第三章 分子克隆载体
第三章 分子克隆载体(Molecular cloning vectors)
第三章分子克隆载体（Molecular cloning vectors）［本章摘要］将外源DNA 或基因携带入宿主细胞（host cell）的工具称为载体，载体是基因操作的核心工具。
质粒载体是最常见的载体，也是使用最方便的载体。
它应用了质粒的复制、拷贝数及不相容性等性质。
质粒载体有抗性基因、琥珀突变抑制基因等多种选择标记和α-互补、插入失活等筛选标记。
常见的质粒载体有：pBR322、pUC18/19、pUC118/119、pGEM-3Z/4Z以及一些多功能的质粒载体，如：pBluescriptⅡKS（±）。
λ噬菌体载体应用了λ噬菌体的生物学性质。
λ噬菌体有溶源状态和裂解循环两种状态，有着复杂的分子生物学调控机制。
λ噬菌体载体有大小、lacZ基因、cI 基因失活以及Spi 筛选等选择标记，分为插入型载体和置换型载体。
常见的插入型载体有：λgt10、λgt11及其衍生载体和λExcell 载体等。
常见的置换型载体有：EMBL3/4 及其类似载体，λgem-11 载体。
粘粒是带有cos 序列的质粒。
粘粒载体的工作使用了质粒和λ噬菌体的双重生物学性质。
常见的粘粒载体有：pJB8、pcos1EMBL 以及卡隆9 载体系列。
构建粘粒文库时会遇到许多困难，注意用对应的方法解决。
M13 噬菌体是一种单链噬菌体，基于其构建的载体可以制备单链DNA 。
常见的M13 噬菌体载体有M13mp18/19 ，其受体细胞有特殊的遗传标志。
带有丝状噬菌体大间隔区的质粒叫噬菌粒，噬菌粒工作的时候需要M13K07 辅助噬菌体的帮助。
人工染色体是一种高通量的载体。
Y AC 是基于酵母染色体生物学性质构建的载体，BAC 是基于 F 质粒的生物学性质构建的载体，PAC 是基于P1 噬菌体构建的载体。
大肠杆菌表达载体是最常见的表达载体，可分为表达融合蛋白的载体和非融合蛋白表达载体。
常用的标签蛋白有谷胱甘肽转移酶、六聚组氨酸肽、蛋白质A 和纤维素结合位点等。
基因工程原理第3章基因克隆载体[可修改版ppt]
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ccc-DNA l-DNA oc-DNA
2. 质粒DNA分子大小
3. 质粒的复制
——严紧型质粒：1个寄主内仅含1-3拷贝 ——松弛型质粒：1个寄主内含10-60拷贝
• 质粒DNA复制：单向复制，受宿主细胞和质粒遗传系统 双重控制，不会无限制复制。
Ori
•质粒控制： 序列
拷贝数：细胞内某种质粒的数量与染色体的数量之比。
的成熟有关（占20%）
4.λ噬菌体DNA的包装限制问题
包装能力： λDNA×75%——λDNA ×105%， 即从36kb——51kb
• 野生型λDNA的必要区是28kb，所以能加入的外源DNA长度最大为 51kb-28kb=23kb。实际为15kb。
• 若λ基因组缺失大于25%时，也不能有效包装。
5.ion）：寄主细胞捕获噬菌体DNA 的过程。或 重组噬菌体DNA分子感染并进入大肠杆菌的过程。
• 转导作用（transduction）：以噬菌体颗粒为媒介转移遗传物质的 过程。
• 转化作用（transformation）：将质粒等外源DNA引入细胞的过 程。
2. 就克隆一个基因(DNA片段)来说，最简单的质粒载体也必需包括三个部分：（复制 区： 含有复制起点）；（选择标记： 主要是抗性基因）；（克隆位点： 便于外 源DNA的插入）。另外，一个理想的质粒载体必须具有低分子量。
3. 载体的功能是（ d ）
（a）外源基因进入受体的搭载工具
（b）不能为外源基因提供整合能力
cos位点：cohesive-end site 粘性末端位点
线性双链DNA分子两端各有1条由12个核苷酸组成的完全互补的5'单链突出序列，即粘性末端。 注入到寄主细胞内的线性DNA分子会迅速的通过粘性末端之间的互补作用，形成环状双链DNA分 子。然后在DNA连接酶的作用下，将相邻的5'—P和3'—OH基团封闭起来，进一步超盘旋化，这种 由粘性末端结合形成的双链DNA区域称为cos位点。
三四章分子克隆载体---答案_完_
三四章分⼦克隆载体---答案_完_第三章分⼦克隆载体（Molecular cloning vectors）⼀、名词解析1.质粒：质粒是染⾊体外的遗传因⼦，能进⾏⾃我复制（但依赖于宿主编码的酶和蛋⽩质）；⼤多数为超螺旋的双链共价闭合环状DNA分⼦（covalently closed circle , cccDNA），少数为线性；⼤⼩⼀般为1～200Kb，有的更⼤。
2.质粒拷贝数：质粒拷贝数(plasmid copy numbers)是指细胞中单⼀质粒的份数同染⾊体数之⽐值,常⽤质粒数/每染⾊体来表⽰。
不同的质粒在宿主细胞中的拷贝数不同。
3.质粒的不相容性：两个质粒在同⼀宿主中不能共存的现象称质粒的不相容性，它是指在第⼆个质粒导⼊后，在不涉及DNA 限制系统时出现的现象。
不相容的质粒⼀般都利⽤同⼀复制系统，从⽽导致不能共存于同⼀宿主中。
4.质粒的转移性：质粒具转移性。
它是指在⾃然条件下，很多质粒可以通过称为细菌接合的作⽤转移到新宿主内。
它需要移动基因 mob ，转移基因 tra ，顺式因⼦ bom 及其内部的转移缺⼝位点 nic。
5.穿梭质粒：既能在真核细胞中繁殖⼜能在原核细胞中繁殖的载体。
这类载体必须既有细菌的复制原点或质粒的复制原点，⼜含有真核⽣物的复制原点，还具备酶切位点和合适的筛选指标。
它⽤来转化细菌，⼜可以⽤于转化真核细胞。
6.α-互补：α-互补是指 lacZ 基因上缺失近操纵基因区段的突变体与带有完整的近操纵基因区段的β-半乳糖苷酶（β -galactosidase ，由 1024 个氨基酸组成）阴性的突变体之间实现互补。
α-互补是基于在两个不同的缺陷β-半乳糖苷酶之间可实现功能互补⽽建⽴的7.温和噬菌体：既能进⼊溶菌⽣命周期⼜能进⼊溶源⽣命周期的噬菌体。
8.溶源性细菌：具有⼀套完整的噬菌体基因组的细菌叫溶源性细菌。
9.整合：如果噬菌体的DNA是被包容在寄主细菌染⾊体DNA中，便叫做已整合的噬菌体DNA。
基因工程
质粒克隆载体
噬菌体载体 黏粒载体
分子克隆载体：通过不同途径能将承载的外源DNA片
段(基因)带入受体细胞，并在其中得以维持的DNA分子。
分子克隆载体必须具备的条件：
在克隆载体DNA分子合适的位置应有1至多个克隆位点 （MCS），供外源DNA片段组入克隆载体DNA分子 克隆载体能携带外源DNA片段（基因）进入受体细胞， 或停留在细胞质中能自我复制，或整合到DNA上随染色体 DNA的复制而同步复制 克隆载体必须具有用于选择克隆子的标记基因
α-互补
α -互补：现在使用的许多载体都带有一个E.coli DNA的短区 段，其中含有β-半乳糖苷酶的-α肽基因（lacZ’）的调控序 列和头146个氨基酸的编码信息。这个编码区中插入了一个 MCS，它并不破坏读框，但是可使少数几个氨基酸插入到β半乳糖苷酶的氨基端而不影响功能，这种载体适用于编码β半乳糖苷酶C端部分序列的宿主细胞，虽然宿主和质粒编码 的片段各自都没有酶活性，但它们可融为一体，形成具有酶 活性的蛋白，从而实现互补，这种现象称为~。
② 单方向插入
特定外源DNA区段更容易仅以单方向插入可改用噬菌粒 来增殖外源DNA
四、噬菌粒
噬菌粒（phagemid）：带有丝状噬菌体复制起点的质粒 组成：CloE1复制起点、抗性标记和单拷贝的丝状噬菌体 主要基因间隔区。该区包含DNA合成的起始，终止及噬 菌体颗粒形态发生所必须的全部顺式作用序列。
两菌株分别培养，分别收集和制备，包装前混合。 2） 重组λDNA分子的包装过程 包装制备物（-70℃）于冰上缓慢融化 加入重组 λDNA分子 边融化边混合边包装 离心除去 细胞碎片 λ颗 感染E. coli 培养 分离λ颗粒
4、λ噬菌体载体的选择标记
基因工程分子生物学第三章载体
第一节 载体的（replicon） The unit of DNA in which an individual act of replication occurs is called the replicon. Each replicon "fires" once and only once in each cell cycle. The replicon is defined by its possession of the control elements needed for replication. It has an origin at which replication is initiated. It may also have a terminus at which replication stops (Jacob, Brenner, and Cuzin, 1963). 某一复制行为发生所在的DNA单位称为复制子(replicon)。 每个复制子在每个细胞周期中只“引发”一次。复制子 是由它具有复制作用所必需的各种控制元件而定义的。它有一 个复制启动的起点(origin)，可能还有一个复制终止的终点 (terminus)。
起点具有什么特殊序列呢？ 如何为复制装置中的一
些特殊蛋白所识别呢？
二、大肠杆菌的复制起点的克隆 标记获救方法的原理 是从某一质粒取得带有抗药性基因 (例如APR) 可是 不能自主复制的限制酶切片段，用同一种酶处理大肠杆菌 的染色体DNA，经DNA连接酶处理后转化大肠杆菌，选择 抗氨苄青霉素的转化子，这些细菌中含有由复制起点片段 以及APR片段构成的质粒。pYT10便是这样一个质粒.
通过缺失分析已经证明，E.coli双向复制原点oriC
至少包括245bp( +23 ~ +267)，位于gidA基因和16KDa 基因之间，在E.coliK12株的遗传图上位于84分钟。
基因工程第三章分子克隆载体
二、载体的报告基因(标记基因)
基因工程中利用载体上特意引入的一些具有特殊标志意 义的基因，用来证明载体已经进入宿主细胞，并可将含有目 的基因的宿主细胞从其他细胞中识别区分甚至挑选出来。这 种具有标志意义的基因称为报告基因(report gene)，或标记 基因。
由于基因工程多用质粒作载体，质粒的报告基因在DNA 重组工作中具有重要意义，通过质粒的报告基因的表达可使 宿主细胞呈现一些可观察到的细胞生物学待征，通过质粒赋 予细胞的表型可识别和筛选重组体DNA的转化子细菌。
连接
切酶切割之后，发生双链断裂而形
成线性DNA(IDNA)，通称L构型(a) 。
质粒与宿主细胞的关系
（1）质粒对宿主的生存不是必需的，只是“友好”的“借 居”
宿主细胞中，既不杀伤细胞，对宿主的代谢活动也无影响， 宿主离开质粒照样的生存下去。 （2）质粒离开宿主就无法生存，只有依赖宿主细胞的（酶 和蛋白质）帮助，才能完成自身的复制（扩增）、转录。 （3）质粒经常为宿主执行一些适当的遗传功能，作为对宿 主细胞的补偿（“交房租”）。 （4）质粒赋于宿主各种有利的表型（质粒编码蛋白质或 酶），使宿主获得生存优势，与我们基因工程实验紧密相关 的，如抗生素抗性基因。
①α-互补
是指 lacZ 基因上缺失近操纵基因区段的突变体与带有完整 的近操纵基因区段的 β-半乳糖苷酶基因的突变体之间实现互 补。α-互补是基于在两个不同的缺陷 β-半乳糖苷酶之间可实
现功能互补而建立的。
质粒
载体
N
②插入失活 通过插入失活进行筛选的质粒主要有 pBR322 ，该质粒具
有四环素抗性基因（tetr）和氨苄青霉素抗性基因（ampr）两 种抗性标记。当外源 DNA 片段插入 tetr 基因后，导致 tetr 基 因失活，变成只对氨苄青霉素有抗性。这样就可通过对抗生素 是双抗还是单抗来筛选是否有外源片段插入到载体中。
3分子克隆载体
顺式作用元件指的是在同一条核苷酸链上起调控基因作用的核酸序 列，常不编码蛋白质合成。 反式作用因子则指的是对不同核酸链上的基因表达起到调控作用的 蛋白，编码该蛋白的基因与其识别结合作用的核酸链不是同一链。 顺式作用元件在分子遗传学领域，相对同一染色体或DNA分子而言 为“顺式”（cis）；对不同染色体或DNA分子而言为“反式” （trans）。
（3）连接产物的电转化 ①大肠杆菌DH10B感受态细胞的制备：( 见分子克隆指南第 三版 )
②电转化:取100mL菌悬液于一个0.2cm的电击杯(Bio-Rad产 品)中，加入一定浓度的供体质粒DNA（一般3～5mL），混匀 后在冰浴上放置10－20min，用Genepulser TM型电脉冲仪(BioRad产品) 进行电脉冲。电脉冲参数选定为：脉冲场强V =9.0 kV/cm，电容C =25 m F，阻抗 R =200Ω，脉冲时间G =4.0～ 4.8ms。电脉冲完毕后，加入0.8mLSOC培养液于电转化杯中， 并在37℃以150r/min恢复培养2h后，涂布氯霉素抗性平板，置 37℃d Ⅲ与Not Ⅰ酶切
（3）电洗脱（透析） 首先将脉冲电泳后50kb左右的条带切胶，把此条胶装入煮过 的灌满1×TAE（50×TAE母液：2mol/L Tr is×HCl，pH8.0 ， 1mol/L乙酸，100 mM/LEDTA）缓冲液的透析袋中，将缓冲液 尽量倒净，进行透析电泳，电泳参数为120v电压，电泳2－2.5h 后反向电泳30－40s。将透析袋轻轻揉搓下，吸出透析后的50kb 左右的外源 DNA 。
(1)氨苄青霉素抗性基因（Ampicillin, ampr） 使用最广泛的选择标记，绝大多数在大肠杆菌 中克隆的质粒载体带有该基因。 青霉素可抑制细胞壁肽聚糖的合成，与有关的 酶结合并抑制其活性，抑制转肽反应。 氨苄青霉素抗性基因编码一个酶，该酶可分泌 进入细菌的周质区，催化 β-内酰胺环水解，从 而解除了氨苄青霉素的毒性。
克隆载体与表达载体介绍
（二）质粒载体的构建
天然质粒载体不易直接作为克隆载体，需要改造：
（1）选择合适的复制起始位点，松散型质粒复制起始位点； （2）加入合适的选择标记基因，主要有LacZ基因和抗生素抗性基因； （3）增加或减少酶切位点，组装多个单一的限制酶切位点即多克隆位点
（MCS); （4）缩短长度，通常重组DNA分子越小，转化效率越高。
（三）常用的质粒载体
1. pBR322质粒载体
2. pUC18和pUC19质粒载体
3. TA载体
二、噬菌体载体
（一） λ 噬菌体载体 1 λ 噬菌体的性质
λ噬菌体Βιβλιοθήκη 外壳蛋白 线性，全长48502bp
λDNA 5’端含12bp的黏性末端
2 λ 噬菌体的构建 构建λ 噬菌体的依据：
a.λ 噬菌体能够包装原λDNA长度的75%－105%的DNA片段 （36.4~51kb） b.有20kb的区域对λ噬菌体生长非必需。
该λ 噬菌体载体的最大装载容量为: 4.9+5.5+2.6+(51-48.5)=15.5kb
2.6kb
3 代表性λ 噬菌体
(1) 插入型载体
装载容量为：0-10.18kb
(2) 置换型噬菌体载体载体 克隆外源DNA片段范围为：9-23kb
（二） M13 噬菌体载体
1.M13噬菌体的增值
M13噬菌体是单链丝状噬菌体； 长6407bp， 507bp基因间隔区，含复制起始位点，同时可用于改造； M13 DNA在宿主细胞中以双链或单链形式存在，但释放到细胞外的 M13 噬菌体颗粒以单链形式存在。
2.M13噬菌体载体 1) 插入选择标记基因； 2) 组装合适的多克隆位点。
三、噬菌体-质粒杂合载体
分子克隆载体
第三章 分子克隆载体第一节 分子克隆载体如果只有基因而没有负责运载它的载体，则基因就不可能发挥作用。
基因工程载体决定了外源基因的复制、扩增和表达。
载体的本质DNA。
载体（vector）就是指携带外源DNA片段进入宿主细胞进行扩增或表达的工具。
目前常用有载体有很多种，它们分别由从细菌质粒、噬菌体DNA、病毒DNA分离出的元件组装而成。
它们可分为克隆载体和表达载体，表达载体又分胞内表达和分泌表达载体。
从表达所用的受体细胞，又可分为原核细胞和真核细胞载体。
从功能上又可分为测序载体、克隆-转录载体和基因调控报告载体等多功能载体。
1.1 克隆载体1.1.1 克隆载体具备的条件①载体都能携带外源DNA片段(基因)进入受体细胞，或停留在细胞质中自我复制，或整合到染色体DNA上，随着染色体DNA的复制而同步复制。
②载体都具有合适的筛选遗传标记。
③载体都具有供外源基因插入的限制性核酸内切酶位点，即多克隆位点。
④载体都必须是安全的，不应含有对受体细胞有害的基因，并且不会任意转入除受体细胞以外的其他生物细胞，尤其是人的细胞。
⑤载体本身的分子量都比较小，可容纳较大的外源基因片段。
⑥载体在细胞内的拷贝数要高，方便外源基因在细胞内大量扩增。
⑦载体在细胞内稳定性要高，保证重组体稳定传代而不易丢失。
⑧载体的特征都是充分掌握的，包括它的全部核苷酸序列。
克隆载体在基因工程中占有十分重要的地位，目的基因能否有效转入受体细胞，并在其中维持和高效表达，在很大程度上取决于克隆载体。
基因工程是随着克隆载体系统的建立才发展起来的。
原核生物基因工程之所以起步早，发展快，成果大，就是因为最早建立了适用于原核生物的克隆载体系统，并且至今已建立了种类繁多的用于原核生物的大量克隆载体。
近十年来，植物基因工程所发展，同样是因为成功地构建了适用于植物的一系列的克隆载体。
因此，国内外把构建新的克隆载体始终作为基因工程基础研究的优先项目，构建的克隆载体可以申请专利保护。
第三章 基因克隆载体 基因工程课件
3.1.3.1 不同类型的质粒载体
• 高拷贝的质粒载体
克隆的目的是为分离大量的高纯度的克隆基因
• 低拷贝的质粒载体
有些克隆的编码基因，其产物含量过高会严重的干扰 寄主细胞的正常新陈代谢活动。编码表面结构蛋白 质的一些基因、调节细胞基础代谢活动的蛋白质编 码基因以及囊纤维化跨膜传导调节蛋白质编码基因 等。
3.1 质粒克隆载体
是以质粒DNA分子为基础构建而成的克隆载体，主要用于建克隆载体相关的质粒性质：
3.1.1.1 质粒的构型 3.1.1.2 质粒DNA分子大小 3.1.1.3 质粒DNA分子的复制 3.1.1.4 质粒DNA的不亲和性 3.1.1.5 质粒迁移 3.1.1.6 显性质粒和隐蔽质粒
•
正选择的质粒载体
正向选择： 应用只有突变体或重组体才能正常生长的培养 条件进行选择。这种质粒载体具有直接选 择记号 并可 赋予寄主细胞相应的表型。
Example：
质粒pKN80有来自Mu噬菌 体DNA的EcoRI-C的片 断，编码一种致死功能 的kil基因。 该质粒在Mu噬菌体的溶源 菌株中正常复制；在非 溶源菌株中是致死的。 在Hind III 或Hpa I位点插入 外源DNA片断后，会产 生具Ampr表型的Mu噬菌 体的非溶源的转化子菌 株。
第一个用于基因克隆的天然质粒pSC101，它含 有一个EcoR V酶切位点，一个四环素抗性 选择记号（Tetr ），插入外源片断后不影 响其复制功能，但该质粒分子量较大，拷 贝数低，只具有一种抗菌素抗性基因，无 法使用插入失活技术选择重组分子。
（4363bp）
以Ampr和 Tetr为选择 性标记， 克隆位点 在这两个 选择性标 记的单酶 切位点上。 选择 AmprTets 或 AmpsTetr 的重组子。
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E.coli
环状
35- 45kb
≈300 kb
E.coli
E.coli 酵母细胞 哺乳类细胞 动物细胞 动物细胞 和细菌
环状
环状 线性染色体
Pel oBAC系列
PCYPAC1
100 - 2000 kb 100 - 2000 kb 〉 1000 kb
线性染色体 环状 环状
SV40 载体，昆虫 杆状病毒载体 pSVK3质粒，PBV, Ti质粒
pUC 系列载体的拷贝数较高 ，主要是由于
RNAI的起点上游1个核苷酸G变成了A，从而 使得其转录起点改在下游 3 个核苷酸处，由 于 RNAI 5‟ 单链的完整对于 RNA/RNAII 间的 相互作用至关重要。 因此 pUC质粒拷贝数的增加可能是由于缩短 的RNAI与RNAII的结合效率降低所致。
质粒可表达一种使某些宿主菌致死的基 因产物，而含有外源基因片段插入后， 该基因便失活。
2. 筛选标记
(1) -互补----- complementation LacZ‟基因的互补
-galactosidase 1024aa
LacZ
LacZ△M15 编码缺失第11-41位氨基酸 140个aa 140个aa + MCS LacZ‟
λ噬菌体 丝状噬菌体及噬菌粒
粘粒载体
BAC (Bacterial Artificial Chromosome) PAC (P1-derived Artificial chromosome) YAC (Yeast Artificial chromosome ) MAC (Mammalian Artificial Chromosome) 病毒载体 穿梭载体
(2) 四环素抗性基因 tetr
tetracycline
四环素与核糖体（ribosome）30S亚基的一 种蛋白质结合，从而抑制核糖体的转位。 tetr编码一个由399个氨基酸组成的膜结合 蛋白，可阻止四环素进入细胞。
(3) 氯霉素抗性基因 Cmr，Cat ，chloramphenicol
• 氯霉素与核糖体50S亚基结合并抑制蛋白质合成 • 常用的Cmr来源于转导性P1噬菌体(也携带 Tn9) • cat基因编码一个四聚体细胞质蛋白 (每个亚基23kDa)， 氯霉素乙酰转移酶，在乙酰辅酶A存在的条件下，催 化氯霉素羟乙酰氧基衍生物的形成，该产物不能与 核糖体结合。
相应的受体菌 TG1, XL1-Blue, JM101等 (lac-proAB)F‟[proAB+ lacIq lacZ M15] lacI: lacZ阻抑物的编码基因（lacIq突变 使阻抑物产量增加）
(2) 插入失活(insertional inactivation)
如对：双抗性基因的某一抗性基因插入失活。
由大量的含有基因DNA（即某一生物的全部 DNA顺序）的不同D《分子生物学》，阎龙飞、张玉麟主编， 北京农业大 学出版社，1993
将外源DNA或基因携带入宿主细胞 （host cell）的工具称为载体(vector)
载体应具备以下特点： 1．在宿主细胞内必须能够自主复制（ selfreplication，具备复制原点） 2．必须具备合适的酶切位点，供外源DNA 片段插入，同时不影响其复制 3．有一定的选择标记，用于筛选
pBR322的 结构来源
Ap
Ap+Tc
Ap
② pUC18/19
2686bp 18: L08752 19:X02514
来自pBR322 其中LacZ‟(MCS)来自M13mp18/19 MCS (10个位点)，-互补 • cloning: • expression: 利用lacZ promoter • sequencing: Universal and Reserve primer 引物位置/引物序列
该酶的表达对分解代谢的产物敏感，若细菌利用除葡萄糖(glucose) 以外的碳源生长时，其表达量可增加到原来的5-10倍，在cAMP/ 分 解代谢的产物基因激活蛋白存在下，依赖于DNA的RNA聚合酶在体 外与cat基因启动子结合的能力明显增强。
(4) 卡那霉素和新霉素抗性基因
kanr、neor kanamycin/neomycin
不相容群(incompatible group)：指那些具有不相容
性的质粒组成的一个群体 ，一般具有相同的复制子 ，如 ColE1/pMB1，现已发现30多个不相容群，如ColE1/pMB1、 pSC101和 p15A。
5. 转移性(transferring)
在自然条件下，很多质粒可以通过称为细菌接合 (Conjugation)的作用转移到新宿主内。 要素：移动基因mob、转移基因tra和转移起始位点。
4.质粒的不相容性(plasmids incompatibility)
概念：两个质粒在同一宿主中不能共存的现象称质 粒的不相容性(incompatibility)。
在第二个质粒导入后，在不涉及 DNA 限制系统时，不相容 的质粒一般为利用同一复制系统，在质粒分配到子细胞时会 发生竞争，随机挑选，微小的差异最终被放大。
IPTG/x-gal IPTG/x-gal
blue
white
-互补(α-complementation) lacZ基因上缺失近操纵基因区段的突变体 (mutant)与带有完整的近操纵基因区段的-
半乳糖苷酶阴性的突变体之间实现互补
LacZ△M15
LacZ’
放在F质粒上，随宿主传代
放Hale Waihona Puke 载体上，作为筛选标记其它：有一定的拷贝数，便于制备
载体
功能 克隆载体: 克隆一个基因或DNA片断 表达载体: 用于一个基因的蛋白表达 整合载体: 把一个基因插入到染色体组中
载体
来源：
质粒载体 plasmid
噬菌体载体
phage
粘粒载体 cosmid 噬菌粒
phagemid
载体的种类和特征
受体细胞 质粒* E.coli E.coli E.coli 结构 环状 线状 环状 插入片断 〈 8* 9 - 24kb 〈 10 kb 举例 pUC18/19 , T-载体 pGEM- 3z等 EMBL系列， Λ gt系列 M13mp系列 pJB8,c2RB, pcoslEMBL, pWE15/16, pCV
终止密码子(stop codons)：
UAA(赭石), UAG(琥珀), UGA(乳白) supF编码细菌的抑制性tRNA。 在某一宿主中含具琥珀突变的tetr 和ampr，只有当含 supF的质粒转入后，宿主才会对Amp和Tet具抗性，
supF在UAG上加入酪氨酸，supE加入谷氨酰氨
(6) 其它 正向选择标记
定义
质粒是染色体以外能自主复制的遗传因子；
不具有胞外期；对寄主细胞来说是非必需
的。
符合这三条标准的染色体外 DNA 或 RNA 分 子都可以称为质粒。
真核生物的DNA质粒
• 环状DNA质粒：酵母2 mm质粒，植物线立
体中的环状 DNA 质粒，人和动物的核 DNA 质
粒等，它们都是不知其功能的隐蔽质粒。
IPTG：异丙基--D-硫代半乳糖苷 诱导物 X- gal：5-溴-4氯-3吲哚--D-半乳糖苷 底物 (生色剂)
-半乳糖苷酶分解x-gal 形成蓝色产物
MCS : Multiple cloning sites
LacZ△M15
LacZ’
LacZ△M15 LacZ’
LacZ△M15 LacZ’ DNA
卡那霉素和新霉素是一种可与核糖体成分相结合 并抑制蛋白质合成的脱氧链霉胺氮基糖苷。 氨基糖苷磷酸转移酶（25 kDa）似乎位于外周质 腔，可使这两种抗生素磷酸化(phosphorylation)， 从而干扰它们向细胞内的主动转移。
(5) 琥珀突变抑制基因 (amber mutation repress gene) sup F
② pBR322以后，调整载体的结构，提高载 体的工作效率 pBR322 pUC质粒 去掉多余片段，提供多克隆位点，筛选标记 ③ 增加辅助功能/表达载体(expression vector)， 穿梭载体(shuttle vector)
1．克隆载体(cloning vector)
用于扩增或保存DNA片段，最简单的载体 ① pBR322 4361 bp，许多质粒载体由此发展而来， GenBank V01119, J01749 含有30多个单一位点，且ampr和tetr 可通过插入失活进行筛选
狭义的质粒一般是指细菌染色体外 的环状DNA分子。
质粒的命名：一个 小写字母 p 加 2-3 个大写字母和数字， 如 pJP4，pDTG1， pBMB等。
2．质粒的构型
L
OC
SC
3．质粒的复制
① 复制起始区(replication origin)： 通常一个质粒含
有一个与相应的顺式(cis)作用控制要素结合在一
第三章 分子克隆载体
Molecular cloning vectors
利用重组DNA技术分离目的基因，称 之为基因克隆(gene clone)
克隆(clone):
动词：指从单一祖先产生同一的DNA分子 群体或细胞群体的过程 名词：指从一个共同祖先无性繁殖下来的一 群遗传上同一的DNA分子、细胞或 个体所组成的特殊的生命群体
起的复制起始区
复制子(replicon)有不同的组成方式（滚环、和D环复制） 在E. coli中，使用的大多数载体都带有一个来源于 pMB1质粒或ColE1质粒的复制起始位点(replication origin)，其复制方式如下：
RNase H -550 RNAII 400 600
RNAI
ori
Rop
合成RNAII即前引物，形成杂交体 RNaseH 切割RNAII 使之成熟，形成三叶草结构 (cloverleaf structure) RNAI 可控制RNAII形成二级结构 Rop增强RNAI的作用