铜绿假单胞菌检验原始记录
黏液型铜绿假单胞菌感染实验鉴定和病例回顾分析
黏液型铜绿假单胞菌感染实验鉴定和病例回顾分析铜绿假单胞菌（pseudomonas aeruginosa，Pa）在由各种原因所致的人体抵抗力低下时引起皮肤感染、呼吸道感染、泌尿道感染、烧伤感染等，亦可导致菌血症、心内膜炎、囊性纤维变性，该菌引起的慢性肺部感染占有较大的比例。
其临床表型分为黏液型及非黏液型。
黏液型铜绿假单胞菌（mucoid pseudomonas aeruginosa，mPa）与非黏液型在生长特点、致病性及药物敏感方面均存在差异。
现对我院分离的一株mPa进行回顾性分析，以此为临床诊疗提供一些帮助。
实验室鉴定一、研究对象临床微生物室分离的一株mPa，药敏试验同时采用纸片琼脂扩散法（K-B法）和肉汤稀释法（MIC法），作对照比较。
二、试剂和仪器深圳迪尔DL-96细菌测定系统及其提供的NE鉴定板条，普通公司的MH肉汤和MH琼脂平板，英国OXOID公司生产的药敏纸片，质控菌株铜绿假单胞菌ATCC27853、大肠埃希菌ATCC25922、金黄色葡萄球菌ATCC25923均购自湖北省临检中心。
三、方法1.菌株鉴定及药敏试验取病患留取的晨痰做涂片和接种哥伦比亚血平板、含万古巧克力平板（三区划线），痰涂片一张行革兰氏染色，一张行萋-尼抗酸染色。
镜检为合格痰（上皮细胞25个/LP），未发现抗酸阳性杆菌。
平板在35℃、C02孵箱培养24h后观察，均长出水滴样菌落，在血平板的第三区，水滴样菌落>5个，半定量判定为4+，具有临床意义。
取巧克力平板上水滴样菌落分纯，第二天做氧化酶试验：阳性。
刮取黏液型菌落接种于营养肉汤，35℃孵育5h后，调节菌液浓度至0.5麦氏单位，按照试验要求接种迪尔公司提供的NE板条；无菌棉拭子蘸取MIC法多余的药敏液接种MH平板，贴药敏纸片。
35℃孵育48h判读结果。
2.结果48h后，利用迪尔DL-96细菌测定系统判读为铜绿假单胞菌（P：99.58），两种方式的药敏结果如下（以2017年更新的CLSI为判读标准）：3.比较发现哌拉西林、头孢他啶的药敏结果不相符，美罗培南的K-B抑菌圈直径过大（标准菌株ATCC27853对美罗培南的抑菌圈直径为27～33mm）。
药品微生物限度检验记录(铜绿甲单胞菌)
氧化酶试验
培养基
名称
营养琼脂培养基
绿
脓
菌
试
验
培养基
名称
PDP琼脂培养基
批号
批号
培养
温度
℃
培养
温度
℃
时间
日时至日时，计小时
时间
日时至日时，计小时
现象：
现象：
结果判定：
结果判定：
检验项目标准规定检验结果
铜绿假单胞菌每1不得过检出□未检出 □检出结论：检验人：复核人：
药品微生物限度检验记录
（铜绿假单胞菌）
检验号REC-QC-057-00
品名
跌打活血散（混合生药粉）
规格
批号
数量
来源
紫外消毒时间
时分至时分
取样日期
报告日期
检验依据
铜绿假单胞菌
增菌培养：取供试液10ml，直接接种至适量（不少于100ml）的胆盐乳糖培养基中，培养。
培养基
名称
胆盐乳糖培养基
培养
温度
℃
批号
时间
日时至日时，计小时
分离培养：取上述培养物，划线接种于溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基的平板上，培养。
培养基
名称
溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基
培养
温度
℃
批号
时间
日时至日时，计小时
现象：
确证试验：从上述分离平板上挑选2〜3个疑似菌落，分别接种于营养琼脂培养基斜面上，培养18〜24小时。取斜面培养物进行革兰染色、镜检及氧化酶试验。
食品中铜绿假单胞菌检测
自动生化鉴定仪器 生化试剂条（以国标法为参照，二者符 合率99.6％- 参考文献）
操作步骤-水样过滤
在100级的洁净工作台进行过滤操作。 首先用无菌镊子夹取灭菌滤膜边缘部分， 将粗糙面向上，贴放在已灭菌的滤床上， 固定好滤器，将250mL水样或稀释液通 过孔径0.45μm的滤膜过滤，然后将过滤 后的滤膜贴在已制备好的CN琼脂平板上， 平铺并避免在滤膜和培养基之间夹留着 气泡。
测试的红褐色菌落数。
– cR是产氨、氧化酶、金氏B培养基上显荧光测试 均呈阳性的红褐色菌落数。
• 举例
N=17+16×(2/5)+10×(3/5) – 17：呈蓝/绿色的菌落数； – 16：没有绿脓色素但显荧光的菌落数； – 2：产氨阳性的显荧光菌落数； – 5：进行产氨测试的显荧光菌落数； – 10：呈红褐色的菌落数； – 3：产氨、氧化酶、金氏B培养基上显荧光测试均
呈阳性的红褐色菌落数；
– 5：进行产氨、氧化酶、金氏B培养基上显荧光测 试的红褐色菌落数。
• 样品稀释 若样品污染严重，建议对样品进行稀
释，如10倍递增稀释：取30ml样液加入 至270ml无菌生理盐水中，混匀，以此类 推，进行系列稀释。
• 报告 结果以 CFU/250ml计。
• 其他确证试验方法
产荧光素实验（金氏B培养基）
铜绿假单胞菌检测方法
铜绿假单胞菌检测方法
口 邢文静 河北省保定市食 品检验所
啶 酮酸 也是 实验 室 常 用的抗 生素。 在 林 巴 斯 显 微 镜 Ｃ Ｘ ４ １）：滤 膜 ：直 径 水样作为试验样品 最 新版 的 《 食 品 安全 国家标 准包 装饮 ４ ７ ｍ ｍ， 微孔径为 ０ ． ４ ５ ｍ；紫外灯 ： 样本 Ｃ １按 １ ． ５（ １）方 法 添 加 萘 用水 》 （ Ｇ Ｂ １ ９ ２ ９ ８ — ２ ０ １ ４）中 ，规 定 为 波长应为 ３ ６ ０ ±２ ０ ｎ ｍ ： 冰箱： ０～８。 ｃ 。 啶 酮酸培 养 ，Ｃ ２按 １ ． ５（ ３） 方法 添加 铜 绿 假 单 胞 菌 不 得 检 出 。 随 着 近 期 国 １ ． ４ 操作流程 萘啶酮酸培养 ，结 果见 图 ３ 。从 图 ３检 内 有 关 铜 绿 假 单 胞 菌 污 染 成 品 水 的 报 本次实验 的具体操作流程 ，如 图 １ 测结 果看 到 ，按 １ ． ５（ ３） 方 法添 加萘 道逐 渐增 多 ，已引起 了检 测机 构和 消 所示 。 啶酮酸的效果其检 出率 明显高于按 １ ． ５ 费者的重点关注 ” Ｊ 。 １ ． ５ 比较萘 啶酮酸 的使 用方法 （ １）方 法 添 加 萘 啶 酮 酸 的效 果 。说 明 目前 ，饮 用 水 铜 绿 假 单 胞 菌 检 测 （ １） 萘 啶酮酸按假 单胞菌琼脂 基 水样经不添 加萘啶酮酸 的培养 基培养 ， 技术 方 面，除 微生 物培 养 ，还 有 聚合 培 养 基无 抑茵成 分 ，不能真 正代 表原 Ｃ Ｎ 琼脂 （ Ｃ Ｍ Ｉ Ｏ Ｉ ８ Ａ）说 明书 酶链式反 应 （ Ｐ Ｃ Ｒ） 和 环 介 导 等 温 扩 增 础 培养 基 ／ 使 用， 即培养基先灭菌再添加萘啶酮酸。 样 品的被污 染情 况 ，检验结 果 出现假 技术 （ Ｌ Ａ Ｍ Ｐ）等分 子 方 法。 其 中 ，微 阳性 的概 率显著增 加 】 。 （ ２） 萘 啶酮酸 同假单胞 菌琼脂 基 生物 培养 中需 添加 萘 啶酮酸 作为 补充
微生物检验记录表
微生物检验原始记录
检测记录与结果
培养基配制：见培养基配制记录
样品制备：按GB/T 4789 的要求进展
□ 1.固体样品：无菌称取25g样品加225mL生理盐水，均质；稀释倍数：□1:10 □1:100 □1：1000 □ 2.液体样品：需稀释的，无菌称取25mL样品加225mL生理盐水，混匀；稀释倍数：□1:10 □1:100 □1：1000
□ 3.液体样品：不需要稀释的直接吸取样液检验
□菌落总数：检验依据：□GB 4789.2 -2010 □GB/T 5750.12-2006
检验时间：菌落总数：霉菌和酵母：
注：“—〞表示在选择性培养基上无可疑菌落生长检验时间：
检验时间：
□总大肠菌群：检验依据：GB/T 5750.12-2006
注：“—〞表示在选择性培养基上无可疑菌落生长检验时间：□耐热大肠菌群：检验依据：GB/T 5750.12-2006
注：“—〞表示在选择性培养基上无可疑菌落生长检验时间：□大肠埃希氏菌：检验依据：GB/T 5750.12-2006
□致病菌□沙门氏菌□志贺氏菌□金黄色葡萄球菌
检验依据GB 317.4-.10-2006
检测人：复核人：微生物限度检验记录〔复合膜〕
检验人：复核人：微生物限度检验记录〔辅料〕
检验人：复核人：
微生物限度检验记录〔铝箔、PVC硬片〕
微生物限度检验记录〔半成品、成品〕
微生物限度检验记录〔辅料〕。
化妆品菌落总数检测原始记录
生理盐水、卵磷脂吐温80营养琼脂培养基、0.5%TTC（氯化三苯四氮唑）溶液
样品制备
取g（mL）样品以mL无菌生理盐水稀释为1:10样品稀释液。
实验步骤
1、用灭菌吸管吸取1：10稀释的检液2mL，分别注入到两个灭菌平皿内，每皿1mL。另取1mL注入到9mL灭菌生理盐水试管中(注意勿使吸管接触液面)，更换一支吸管，并充分混匀，制成1:100检液。吸取2mL，分别注入到两个灭菌平皿内，每皿1mL。如样品含菌量高，还可再稀释成1:1000，1:10000，……等，每个稀释度应换1支吸管。
备注：
项目编号
样品名称
检测项目
铜绿假单胞菌
样品性质
收样时间
检测时间
环境条件
温度： ℃ 湿度： %
检测依据及方法
《化妆品安全技术规范》2015版 第五章 微生物检验方法 2 菌落总数检验方法
设备及编号
电热恒温培养箱DHP-9082B（KLM-YQSB-006）、生物安全柜BHC-1300ⅡA2（KLM-YQSB-002）、立式蒸汽灭菌器LDZM-60KCS-Ⅱ（KLM-YQSB-022）、恒温恒湿培养箱HSP-150BE（KLM-YQSB-007）、水浴锅HH-4双列四孔（KLM-YQSB-017）
3、为便于区别化妆品中的颗粒与菌落，可在每100mL卵磷脂吐温80营养琼脂中加入1mL0.5%的TTC溶液，如有细菌存在，培养后菌落呈红色，而化妆品的颗粒颜色无变化。
4、菌落计数方法：先用肉眼观察，点数菌落数，然后再用5倍~10倍的放大镜检查，以防遗漏。记下各平皿的菌落数后，求出同一稀释度各平皿生长的平均菌落数。
2、将融化并冷至45℃~50℃的卵磷脂吐温80营养琼脂培养基倾注到平皿内，每皿约15mL，随即转动平皿，使样品与培养基充分混合均匀，待琼脂凝固后，翻转平皿， 置36℃±1℃培养箱内培养48h±2h。另取一个不加样品的灭菌空平皿，加入约15mL卵磷脂吐温80营养琼脂培养基，待琼脂凝固后，翻转平皿，置36℃±1℃培养箱内培养48h±2h，为空白对照。
铜绿假单胞菌检测(滤膜法)
铜绿假单胞菌检测（滤膜法）
录入时间:2015-4-27 10:30:42 来源：青岛海博生物
一、原理
将250mL水样用孔径为0.45μm的滤膜过滤，并将滤膜移至CN琼脂培养基上，于36℃士1℃恒温箱中培养48h，能够在溴化十六烷基三甲铵选择性培养基上生长并产生绿脓菌素，或者能够在溴化十六烷基三甲铵选择性培养基上生长并且氧化酶呈阳性、紫外光（360±20nm）照射下能发荧光、能够利用乙酰胺产氨的革兰氏阴性无芽孢杆菌，经证实为铜绿假单胞菌，则其检测结果为阳性。
二、培养基和试剂
1.假单胞菌琼脂基础培养基/CN琼脂（配制好之后低温避光保存）
2.金氏B（King’s B）培养基（配制好之后低温避光保存）
3.乙酰胺肉汤（用蒸馏水配制，配置好之后低温避光保存）
4.营养琼脂
5.氧化酶试剂
6.钠氏试剂（配制好之后低温避光保存）
7.设备和仪器
8.玻璃器具：所有玻璃器皿使用前需121℃高压蒸汽灭菌15分钟
9.恒温培养箱：36℃±1℃
10.紫外灯：波长应为360±20nm
11.滤膜：直径47mm，微孔径为0.45μｍ（处理方法：如滤膜未经灭菌，则使用前需先将
滤膜放入烧杯中，加入蒸馏水，置于沸水浴中煮沸灭菌3次，每次15 min。
前两次煮沸后需更换水，用蒸馏水洗涤2次～3次，以除去残留溶剂。
建议使用一次性无菌滤膜。
）12.显微镜：10×～100×
13.冰箱：0℃～8℃
三、操作流程图。
铜绿假单胞菌解析
发酵型
氧化型
产碱型
分离培养
• 本菌生长对营养要求不高。对有正 常菌群存在的临床标本或采自环境 中的标本应接种选择性培养基如麦 康凯琼脂培养基（MAC）；对无正 常菌群存在的临床标本如血液、脑 脊液、穿刺液等可接种普通或血琼 脂培养基。
• 在普通琼脂培养基上生长18~24h可 以见到扁平、湿润的菌落，该菌所 产生的带荧光的水溶性青脓素与绿 脓素相结合将使得培养基呈亮绿色； 在血琼脂平板上生长时可以见到在 菌落的周围有溶血环，菌落呈金属 光泽；如果是在液体培养基中则呈 浑浊状生长，在液体表面形成菌落， 而在培养基底部细菌的生长不良。
绿或灰绿 有溶血环 • MACc平：微小无光泽半透明 48h后菌落 呈棕色
鉴定
• 初步鉴定 菌体形态 菌落特征 产色素 气味 氧化酶 • 最终鉴定 非发酵菌生化鉴定系统 API-NE试条
• 细菌耐药机制
–外膜通透性降低 –产生灭活酶或钝化酶 –主动外排系统将抗生素泵出胞外 –抗菌药物作用靶位改变 –膜孔蛋白突变 –生物膜屏障作用
• 绿脓杆菌是医院内感染的重要病原菌之一。
培养基成分：
• • • • •
胆盐乳糖培养基（BL）
胨 20. 0g 磷酸二氢钾 1.3g 乳糖 5. 0g 牛胆盐 2.0g 氯化钠 5.0g (或去氧胆酸钠） （0.5g) 磷酸氢二钾 4. 0g 水 1000ml 除乳糖、牛胆盐或去氧胆酸钠外，取上述成分，混合，微温溶 解，调节P H值使灭菌后为7 . 4 ± 0 . 2，煮沸，滤清，加入 乳糖、牛胆盐或去氧胆酸钠，分装，灭菌。
培养基成分：
PDP斜面，是否有色素，有， 用氯仿3-5ml萃取，用无菌 玻璃棒搅碎培养基、混匀， 色素完全在氯仿层。吸管 把氯仿层移到另一试管， 加入盐酸1M1ml，静置后， 盐酸出现粉红为阳性，无 粉红为阴性，阴性斜面培 养1-2天再重新做一遍。如 果仍是阴性。做下一步试 验。 绿脓菌素从有机相转到酸性 水相中会由蓝绿色变为粉 红色。
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___日___时至___日___时
计数
菌落计数公式: N=P+F(cF/nF)+R(cR/nR)
实验
结果
阴性:
阳性:
CFU/250mL
备注
P: 显兰/绿色的菌落数。
F: 显荧光的菌落数。
R: 显红褐色的菌落数。
nF: 进行产氨测试的荧光的菌落数。
cF: 产氨阳性的荧光的菌落数。
nR: 进行产氨. 氧化酶. 金氏B培养基上显荧光测试的红褐色菌落数。
Cr: 产氨. 氧化酶. 金氏B培养基上显荧光测试均呈阳性的红褐色菌落数。
检验项目
确
证
性
试
验
营养琼脂
要求
36±1℃；20h～24h。
培养
___日___时至___日___时
氧化酶试验
要求：用玻璃棒，将适量的纯种培养物涂布在试纸上。10S内显色
金氏B(King`s B) 培养基
要求
36±1℃；20h～24h。
培养
___日___时至___日___时
乙酰胺肉汤
要求
36±1℃；20h～24h。
铜绿假单胞菌检验原始-2008
样品制备：
釆用滤膜法。将250mL水样用孔径为的滤膜过滤，并将滤膜移至CN琼脂选择性培养基上，于36±1℃培养20-24h.
检验项目
现象
结果
分 离
培 养
假单胞菌琼脂基础培养基/CN琼脂
要求
36±1℃；20h～24h。
培养
___日___时至___日___时