肠杆菌科检验(食品微生物学检验)
食品安全国家标准食品微生物学检验肠杆菌科检验编制说明
食品安全国家标准《食品微生物学检验肠杆菌科检验》（征求意见稿）编制说明一、标准起草的基本情况:（一）任务来源受国家卫生与计划生育委员会食品安全标准与监测评估司（原卫生部食品安全综合协调与卫生监督局）委托，根据《食品安全国家标准管理办法》、《食品安全国家标准制（修）订项目管理规定》，按照食品安全国家标准审评委员会的工作安排，对本标准进行制定。
（二）简要起草过程2011年7月，卫生部食品安全综合协调与卫生监督局下达《食品安全国家标准食品微生物学检验肠杆菌科检验》标准制定任务，项目编号为spaq-2011-61。
随即成立标准制定专家组，确立标准制定的基本原则，比较与研究我国及国际标准相关内容，并结合方法的研究工作，形成《食品安全国家标准食品微生物学检验肠杆菌科检验》标准的征求意见稿。
（三）起草单位、协作单位、主要起草人参与本标准的起草单位有辽宁出入境检验检疫局、中国检验检疫科学研究院、山东出入境检验检疫局、浙江出入境检验检疫局及河南出入境检验检疫局。
（四）主要起草人本标准主要起草人为：刘淑艳、卢行安、蒋丹、赵守成、王刚、姜英辉、程洁、苗丽、吕佳、柳媛、宋慧君、马惠蕊。
起草人员负责标准制定工作的组织、协调，相关资料的查阅、收集，标准文本及编制说明的起草、撰写，通过电子邮件、传真等方式，征集、整理和归纳相关的意见和建议。
二、标准的重要内容及主要修改情况本标准研究对比了国际标准ISO 21528-1：2004 食品和动物饲料微生物学肠杆菌科检测和计数方法第1部分：带前增菌的MPN法和ISO 21528-2：2004食品和动物饲料微生物学肠杆菌科检测和计数方法第2部分：菌落计数法；并依据伯杰细菌鉴定手册第八版，肠杆菌科的分类，选择肠杆菌科12个属及其它对照菌株，共25株进行了本标准方法的检验，确定了肠杆菌科检验的MPN法及菌落计数法。
本标准与ISO 21528：2004相比主要修改如下：——培养温度37℃±1℃修改为36℃±1℃；——增加了革兰氏染色确证试验；——修改了葡萄糖琼脂发酵试验阳性结果描述；——增加了平板计数法的计算公式。
肠杆菌科的检验 微生物实验
实验三：肠杆菌科的检验一、接种细菌：MAC培养基接种大肠埃希菌和变形杆菌，SS培养基接种福氏志贺菌和乙型副伤寒沙门菌，采用分区划线法，放在35℃温箱中培养18—24h。
二、观察肠道杆菌在MAC和SS平板上的菌落形态。
1、SS平板：1）福氏志贺菌形成无色、半透明、光滑、湿润、突起、直径为1—2mm大小的菌落；2）乙型副伤寒沙门菌为中心带黑褐色，其余部分为半透明、光滑、湿润、突起的小菌落2、MAC平板：1）大肠埃希菌形成红色、圆形、凸起、边缘整齐、多数为光滑型的菌落。
中等大小。
2）变形杆菌为圆形、扁平、无色、半透明的菌落。
三、涂片、革兰染色将玻片分为四个区域，并分别标记，将四种肠道杆菌分别在四个区域内的生理盐水中研磨，待其自然干燥后固定，采用“改良快速法”进行染色，结果如图所示：福氏志贺菌乙型副伤寒沙门菌变形杆菌大肠埃希菌G-杆菌G-直杆菌，较细长G- 杆菌G-直短杆状显微镜检查特征为革兰阴性杆菌，肠杆菌科多数细菌的形态及染色性相似，根据形态及染色性难以相互鉴别。
四、生化试验：1、氧化酶试验（纸片法）：在滤纸条上滴一滴氧化酶试剂，用无菌接种环挑取待测菌落在滤纸条上滴了试剂的部位研磨，；滤纸变为红色则为阳性，不变色为阴性，结果表明，以上四种肠道杆菌的氧化酶试验均为阴性。
2、接种KIA、MIU上。
五、2、微量生化：六、沙门菌、志贺菌的血清学鉴定：1、在洁净载玻片上两端分别滴加一滴志贺菌四种多价血清和福氏四价血清，各取一环志贺菌在两种血清上研磨10S，观察两组结果均出现肉眼可见的凝集物，提示该菌为福氏志贺菌。
2、采用同上方法，在洁净玻片上分别在其两端滴加一滴沙门菌多价O（A—F）和Hd血清，各取一环待测菌与之混合，研磨10S，几分钟后观察两组结果，出现肉眼可见的颗粒状凝聚物表示该菌为乙型副伤寒沙门菌。
七、讨论：1、做生化试验时，有些细菌为致病菌，故实验时要保护好自己，且实验废弃物要妥善处理，以免发生有害菌的感染。
食品微生物检验方法(ISOFDA)
所有平板的菌落数都超过250CFU，但不足100/cm2 ，报告EAPC/ml （g）为最接近250CFU的平板菌落数的估计值，乘以相应的稀释度 。
所有平板的菌落数都超过100/cm2 ，计算平板的面积（直径为90mm 的平板面积为65cm2），估计最高稀释度每cm2的菌落数，乘以相应 平板面积作为该稀释度的菌落计数结果，报告EAPC/ml（g）为＞ 65*100* 1/d。
大肠杆菌在外界存活时间与一些主要肠道致病菌接近，它的出现预 示着某些肠道病原菌的存在，因此该菌是国际上公认的卫生监测指 示菌。近年来，有些国家在执行HACCP管理中，将大肠杆菌检测 作为微生物污染状况的监测指标和HACCP实施效果的评估指标。
鉴于食品检样中的细菌细胞是以单个、成双、链状、 葡萄状或成堆的形式存在，因而在平板上出现的菌落 可以来源于细胞块，也可以来源于单个细胞，因而平 板上所得菌落的数字不应报告活菌数，而应以单位重 量、容积或表面积内的菌落数或菌落形成单位（colony forming units，CFU）报告。
•9
菌落总数测定几点要求
检样稀释液有时带有食品颗粒，为避免与细菌菌落发生混淆，可 作一检样稀释液与平板计数琼脂混合的平皿，不经培养，于4 ℃ 放置，以便在计数检样时用作对照。
•10
大肠菌群的定义
大肠菌群系指一群能发酵乳糖、产酸产气、需氧和兼 性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。
大肠菌群不是细菌学上的分类命名，而是根据卫生学 方面的要求，提出的与粪便污染有关的细菌，即作为 食品、水体等是否受过人畜粪便污染的指示菌，这些 细菌在生化及血清学方面并非完全一致。根据进一步 的生化试验，可将这群细菌再分为大肠艾希氏菌（俗 称大肠杆菌）、弗氏柠檬酸杆菌、肺炎克雷伯氏菌和 阴沟肠杆菌等。
临床医学检验考试辅导《微生物检验》肠杆菌科及检验讲义
肠杆菌科及检验● 考点概述概念；命名与分类原则；共同特点；自然与人体内的分布；微生物学检查方法；临床意义。
埃希菌属、沙门菌属、志贺菌属、变形杆菌属、耶尔森菌属及其他肠杆菌科细菌。
生物学性状；微生物学检验；临床意义。
【内容讲解】一、概述（共性）肠杆菌科是由多个菌属组成，G-杆菌，生物学性状相似。
大多数肠道杆菌属于正常菌群。
当机体免疫力降低或侵入肠道外组织时成为条件致病菌而引起疾病。
部分为致病性细菌。
（一）分类肠杆菌科细菌的种类繁多。
主要根据细菌的形态、生化反应、抗原性质以及核酸相关性进行分类。
根据《伯杰系统细菌学手册》（1984年）将肠杆菌科的细菌分为20个属即埃希菌属、志贺菌属、沙门菌属、枸橼酸杆菌属、克雷伯菌属、肠杆菌属、沙雷菌属、哈夫尼亚菌属、爱德华菌属、普罗威登斯菌属、变形杆菌属、摩根菌属、耶尔森菌属等。
（二）生物学特性1.形态与染色G-，杆菌，大小为（1.0～6.0）μm×（0.3～1.0）μm。
多数有周鞭毛（除志贺菌属、克雷伯菌属、鼠疫耶尔森菌和EIEC），无芽胞，少数菌属细菌可形成荚膜。
2.培养需氧或兼性厌氧；营养要求不高；普皿和麦康凯培养基：中等大小、表面光滑的菌落；液体培养基：混浊生长。
3.生化反应发酵葡萄糖产酸、或产酸产气；乳糖发酵试验：非致病菌 +，致病菌 -（除外变形杆菌）。
触酶阳性；氧化酶阴性；硝酸盐还原为亚硝酸盐。
4.抗原构造表面抗原（如Vi抗原、K抗原）：包绕在O抗原外的不耐热的多糖抗原，可阻断O抗原与相应抗体之间的反应，加热处理能破坏其阻断作用。
5.变异菌落S～R变异鞭毛H～O变异耐药性变异生化反应性质的改变6.抵抗力不强。
加热60℃，30分钟即被杀死。
不耐干燥，对一般化学消毒剂敏感。
对低温有耐受力，能耐胆盐。
7.肠杆菌科的初步分类（三）致病性1.致病性肠道杆菌：以肠内感染为主，腹泻为共显症状，引起急慢性肠道感染、食物中毒、旅游者腹泻及肠热症等。
2.条件致病菌：为医院感染主要病原菌，出现移位感染。
食品中肠杆菌科的检[1]..
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• 培养
•
接种后的肠杆菌科测试片胶膜面向上置于 36°C ±1°C的培养箱内，培养24h±2h。 36° 的培养箱内，培养24h±2h。 测试片最多可堆叠至20片 测试片最多可堆叠至20片。注意保持培养箱 内湿度，防止纸片失水干燥。 内湿度，防止纸片失水干燥。
判读与计数
• 培养24h ±2h后应立即计数，可目测、用标准 培养24h 2h后应立即计数 可目测、 后应立即计数， • •
PetrifilmTM 肠杆菌科测试片
判读 • 计数所有红色带黄色 区域， 区域，或带气泡的菌 落，或带两者的菌落
• 计数范围15-100 计数范围15• 方格设计便于计数
结果的报告
• （1）选取菌落数在15～100之间的测试片作为计 选取菌落数在15～100之间的测试片作为计 • •
数标准。选择菌落数在15～100之间的稀释度，平 之间的稀释度， 数标准。选择菌落数在15～100之间的稀释度 均菌落数乘以稀释倍数报告之。 均菌落数乘以稀释倍数报告之。 如果所有稀释度测试片上的菌落数都小于15， （2）如果所有稀释度测试片上的菌落数都小于15， 则计数稀释度最低的测试片上的平均菌落数乘以稀 释倍数报告之。 释倍数报告之。 如果所有稀释度的测试片上均无菌落生长， （3）如果所有稀释度的测试片上均无菌落生长， 则以（ 乘以最低稀释倍数报告之。 则以（<）1乘以最低稀释倍数报告之。
肠杆菌科实验报告
一、实验目的1. 掌握肠道条件致病菌与肠道致病菌的菌落特点。
2. 掌握肠道杆菌的主要生化反应。
3. 掌握肠道杆菌的分离鉴定方法。
4. 掌握粪便标本细菌学检测流程。
二、实验原理肠道杆菌科细菌为革兰氏阴性菌，大多数有鞭毛，能运动。
少数无鞭毛不能运动，不产生芽孢，需氧或兼性厌氧，在普通培养基上，一般都生长良好，均能发酵葡萄糖产酸或产气，触酶试验阳性，氧化酶试验阴性，还原硝酸盐。
这类细菌是人类和动物肠道中的细菌，有的引起腹泻、肠炎、肠热症和痢疾等。
有的为条件致病菌，有时也可引起身体各个部位的感染。
三、实验材料与仪器材料：1. 粪便标本2. CB培养基3. SS培养基4. 基础培养基5. 双糖铁发酵培养管6. 鉴别培养基7. 血清学反应试剂8. 药敏试剂仪器：1. 高压灭菌锅2. 试管3. 锥形瓶4. 接种环5. 酒精灯6. 无菌玻片7. 显微镜、载玻片8. 镊子四、实验步骤1. 粪便标本的处理- 将粪便标本用无菌生理盐水进行稀释，制成10^-1、10^-2、10^-3、10^-4四个浓度的悬液。
- 取各浓度悬液适量，分别接种于CB培养基、SS培养基、基础培养基和双糖铁发酵培养管。
2. 培养与观察- 将接种后的培养基放入37℃恒温培养箱中培养24小时。
- 观察并记录各培养基上的菌落特征，包括菌落大小、形状、颜色、边缘、表面等。
3. 生化反应- 取纯培养的菌落，进行糖发酵试验、氧化酶试验、触酶试验、硝酸盐还原试验等。
- 根据试验结果，初步鉴定菌种。
4. 血清学反应- 取纯培养的菌落，进行血清学反应，进一步鉴定菌种。
5. 药敏试验- 取纯培养的菌落，进行药敏试验，了解菌株的耐药性。
五、实验结果与分析1. 菌落特征- 在CB培养基上，观察到典型的肠道杆菌菌落，菌落呈圆形、光滑、湿润、乳白色。
- 在SS培养基上，观察到菌落呈红色，并有金属光泽。
- 在基础培养基上，观察到菌落呈黄色。
- 在双糖铁发酵培养管中，观察到斜面和底层均呈红色，并产生气泡。
GBT_4789[1].40-2010_食品卫生微生物学检验_阪崎肠杆菌检验标准培训资料
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USFDA 方法 （一） （一）USFDA
30
• •
优点：所使用的各种培养基常见、价格便宜，更易普及。 缺点：选择性差
：竞争性抑制作用 1. EE broth broth：竞争性抑制作用 2. VRBGA ：（ 1）其它细菌也能生长，产生粉紫色菌落，胆 VRBGA：（ ：（1 2）ES 无特征性菌落，不易 汁酸沉淀形成紫色晕圈；（ 汁酸沉淀形成紫色晕圈；（2 ES无特征性菌落，不易 ES 和其他微生物 区别 区别ES ES和其他微生物 3. TSA:多种产生黄色素沉着的肠杆菌科菌株均能生长，如： pantoea spp .，E. hermanii，E. vulneris。 spp.
13
五、增殖能力
℃，37 ℃分别是 13.7h ，1.7h ，19 －21min 。 • 6℃，21 21℃ 37℃ 分别是13.7h 13.7h， 1.7h， 19－ 21min。 发现，与本底相比， 25 ℃放置 6h 该菌的相对危险 • MRA MRA发现，与本底相比， 发现，与本底相比，25 25℃ 放置6h 6h该菌的相对危险 30 倍； 25 ℃放置 10h 可增加 30 000 倍。 性可增加 性可增加30 30倍； 倍；25 25℃ 放置10h 10h可增加 可增加30 000倍。 年2月FAO/WHO 在日内瓦召开的婴儿配方粉中 ES • 2004 2004年 FAO/WHO在日内瓦召开的婴儿配方粉中 在日内瓦召开的婴儿配方粉中ES ES （＜ 3 专家研讨会上提出婴儿配方粉中微量的 专家研讨会上提出婴儿配方粉中微量的ES ES（＜ （＜3 CFU/100g ）污染也能导致感染的发生。 CFU/100g）污染也能导致感染的发生。
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五五��世世界界范范围围内内 感感染染情情况况
肠道杆菌检验(实验)
第三次
1. 观察生化试验结果 （1）KIA、MIU （2）微量生化，查编码手册 2. 沙门菌及志贺生化编码鉴定试验结果观察
组别 生化项目 代号 观察方法
1
葡萄糖
赖氨酸 鸟氨酸 硫化氢 靛基质 乳糖 卫矛醇 苯丙氨酸 尿素 枸橼酸盐
产酸
产气
A
G 4 2 1 4 2 1 4 2 1
直接观察：培养基变黄为A
直接观察：有气泡为G 直接观察：对照组为黄色，试 验组不变色＋ 直接观察：培养基变黑＋ 滴加柯氏试剂，交界面变红＋ 直接观察：培养基变黄＋ 直接观察：培养基变黄＋ 滴加10％FeCl3 ，变绿＋ 直接观察：培养基变红＋ 直接观察：培养基变蓝＋
2
3
4
第一次实验：
1.练习分区划线接种 2.分离培养 （每4人一组,每人接种一个平板，一个细菌） MAC：1大肠埃希菌、4变形杆菌 SS： 2乙型副伤寒沙门菌、3福氏志贺菌
第二次实验：
1. 观察菌落形态 2. 革兰染色 3. 生化试验： （1）氧化酶试验（滤纸法） （2）接种KIA、MIU（1套／人） （3）接种微量生化管（1套/2人）
沙门菌及志贺菌的血清学鉴定玻片法组别生化项目代号观察方法1葡萄糖产酸产气ag直接观察
肠杆菌科细菌检验
王 跃
临床微生物学教研室
实验目的
1．掌握肠杆菌科细菌的形态、染色特性、培养 特性、生化反应及鉴定依据。 2. 掌握肠杆菌科细菌鉴定的重要生化试验。 3. 熟悉肠杆菌科细菌血清学鉴定的操作方法。 4. 了解肠道杆菌选择鉴别培养基的制作程序。
器材和试剂
1．菌种：大肠埃希菌、变形杆菌、乙型副伤寒 沙门菌、福氏志贺菌。
2．培养基：MAC、SS、KIA、MIU商品培养基、 无菌尿素液、 3．试剂： 氧化酶试剂、肠杆菌科微量生化鉴 定试剂盒、革兰染色液 4. 其他：白色滤纸片、无菌平板、试管、接种 环、酒精灯、高压灭菌器、显微镜、玻片等。
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4.1 缓冲蛋白胨水(BPW):见 B.1。
1
4.2 缓冲葡萄糖煌绿胆盐肉汤(EE 肉汤):见 B.2。 4.3 结晶紫中性红胆盐葡萄糖琼脂(VRBGA):见 B.3。 4.4 营养琼脂(NA):见 B.4。 4.5 葡萄糖琼脂:见 B.5。 4.6 革兰氏染色液:见 B.6。 4.7 氧化酶试剂:见 B.7。 4.8 无菌1 mol/L NaOH:见 B.选的每一个菌落,划线于营养琼脂平板,36 ℃±1 ℃培养18h~24h,挑取平板上 的 菌 落 进 行 革 兰 氏 染 色 镜 检 、氧 化 酶 试 验 及 葡 萄 糖 发 酵 试 验 。
6.2 倾注平板和培养
6.2.1 根据对样品污染状况的估计及相关限量要求,选择2个~3个适宜的连续稀释度的样品匀液(液 体样品可以选择原液),每个稀释度接种2个无菌平皿。同时,分别吸取1 mLBPW 加入两个无菌平皿 内作为空白对照。 6.2.2 将10mL~15mL 冷却至46 ℃的 VRBGA(可放置于46 ℃±1 ℃恒温水浴箱中保温)倾注于每 个 平 皿 中 。 小 心 旋 转 平 皿 ,使 样 品 匀 液 与 培 养 基 充 分 混 匀 。 6.2.3 待琼 脂 凝 固 后,倾 注 一 薄 层 同 样 的 培 养 基 覆 盖 平 板 表 层。 防 止 蔓 延 生 长 并 使 菌 落 特 征 更 为 明显。 6.2.4 待 VRBGA 平板上层琼脂凝固后翻转平板,36 ℃±1 ℃培养18h~24h。
GB 4789.41—2016
食品安全国家标准
食品微生物学检验 肠杆菌科检验
1 范围
本 标 准 规 定 了 食 品 中 肠 杆 菌 科 (Enterobacteriaceae)的 检 验 方 法 。 本标准第一法适用于肠杆菌科含量较高的食品中肠杆菌科的计 数;第 二 法 适 用 于 肠 杆 菌 科 含 量 较 低食品中肠杆菌科的计数。
6.3 典型菌落计数和确认
6.3.1 肠杆菌科典型菌落为有或无沉淀环的粉红色至红色或紫色菌落。选取典型菌落数在15CFU~ 150CFU 之间、无 蔓 延 菌 落 生 长 的 平 板,只 计 数 典 型 菌 落 数。 菌 落 计 数 以 菌 落 形 成 单 位 (colonyformingunits,CFU)表 示 。 6.3.2 其中一个平板有较大片状 菌 落 生 长 时,则 不 宜 采 用,而 应 以 无 片 状 菌 落 生 长 的 平 板 作 为 该 稀 释 度的菌落数;若片状菌落不到平板的一半,而其余一半中菌落分布又很 均 匀,即 可 计 算 半 个 平 板 后 乘 以 2,代 表 一 个 平 板 菌 落 数 。 6.3.3 当平板上出现菌落间无明显界线的链状生长时,则将每条单链作为一个菌落计数。 6.3.4 从每个平板上至少挑取5个(小于5个全选)典型菌落进行确认;如果有不同形态的典型菌落,则 每种形态分别至少挑取1个菌落进行确认。 6.3.5 典型菌落的确认:
2.3 最可能数 mostprobablenumber;MPN 基于泊松分布的一种间接计数方法。
3 设备和材料
除 微 生 物 实 验 室 常 规 灭 菌 及 培 养 设 备 外 ,其 他 设 备 和 材 料 如 下 : 3.1 恒温培养箱:36 ℃±1 ℃。 3.2 冰箱:2 ℃~5 ℃。 3.3 水浴箱:46 ℃±1 ℃。 3.4 天平:感量0.1g。 3.5 显微镜:10倍~100倍。 3.6 均质器。 3.7 振荡器。 3.8 无菌吸管:1 mL(具0.01 mL 刻度)、10 mL(具0.1 mL 刻度)或微量移液器及吸头。 3.9 无菌锥形瓶或等效容器:容量150 mL、500 mL。 3.10 无菌培养皿:直径90 mm。 3.11 无菌试管:18 mm×180 mm、15 mm×150 mm。 3.12 pH 计或 pH 比色管或精密 pH 试纸。
2 术语和定义
2.1 肠杆菌科 Enterobacteriaceae 在 给 定 条 件 下 发 酵 葡 萄 糖 产 酸 、氧 化 酶 阴 性 的 需 氧 或 兼 性 厌 氧 革 兰 氏 阴 性 无 芽 胞 杆 菌 。
2.2 肠杆菌科计数 EnumerationofEnterobacteriaceae 按 本 标 准 规 定 方 法 ,对 每 克 或 每 毫 升 检 样 中 的 肠 杆 菌 科 进 行 计 数 。
第一法 肠杆菌科平板计数法
5 检验程序
肠 杆 菌 科 平 板 计 数 法 检 验 程 序 见 图 1。
GB 4789.41—2016
图1 肠杆菌科平板计数法检验程序
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GB 4789.41—2016
6 操作步骤
6.1 样品的稀释
6.1.1 固 体 和 半 固 体 样 品:称 取 25g 样 品 放 入 盛 有 225 mLBPW 的 无 菌 均 质 杯 中,8000r/min~ 10000r/min均质1 min~2 min,或 放 入 盛 有 225 mL BPW 的 无 菌 均 质 袋 中,用 拍 击 式 均 质 器 拍 打 1 min~2 min,制成1∶10的样品匀液。 6.1.2 液体样品:以无菌吸管吸取25 mL 样品放入盛有225 mLBPW 的无菌锥形瓶(瓶内预置适当数 量 的 无 菌 玻 璃 珠 )中 ,充 分 混 匀 ,制 成 1∶10 的 样 品 匀 液 。 6.1.3 用1mL 无菌吸管或微量移液器吸取1∶10样品匀液1mL,沿管壁缓缓注入盛有9mLBPW 的 无菌试管中(注意吸管或吸头尖端不应触及稀释液面),振摇试管或换用1支1 mL 无菌吸管反复吹打, 使 其 混 合 均 匀 ,制 成 1∶100 的 样 品 匀 液 。 6.1.4 按6.1.3操作程序,依次制成10倍递增系列稀释样品匀液。每递增稀释1次,换用1支1mL 无 菌吸管或吸头。从制备样品匀液至样品接种完毕,全过程不得超过15 min。