共振（NMR）、电子显微镜等。
X射线晶体学是目前应用最广泛的方法，通过将蛋白质结晶并进行X射线衍射实验，得到蛋白质的高分辨率结构。
NMR则通过测量蛋白质中核自旋的相对位置和相互作用关系，获取蛋白质的三维结构信息。
电子显微镜是一种能够获得蛋白质高分辨率结构的技术，主要应用于研究大分子复合物和纤维形态的蛋白质。
除了上述常用技术外，近年来还涌现出一些新的结构鉴定方法，如质谱联用技术、光学显微镜成像、负染电镜等。
这些方法的出现，为蛋白质结构鉴定提供了更多的选择和便利。
由于篇幅所限，本文仅对重组蛋白质的表达、纯化和结构鉴定进行了简要介绍。
事实上，研究重组蛋白质的过程还包括目标基因的设计与合成、蛋白质的功能分析等环节。
蛋白质纯化
蛋白质纯化蛋白质的分离纯化在生物化学研究应用中使用广泛，是一项重要的操作技术。
一个典型的真核细胞可以包含数以千计的不同蛋白质，一些含量十分丰富，一些仅含有几个拷贝。
为了研究某一个蛋白质，必须首先将该蛋白质从其他蛋白质和非蛋白质分子中纯化出来。
蛋白纯化的一般原则蛋白纯化要利用不同蛋白间内在的相似性与差异，利用各种蛋白间的相似性来除去非蛋白物质的污染，而利用各蛋白质的差异将目的蛋白从其他蛋白中纯化出来。
每种蛋白间的大小、形状、电荷、疏水性、溶解度和生物学活性都会有差异，利用这些差异可将蛋白从混合物如大肠杆菌裂解物中提取出来得到重组蛋白。
蛋白的纯化大致分为粗分离阶段和精细纯化阶段二个阶段。
一般蛋白纯化采用的方法为树脂法。
粗分离阶段主要将目的蛋白和其他细胞成分如DNA、RNA等分开，由于此时样本体积大、成分杂，要求所用的树脂高容量、高流速、颗粒大、粒径分布宽．并可以迅速将蛋白与污染物分开，必要时可加入相应的保护剂（例如蛋白酶抑制剂），防止目的蛋白被降解。
精细纯化阶段则需要更高的分辨率，此阶段是要把目的蛋白与那些分子量大小及理化性质接近的蛋白区分开来，要用更小的树脂颗粒以提高分辨率，常用离子交换柱和疏水柱，应用时要综合考虑树脂的选择性和柱效两个因素。
选择性指树脂与目的蛋白结合的特异性，柱效则是指各蛋白成分逐个从树脂上集中洗脱的能力，洗脱峰越窄，柱效越好。
仅有好的选择性，洗脱峰太宽，蛋白照样不能有效分离。
蛋白质纯化的一般注意事项在进行任何一种蛋白质纯化得时候，都要时刻注意维护它的稳定，保护它的活性，有一些通用的注意事项需要牢记，它们包括：1.操作尽可能置于冰上或者在冷库内进行。
2.不要太稀，蛋白浓度维持在μg/mL～mg/mL。
3.合适的pH，除非是进行聚焦层析，所使用的缓冲溶液pH避免与pI相同，防止蛋白质的沉淀。
4.使用蛋白酶抑制剂，防止蛋白酶对目标蛋白的降解；在纯化细胞中的蛋白质时，加入DNA 酶，降解DNA，防止DNA对蛋白的污染。
重组蛋白质的表达与纯化技术
重组蛋白质的表达与纯化技术蛋白质是生命体活动的重要组成部分，对于生命体的生长、繁殖和免疫功能起着至关重要的作用。
而重组蛋白质则是利用基因工程技术，将人工合成的外源基因导入到特定的宿主细胞中，通过细胞表达和纯化技术得到的转录翻译产物。
这种技术不仅可以生产天然蛋白质，还可以生产人工合成的新型蛋白质，对于疾病的治疗和新药的研发有着重要的意义。
一、蛋白质表达技术蛋白质表达是获得大量重组蛋白质的重要方法。
选择适当的宿主细胞和表达载体是获得高水平表达的关键。
常用的宿主细胞包括大肠杆菌、酵母菌、昆虫细胞、哺乳动物细胞等。
1.大肠杆菌表达系统大肠杆菌表达系统具有生长快、表达量高等优点，广泛应用于重组蛋白质的表达和纯化。
其表达载体主要有pET和pBAD两种，pET系统一般用于产生可以形成包涵体的重组蛋白，pBAD系统用于在分泌表达中产生滞留蛋白。
2.昆虫细胞表达系统昆虫细胞表达系统包括SF9、Sf21、HighFive等细胞系，常用的表达载体为pIB/V5-His、pFastBac等。
昆虫细胞表达系统通常用于表达大分子蛋白质，如糖蛋白、膜蛋白等。
3.哺乳动物细胞表达系统哺乳动物细胞表达系统是目前表达规模最大、表达产物最接近人体蛋白质的一种表达系统。
其表达载体主要有pCDNA3.1、pCI 等，常用于表达与人体有关的蛋白质，如抗体、生长因子等。
二、蛋白质纯化技术蛋白纯化是重组蛋白质生产的重要环节，其目的是得到高质量的、纯度较高的蛋白质样品。
常见的纯化方法包括亲和层析法、离子交换层析法、凝胶过滤层析法、逆流式层析法等。
1.亲和层析法亲和层析法是指因与载体中固定的亲和剂相互结合而纯化目标蛋白质的一种方法。
亲和剂通常是与目标蛋白质有特异性结合作用的化合物，如亲和标签、酶底物、抗体等。
常见的亲和层析方法有亲和柱层析、亲和膜层析等。
2.离子交换层析法离子交换层析法是根据蛋白质带有正或负电荷的差异性进行分离的一种方法。
离子交换层析的柱填充物常为离子交换树脂，其一般分为阴离子交换树脂和阳离子交换树脂两种。
蛋白纯化原则和技术介绍
蛋白纯化原则和技术概览无论是蛋白研究还是应用，通常需要将蛋白利用不同的生物系统表达出来，然后进行分离和纯化。
研究实验室通常需要纯化微克或毫克级别的蛋白质，而工业上需要纯化数千克甚至数吨的蛋白质。
因此，蛋白纯化非常重要。
纯化过程中，主要需要考虑宿主污染、样品的可溶性、蛋白结构的完整性和生物活性。
蛋白的纯化可大致分为样品捕获、中度纯化阶段和精细纯化阶段3个阶段。
✓样品捕获：分离、浓缩和稳定化处理；✓中度纯化：去除核酸等其他细胞成分，可使用硫酸铵沉淀法；✓精细纯化：将靶蛋白与其他大小及理化性质接近的蛋白区分开来，常用方法包括凝胶过滤层析、离子交换层析、亲和层析等。
蛋白纯化指导原则1. 明确目标，避免过度纯化或者纯化不够；表1. 对蛋白样本纯度要求的例子。
2、明确样本特性和主要的杂质，选择合适的纯化方法；可以通过检测蛋白稳定性窗口（如pH值、离子强度）和蛋白基础数据（如蛋白大小、等电点pl、疏水性、可溶性等）快速确定纯化技术组合。
3、能够快速检测蛋白的回收率、活性和杂质情况；4、尽量减少步骤，从而避免样本损失过多和活性降低过多；5、尽早除去蛋白酶等对样品有损害的杂质；6、尽量少使用添加剂，否则可能需要额外的步骤去除添加剂。
蛋白纯化方法由于样品和蛋白的性质各异，所含杂质也不尽相同，因此需要采用不同的蛋白纯化策略。
目前主要有六种蛋白纯化方法：凝胶过滤层析、离子交换层析、标签纯化、亲和层析、疏水作用层析、电泳等。
其他方法也可用于蛋白纯化，比如利用蛋白的热稳定性、蛋白酶解稳定性、溶解度等特性纯化蛋白。
1 凝胶过滤层析凝胶过滤层析是一种高效的蛋白分离纯化方法，根据分子大小的差异分离蛋白质混合物。
在蛋白溶液通过含有填充颗粒的凝胶过滤层析柱时，由于不同蛋白的分子大小不同，扩散进入特定大小孔径颗粒的能力也因此各不相同，大分子蛋白率先被洗脱出来，分子量越小，洗脱越晚，从而达到蛋白分离和纯化的目的。
一般来说，越细、越长的凝胶过滤层析柱的纯化效果越好。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
采用包涵体型战略表达重组蛋白，应先离心回收包涵体； 采用融合型战略表达重组蛋白，一般是胞内可溶性的，拟首先选
用亲和层析进行纯化 表达在细胞膜和细胞壁之间的间隙中的蛋白质，应用低浓度的溶 菌酶处理，然后再用渗透压休克法释放重组蛋白。
针对不同性质的重组蛋白选择不同的层析类型
等电点处于极端区域（pI≤5 或 pI≥8）的重组蛋白应首选离子 交换法进行分离，这样很容易除去几乎所有的杂蛋白； 重组蛋白特异性的配体、底物、抗体、糖链等都是首选亲合层析 纯化方法的重要条件，原则是它们与目标蛋白之间的解离常数应在合 适的范围内（10-8- 10-4 mol / L）； 疏水层析和反相层析是根据蛋白质的疏水性差异进行分离的； 凝胶过滤层析是根据蛋白的分子量和体积差异进行分离的；
组别分离
将样品中的大分子物质与小分子物质分开，称为组别分离，其分 离策略是使高分子物质完全被排阻，小分子物质完全渗入凝胶内。
组别分离一般选用Sephadex G-25或G-50，对于小肽和低分子量 的物质（分子量范围1000-5000）的脱盐可选用Sephadex G-10、G15、Bio-Gel P-2或P-4
60
70
80
90
10 外源基因表达产物的分离纯化
C 凝胶层析
凝胶层析的基本原理 凝胶介质的基本性质 凝胶介质的选用原则 凝胶层析的基本操作
凝胶层析的基本原理
凝胶层析是利用有一定孔径范围的多孔凝胶作为固定相，对混合 物中各组份按分子大小进行分离的层析技术，又称为分子筛
分子直径比凝胶最大孔隙直径大的，会被全部应将最费时、成本最高的分离纯化方法安排在最后阶段
合适分离纯化介质的选择
常用的蛋白质分离纯化介质有Sephadex和Seperose。理想的分 离纯化介质应具有下列性质：
对目标蛋白具有较高的分离效率
对目标蛋白不会造成变性
化学性能和机械性能稳定，重复性好
价格低廉
分离纯化过程的规模化
离子交换介质的基本性质
常用的离子交换剂
离子交换树脂： 最常见的离子交换树脂是含有酸性或碱性基团的人工合成的聚苯 乙烯-二乙烯苯不溶性高分子化合物 离子交换树脂的优点是：流速快，对小分子物质的交换容量大， 因而适合用于氨基酸、核苷酸等小分子生化物质的分离纯化
离子交换介质的基本性质
常用的离子交换剂
离子交换纤维素：
离子交换介质的基本性质
离子交换剂的分类
阳离子交换剂：强酸型和弱酸型 可电离的基团 磺酸基（-SO3H） 磷酸基（-PO3H2） 羧酸基（-COOH） 酚羟基（-OH） 阴离子交换剂：强碱型和弱碱型 可电离的基团 伯胺基（-NH2） 仲胺基（-NHCH3 ） 叔胺基（-N(CH3)2） 季胺基（-N+(CH3) 3 ）
蛋 白 质 净 电 荷
+
等电点 吸附阴离子交换剂 pH
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
吸附阳离子交换剂
pH < pI（+） pH = pI（0） pH > pI（-）
应首选CM纤维素
离子交换层析的基本操作
层析柱平衡
平衡缓冲液的用量至少为柱体积的 2 倍 平衡缓冲液的流速可略高于正常操作流速 平衡终点以流出液的离子浓度、导电性、pH值与缓冲液一致 为准，其中pH值最重要
窄，这样洗脱出的峰形好
10 外源基因表达产物的分离纯化
D 亲和层析
亲和层析的基本概念 亲和层析载体的性质与选择
亲和层析配基的性质与选择
亲和层析的基本操作
亲和层析的基本概念
亲和层析的基本特点
亲和层析是利用待分离物质与其特异性配体之间特异性的亲和力 进行分离的一类特殊的层析技术，它有如下特点： 纯化过程简单、迅速，且分离效率高 特别适用于分离纯化一些含量低、稳定性差的生物大分子 纯化倍数大，产物纯度高 必须针对某一分离对象制备专一的配基及寻求稳定的层析条件 因此应用范围受到一定的限制
离子或阴离子起交换作用 如果有两种以上的成分被吸附在离子交换剂上，则在用洗脱液洗 脱时，各成分被洗脱的可能性取决于各自反应的平衡常数 吸附在离子交换剂上的蛋白质可通过改变pH使吸附的蛋白质失去 电荷而解离下来 不同蛋白质与离子交换剂之间形成离子键数目不同，即亲和力大 小有差异，因此只要选择适当的洗脱条件便可将混合物中的成分逐个 洗脱下来，达到分离纯化的目的
凝胶介质的基本性质
琼脂糖凝胶
琼脂糖凝胶是由琼脂中分离出来的天然凝胶，常见的有Sepharose （ Sepharose 2B、4B、6B，数字代表干胶的百分比 ）和Bio-Gel-A等 （Bio-Gel-A 0.5M、1.5M、5M、15M、50M、150M，数字X106代表排 阻限度。 当温度高于50℃时琼脂糖凝胶便融化，只能在较低的温度下使用。 琼脂糖凝胶是一种大孔凝胶，因而适合于分离分子量较大的生物大 分子物质（如蛋白质和DNA）。 Sepharose CL是二溴丙醇交联的琼脂糖，其孔径大小和分离范围 与普通琼脂糖一样，但热和化学稳定性增加，能高温消毒。
外源基因表达产物的分离纯化
A 重组蛋白分离纯化方法选择的基因原则
针对不同的产物表达形式采取不同的策略
针对不同性质的重组蛋白选择不同的层析类型
多种分离纯化技术的联合运用
合适分离纯化介质的选择
分离纯化过程的规模化
针对不同的产物表达形式采取不同的策略
采用分泌型战略表达重组蛋白，通常体积大、浓度低，因此应在 纯化之前采用沉淀或超滤等方法先进行浓缩处理；
凝胶介质的选用原则
分级分离
将样品中一些分子量比较接近的物质分开，这种分离叫分级分离 该策略是使高分子物质完全被排阻，小分子物质完全渗入凝胶内。
分级分离一般选用排阻限度略大于样品中最高分子量物质的凝胶 在层析过程中，样品中各组份均能不同程度地深入到凝胶内部，但由 于深入凝胶空隙程度上的差异，最后得到分离。
离子交换纤维素是携带功能基团纤维素衍生物，具有松散的亲水 性网状结构以及较大的表面积，大分子可以自由通过，因而对生物大 分子（如蛋白质）的交换容量比离子交换树脂大
阳离子型离子交换纤维素包括羟甲基纤维素（CM纤维素）等
阴离子型离子交换纤维素包括二乙基氨基乙基纤维素（DEAE纤
维素）
离子交换介质的基本性质
离子交换层析的基本原理
离子交换层析是以离子交换剂为固定相，以特定的含离子溶液为
流动相，利用离子交换剂对待分离的各种离子结合力的差异，而将混
合物中不同离子进行分离的层析技术。
离子交换介质的基本性质
离子交换剂的基本性能
离子交换剂亦称离子交换介质，通常是一种不溶性高分子化合物 如树脂，纤维素，葡聚糖，醇脂糖等； 离子交换剂中所含的可解离基团在水溶液中能与溶液中的其它阳
合，其它没有亲和力的无关组份就随流动相流出
然后改变流动组成份，将结合的亲和物洗脱下来
亲和层析载体的性质与选择
凝胶层析的基本操作
层析柱平衡
平衡溶液的流速应低于层析时需要的流速 注意凝胶的断层和气泡
操作压控制
平衡和洗脱时应维持流速恒定 恒定的操作压是恒流的先决条件
凝胶层析的基本操作
进样体积
上柱样品溶液的体积根据分离要求来确定： 进行组别分离时，样品溶液最大可为柱体积的10% 进行分级分离时，样品溶液的体积要小，使样品层尽可能
离子交换介质的基本性质
常用的离子交换剂
离子交换葡聚糖：
常用的离子交换葡聚糖包括： 阳离子交换剂 CM-Sephadex C-25，CM-Sephadex C-50 Sephadex C-25，Sephadex C-50 阴离子交换剂 DEAE-Sephadex A-25，DEAE-Sephadex A-50 QAE-Sephadex A-25，QAE-Sephadex A-50
亲和层析的基本概念
具有特异性亲和作用的生物分子
抗原与抗体 DNA与互补DNA或RNA（cDNA、mRNA) 酶与其底物、竞争性抑制剂、辅酶因子 激素或药物与其受体
维生素于其特异性结合蛋白
糖蛋白与其相应的植物凝集素
亲和层析的基本概念
亲和层析的基本原理
亲和的一对分子中的一方以共价键形式与不溶性载体相连 作为固定相吸附剂 当含有混合组份的样品（流动相）通过此固定相时，只有 和固定相分子有特异亲和力的物质，才能被固定相吸附结
蛋白质分离纯化的实验室工艺、技术、方法在大规模产业化过程 未必合适，如： 实验室方法在工程上可能难以实现（超声波破细胞壁） 实验室方法在大规模生产中可能成本过高（超速离心） 因此，在很多情况下，实验室的技术路线不等于生产工艺。
10 外源基因表达产物的分离纯化
B 离子交换层析
离子交换层析的基本原理 离子交换介质的基本性质 离子交换介质的选择原则 离子交换层析的基本操作
离子交换层析的基本操作
样品进柱
为了达到满意的分离效果，进样量一般为介质交换容量的10-20% 为了避免进样溶液中的离子强度过高，样品浓度不宜太高
交换容量：离子交换剂中全部可交换的离子或功能基团的总数
离子交换层析的基本操作
样品洗脱
分子浓度
离子强度
pH值
恒定洗脱 阶段洗脱
梯度洗脱
10
20
30
40
50
外，即全排阻；两种全排阻的分子即使大小不同，也不能分开；它们 下行速度快 分子直径比凝胶最小孔隙直径小的，能进入凝胶颗粒的全部孔隙 即使大小不同也不能分开；它们的下行速度慢 鉴于上述原理，凝胶层析可用于重组蛋白溶液脱盐、分子量测定
以及分离纯化。
凝胶介质的基本性质
葡聚糖凝胶（ Sephadex ）
葡聚糖凝胶的种类有G10、G15、G25、G50、G75、G100、G 150、G200，G50即表示每克干凝胶的吸水量为5.0毫升 葡聚糖凝胶对碱比较稳定，在酸性环境中其糖苷键易水解 湿态的葡聚糖可加热到110℃，干的则能耐受120℃高温 Sephadex LH是羟丙基化的Sephadex，这类层析介质的流动相既 可使用缓冲水溶液，也可使用极性有机溶剂，因此适用于非水溶性溶 质的凝胶过滤