凝胶渗透色谱教学文案
凝胶渗透色谱讲课文档
Hostavin N30
Column:
2xPLgel 3µm MIXED-E
Flow rate:
1.0ml/min
Injection volume: 20µl
Detector:
PL-ELS 1000
Eluent Modification in Organic GPC - Acids
▪ Some acidic samples
谱被称作 传统GPC
第30页，共55页。
RI/V 检测器结合使用
VI的响应值正比于 C H / M = C []
H，大分子的尺寸；流体力学体积 [] = VI / RI，特征粘度(intrinsic viscosity)
普适校正的假设：
具有同样大小(H)的大分子应有同样的洗脱体积， 即依赖性
– H = MST [] ST
for each standard
增加分子量
聚合物的各种平均分子量
Mn：用渗析计测出(Osmometry) Mw：用光散射计测出(Light Scattering) Mv：用粘度计测出(Viscometry) Mz及Mz+1：用超速离心法测出(Ultracentrifuge) Mw/Mn：为多分散性(Polydispersity) Mn<Mv<Mw<Mz<Mz+1
▪ Can cause peak shape
variation due to mismatch in pore volume
聚合物色谱中的检测器
浓度
响应值正比于浓度C 实例：示差(refractometer)检测器
N = (dn/dc) C
紫外检测器
蒸发光散射检测器
使用单一浓度型检测器的体积排除分离模式色
第九章凝胶渗透色谱讲解
凝胶色谱分析二〇一一年九月九日第九章凝胶色谱分析凝胶渗透色谱（Gel Permeation Chromatography, GPC），又称尺寸排阻色谱（Size Exclusion Chromatography, SEC），其以有机溶剂为流动相，流经分离介质多孔填料（如多孔硅胶或多孔树脂）而实现物质的分离。
GPC可用于小分子物质和化学性质相同而分子体积不同的高分子同系物等的分离和鉴定。
凝胶渗透色谱是测定高分子材料分子量及其分布的最常用、快速和有效的方法[1]。
凝胶渗透色谱（GPC）的创立历程如下[2,5]：1953年Wheaton和Bauman用多孔离子交换树脂按分子量大小分离了苷、多元醇和其它非离子物质，观察到分子尺寸排除现象；1959年Porath和Flodin用葡聚糖交联制成凝胶来分离水溶液中不同分子量的样品；1964年J. C. Moore将高交联密度聚苯乙烯-二乙烯基苯树脂用作柱填料，以连续式高灵敏度的示差折光仪，并以体积计量方式作图，制成了快速且自动化的高聚物分子量及分子量分布的测定仪，从而创立了液相色谱中的凝胶渗透色谱。
近年来，光散射技术（如图9-1所示，一束光通过一间充满烟雾的房间，会产生光散射现象。
）广泛应用于高分子特征分析领域[3]。
将光散射技术和凝胶渗透色谱（GPC）分离技术相结合，可以测定大分子绝对分子量、分子旋转半径、第二维里系数，也可测定分子量分布、分子形状、分枝率和聚集态等。
目前，该技术在高分子分析领域已成为一种非常有效的工具，在美国，日本及欧洲广为使用，国内近年来亦引进了此项技术。
入射光散射光图9-1光散射现象9.1 基本原理9.1.1凝胶渗透色谱分离原理让被测量的高聚物溶液通过一根内装不同孔径的色谱柱，柱中可供分子通行的路径包括粒子间的间隙（较大）和粒子内的通孔（较小）。
如图9-2、图9-3所示，当待测聚合物溶液流经色谱柱时，较大的分子只能从粒子间的间隙通过，被排除在粒子的小孔之外，速率较快；较小的分子能够进入粒子中的小孔，通过的速率慢得多。
凝胶色谱的讲义第一章(1)
凝胶色谱的讲义第一章(1)第一章前言一、高聚物及多糖平均分子量及其分布1、高聚物的平均分子量除天然聚合物外，合成聚合物都是以单体为原料经过聚合反应而制得的。
每个聚合物分子都是由数目很大的单体分子加成或缩合而成，所以合成聚合物的分子量比单体要大千百倍甚至成万倍。
另一方面，根据绝大多数的聚合反应机理预示，生成的聚合物的分子量是不均一的，也就是说每个聚合物分子可以由不同数目的单体分子聚合而成，所以各聚合物的分子量是不相等的，这种现象叫做聚合物的分子量的不均一性或多分散性。
高聚物分子量的多分散性使分子量的表征比小分子要复杂一些，拿一个高聚物试样来说，由于试样内包含有许许多多个高分子，这些高分子的分子量可以分布在相当大的范围内。
例如，试样中可以包含尚未聚合的单体、含二个、三个、四个、…单体的低聚物以及聚合度不同的高分子，对这样一个多分散的体系来说，我们要表征它的分子量就需要用统计的方法，求出试样分子量的平均值和分子量分布、由于应用统计方法的不同，即使对同一个试样，也可以有许多不同种类的平均分子量；例如，某一个高聚物试样中含有N1个分子量为M；的分子，N2个分子量为M2的分子，N3个分子量为M3的分子，……Ni-1个分子量为Mi-1的分子以及Ni个分子量为MI 的分子，我们就可以根据定义算出它的各种平均分子量。
下面是四种最常用的平均分子量定义：这里：YMx分子量名称Mn数均分子量1Mw重均分子量2MzZ均分子量3MZ+1Z+1均分子量Mw/Mn分子量分布Mp峰位分子量另外，粘均分子量：很显然，同一个试样应用不同的统计方法所算出来的不同种类的平均分子量的数值是不同的。
一般情况下，多分散样品的平均分子量有以下次序：Mz＞Mw ＞M η＞Mn 2．高聚物的分子量分布高聚物的分子量分布是指试样中各种大小不等的分子量组分在总量中所占的各自的分量，它可以用一条分布曲线或一个分布函数来表示。
例如，当我们知道高聚物试样中分于量为M1、M2、M3、…、Mi各组分在总重量中所占的重量分数分别为W1 、W2、W3 、…、Wi 时，我们就可以用对应的W和M作图，得到分子量分布曲线。
第2章 凝胶渗透色谱
泵系统:包括一个溶剂贮存器、一套脱气装
置和一个高压泵。它的工作是使流动相(溶 剂)以恒定的流速流入色谱柱。泵的工作状 况好坏直接影响着最终数据的准确性。越 是精密的仪器，要求泵的工作状态越稳定。 要求流量的误差应该低于0.01mL／min。 进样系统:凝胶色谱仪都配备有一个阀环和 一个隔膜进样器，对于粘度较大的试样， 常可通过阀环来进样。
填料（根据所使用的溶剂选择填料，对填料最 基本的要求是填料不能被溶剂溶解）：交联 聚苯乙烯凝胶（适用于有机溶剂，可耐高 温）、交联聚乙酸乙烯酯凝胶（最高100℃， 适用于乙醇、丙酮一类极性溶剂）多孔硅球 （适用于水和有机溶剂）、多孔玻璃、多孔 氧化铝（适用于水和有机溶剂） 柱子：玻璃、不锈钢
溶剂： 选用原则： (a)所用的有机溶剂必须很好地溶解试样。 (b)所用的有机溶剂能够很好地将凝胶溶胀(这
提高而提高，例如，抗张强度、冲击强度、 弹性模量、硬度、抗应力开裂、粘合强度随 之提高。为此我们期望聚合物材料有较高的 分子量。另一方面，太高的分子量又给材料 加工造成困难。兼顾到材料的使用性能与加 工性能两方面的要求，高分子的分子量大小 应控制在一定范围之内。
分子量分布的表示方法
⑴分子量分布曲线 图给出两种宽窄不同的聚合物分子量分布示意图，图中 标出各平均分子量的大概位置。
相对分子质量检测器：间接法和直接法。 间接法即体积指示法：由于凝胶色谱法是按 分子尺寸大小来分离的，对给定的色谱柱而 言，一定大小的分子必然在一定体积时淋出， 如果用已知相对分子质量的标准物质标定好 色谱柱，得到一系列的相对分子质量与淋洗 体积的关系，对未知样品只要测得淋洗体积， 用上述的相对分子质量与淋洗体积的关系， 即可求出该试样的相对分子质量。
二十世纪60年代J.C.Moore在总结了前人经验的基 础上，结合大网状结构离子交换树脂制备的经验， 将高交联度聚苯乙烯凝胶用作柱填料，同时配以连 续式高灵敏度的示差折光仪，制成了快速且自动化 的高聚物分子量及分子量分布的测定仪，从而创立 了液相色谱中的凝胶渗透色谱技术。 不仅可用于小分子物质的分离和鉴定，而且可以用 来分析化学性质相同分子体积不同的高分子同系物。 (聚合物在分离柱上按分子流体力学体积大小被分离 开）
GPC讲稿
K1、K2、α 1、α 2在固定条件下是常数，已知两种高
聚物在该条件下的K1、K2、α 1、α 2值
由标准样品的logM-Ve标定线求出被测样品高聚物的 logM-Ve标定线
GPC分析方法
计算平均分子量
可处理任何形状的GPC谱图 选20个点
选20个点
选40个点
GPC分析方法
计算平均分子量
多数聚合物的GPC谱图是对称的，近 似于高斯分布
GPC图谱
高分子材料的GPC全分析谱图
GPC分析方法
GPC图谱
单 分 散 多 分 散
横坐标色谱保留值 纵坐标代表流出液的浓度
GPC分析方法
单分散标准曲线数据处理
选用一系列不样品同类型的丌同 分子量(已知)的单分散（ Mw/Mn< 1.1）标样，不被测样 品在相同条件下进行GPC分析， 每一个标样的Ve对应其lgM，即 可得到lgM Ve曲线，称为单分 散性标样校准曲线
GPC分析方法
进样浓度范围及体积
• 分子量范围 样品浓度
–低于5,000 <1.0% –5,000～25,000 <0.5% –25,000～200,000 <0.25%
–200,000～2,000,000 <0.1%
–高于2,000,000 <0.05%
• 进样体积：50-100uL
GPC分析方法
分布
• GPC可以同时测定聚合物的相对分子质量及其分
布，方法快速有效
GPC分离原理
• 立体排斥理论
– 固定相是多孔填料，小分子样品可进入孔径内部 – 样品不固定相之间无作用力 – 迁秱时间丌同
GPC分离原理
被分离的高聚物在溶液中以无规线团的形式存在，
J2ScientificGPC凝胶渗透色谱操作指导
J2ScientificGPC凝胶渗透色谱操作指导J2 Scientific GPC凝胶渗透色谱操作指南应用部分在您阅读本指南之前，最好先熟悉仪器的操作，并已经掌握<软件中文操作手册>中的内容。
本指南旨在帮助新用户掌握仪器的维护，方法建立及简单的故障排除，北京绿绵巨贸科贸有限公司对此指南保留全部权力，任何未经允许的复制、转载及其他以赢利为目的的商业行为均构成对本公司的侵权。
凝胶渗透色谱原理简介Accuprep系统结构及工作框图注意事项如何建立适合我的应用的方法GPC柱的维护和重新装填如何备份数据常见故障分析凝胶渗透色谱原理简介凝胶渗透色谱，简称GPC，是一项比较传统的分离技术，GPC的柱子由化学惰性的中空小球组成，利用空间排阻的原理对样品进行分离，详见下图:小分子通过填料“球”中的孔大分子不能从孔中通过由于小分子化合物会从填料的孔中穿过，而大分子从填料周围的空间穿过，会造成小分子与大分子之间的行程差距，这样大分子与小分子会先后从柱中馏出，起到分离的作用。
由于这一分离技术不受样品极性的影响，所以对于色谱用户来说，是一种非常有效解决色谱柱不能分开的样品的手段，尤其是对于脂肪类，蛋白及色素类大分子干扰物，这些物质对于色谱柱，进样口来说非常危险，而在生物源样品当中的含量一般又比较高，那么在进行样品分析之前进行一步GPC净化就显得非常必要了。
Accuprep系统结构及工作框图TM是由美Accuprerp国J2 Scientific公司生产的凝胶渗透样品净化系统，早在上世纪80年代就引入中国，目前其产品型号主要有手动AccuPrepJr和自动AccuPrep两种，在2005年该公司又推出了新型TM 的AccuprerpMPS系统，体积进一步小型化，并能整合计算机及在线浓缩，SPE等多种技术，更加趋于成熟。
由于目前大家采购这一仪器主要是为了提高效率，本指南将重点放在对自动仪器的介绍方面。
TM自动系 TM手动系Accuprerp统 Accuprerp统AccuPrep MPS自动系统 AccuPrep MPS +AccuVap GPC在线浓缩系统一台完整的GPC系统包括几个部分:触摸屏，控制模块，输送泵，检测器，自动进样器和软件部分。
实验七凝胶渗透色谱法测定聚合物分子质量及其分布
实验七凝胶渗透色谱法测定聚合物分子质量及其分布实验七凝胶渗透色谱法测定聚合物的相对分子质量及其分布一、实验目的 1.了解凝胶渗透色谱法测定聚合物相对分子质量及其分布的原理。
2.了解凝胶渗透色谱仪的仪器构造和初步掌握凝胶渗透色谱仪的实验技术。
3．测定聚苯乙烯样品的相对分子质量及其分布。
二、实验原理聚合物的相对分子质量量及其分布是聚合物性能的重要参数之一，它对聚合物材料的物理机械性能和可加工性等影响很大。
测定聚合物的相对分子质量及其分布的最常用、快速和有效的方法是凝胶渗透色谱法。
1. GPC分离机理 GPC是一种新型液相色谱，除了能用于测定聚合物的相对分子质量及其分布外，还广泛用于研究聚合物的支化度、共聚物的组成分布及高分子材料中微量添加剂的分析等方面。
同各种类型的色谱一样，GPC具有分离功能，其分离机理比较复杂，目前还未取得一致的意见。
但在GPC的一般实验条件下，体积排除分离机理被认为起主要作用。
体积排除分离机理的理论认为：GPC的分离主要是由于大小不同的溶质分子在多孔性填料中可以渗透的空间体积不同而形成的。
装填在色谱柱中的多孔性填料的表面和内部分布着大小不同的孔洞和通道。
当被测试的多分散性试样随淋洗溶剂进入色谱柱后，溶质分子即向填料内部孔洞渗透，渗透的程度取决于溶质分子体积的大小。
体积较大的分子只能进入较大的孔洞，而体积较小的分子除了能进入较大的孔洞外还能进入较小的孔洞，因此体积不同的分子在流过色谱柱时实际经过的路程是不同的，分子体积越大，路程越短。
随着溶剂淋洗过程的进行，体积最大的分子最先被淋洗出来，依次流出的是尺寸较小的分子，最小的分子最后被淋洗出来，从而达到使不同大小的分子得到分离的目的。
以上为GPC机理的一般解释。
按照一般的色谱理论，试样分子的保留体积VR可用下式表示： Ve=Vo+KVi 式中，Ve为淋出体积，即指溶液试样从进色谱柱到被淋洗出来的淋出液总体积；Vo为柱中填料粒子的粒间体积；Vi为柱中填料粒子内部的孔洞体积；K为分配系数，即可以被溶质分子进入的粒子孔体积与粒子的总孔体积之比。
实验 凝胶渗透色谱法测定分子量(讲义)
实验六 凝胶渗透色谱法测定分子量聚合物分子量具有多分散性，即聚合物的分子量存在分布。
不同的聚合方法、聚合工艺会使聚合物具有不同的分子量和分子量分布。
分子量对聚合物的性能有十分密切的关系。
而分子量分布的影响也不可忽视。
当今高分子材料已向高性能化发展，类似分子量分布等高一层次的高分子结构的问题，越来越引起人们的重视。
自高分子材料问世以来，人们不断探索分子量分布的测定方法。
直到60年代凝胶渗透色谱诞生。
成为迄今为止最为有效的分子量分布的测定方法。
三十多年来，凝胶渗透色谱技术得到了很大的发展，表现在色谱柱体积减小而分离效率提高；检测器精度提高。
在线分子量检测技术得到应用；并随着计算机的发展，数据处理得快速、精确、信息量增加也更趋明显。
一、实验目的：1． 了解凝胶渗透色谱的原理；2． 了解凝胶渗透色谱的仪器的构造和凝胶渗透色谱的实验技术；3． 测定聚苯乙烯样品的分子量分布。
二、实验原理：凝胶渗透色谱（Gel Permeation Chromatography.简称GPC ）也称为体积排除色谱（Size Exclution Chromatograph.简称SEC ）是一种液体（液相）色谱。
和各种类型的色谱一样，GPC/SEC 的作用也是分离，其分离对象是同一聚合物中不同分子量的高分子组分。
当样品中不同分子量的高分子组分的分子量和含量被确定，也就找到了聚合物的分子量分布，然后可以很方便地对分子量进行统计，得到各种平均值。
一般认为，GPC/SEC 是根据溶质体积的大小，在色谱中体积排除效应即渗透能力的差异进行分离。
高分子在溶液中的体积决定于分子量、高分子链的柔顺性、支化、溶剂和温度，当高分子链的结构、溶剂和温度确定后，高分子的体积主要依赖于分子量。
凝胶渗透色谱的固定相是多孔性微球，可由交联度很高的聚苯乙烯、聚丙烯酸酰胺、葡萄糖和琼脂糖的凝胶以及多孔硅胶、多孔玻璃等来制备。
色谱的淋洗液是聚合物的溶剂。
当聚合物溶液进入色谱后，溶质高分子向固定相的微孔中渗透。
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GPC载体的种类： 1. 交联聚苯乙烯凝胶 2. 多孔性玻璃 3. 半硬质及软质填料包括聚乙酸乙烯 酯凝胶及聚丙烯酰胺凝胶 4. 木质素凝胶等
分离原理。
(A)
(B)
(C)
(D)
保留时间
进 样
色谱柱对GPC/SEC 色谱分离的影响
参数
峰的分离
峰加宽
分辨率和准确率
色谱柱体积
++
色谱柱填料:
填料颗粒尺寸
0
填料颗粒的孔隙率 +
填料颗粒的形状 0
孔的尺寸分布
+
孔的形状
0
++
++
凝胶柱的分离按照尺寸进行
++
++
0
+
0
0
0
+
0
0
0 = 可以忽略的因素 + = 影响适中的因素 ++ = 影响很大的因素
凝胶色谱的任务
分子量的分布与高分子材料的 所有关键加工特性以及材料性能紧 密相关
Plastics Technology, May 1986
聚合物的各种平均分子量
用SEC测得的不同种平均分子量可对应于其他仪器所 测的值：
– Mn：用渗析计测出(Osmometry) – Mw：用光散射计测出(Light Scattering) – Mv：用粘度计测出(Viscometry) – Mz及Mz+1：用超速离心法测出
合物
超临界
有机组份键合于 超临界流体和
流体
固体表面
键合相间分配
体积排斥色谱 SEC( Size Exclusion Chromatography）的发展史
1953年 Wheaton和Bauman 用多孔离子交换树脂按 分子量大小分离了苷、多元醇和其它非离子物质， 观察到分子尺寸排除现象。 ➢ 1959年 Porath和 Flodin 用葡聚糖胶联制成凝胶 来分离水溶液中不同分子量的样品。 ➢ 1962年 J.C.Moore 将高交联度聚苯乙烯-二乙烯基 苯树脂用作柱填料，以连续式高灵敏度的示差折光 仪，并以体积计量方式作图，制成了快速且自动化 的高聚物分子量及分子量分布的测定仪，从而创立 了液相色谱中的凝胶渗透色谱技术。
(Ultracentrifuge) – Mw/Mn：为多分散性(Polydispersity) – Mn<Mv<Mw<Mz<Mz+1
增加浓度
聚合物的分子结构
PD = Mw / Mn
分子量分布
增加分子量
分子量分布
单分散性聚合物 窄分布聚合物
中等分布聚合物 宽分布聚合物
Mw/Mn = 1.00 Mw/Mn < 1.20 Mw/Mn < 2.00 Mw/Mn > 2.00
5 测试完毕后，执行Shut Down程序，待控制面板显示 Power Off 后关闭仪器电源和电脑。
SEC 分类
凝胶渗透色谱 (GPC: Gel permeation chromatography ) – 主要用于聚合物领域 – 以有机溶剂为流动相(氯仿，THF，DMF) – 常用固定相填料：苯乙烯－二乙烯基苯共聚物
体积排斥色谱（SEC)工作原理
➢ 以多孔树脂为固定相，用溶剂推动分子量大小 不同的样品流过固定相产生大小分子顺序流出 的分离
➢ 流出级份的保留时间（洗脱体积）提供其分子 量（尺寸）的信息
➢ 用检测器得到各流出组分的强度和流出时间 ➢ 用已知分子量的标样标定出流出时间和分子量
的关系 ➢ 用标定好的时间和分子量的关系对未知样各流
GPC/SEC体积排斥色谱
Log (分子量MW)
分子量MW vs. 淋洗体积
8.00
排斥
6.00
极限
4.00
2.00
0.00 10.0
15.0
20.0
淋洗体积 (mL)
全部 渗入
25.0
排阻极限 ----不能进入凝胶颗粒孔穴内部的最小分子的分 子量。所有大于排阻极限的分子都不能进入凝胶 颗粒内部，直接从凝胶颗粒外流出，所以它们同 时被最先洗脱出来。排阻极限代表一种凝胶能有 效分离的最大分子量，大于这种凝胶的排阻极限 的分子用这种凝胶不能得到分离。随固定相不同， 排阻极限范围约在 400至60×106之间。
1 打开电脑，点击EcoSEC-WS工作站，输入密码，进入 采集控制应用程序。
2 开启仪器电源，点击工作站控制系统Power按钮，待 联机显示成功后，设定流速、温箱温度和检测条件。
3 设定Warm Up时的流速和待机时间，并执行该程序。
4 将待测样品放入样品托盘，设定运行时间、数据采 集时间、样品测定序列，执行Analysis 程序，进行标 准物质和样品的测定及数据处理。
谱
固体表面
表面间的分配
液液色谱
液体吸附于固体 不 相溶 液体 间
的分配
液
液 固 ( 吸 附 ) 色 固体吸附剂 谱
吸附
相 液相键合色谱 有 机 组 份 键 合 于 液 体和 键合 体
色
固体表面
表面间的分配
谱 离子交换色谱 离子交换树脂
离子交换
凝胶渗透(尺寸 液 体 附 于 多 孔 聚 分配/筛析
排阻)色谱
GPC是如何工作的
凝胶色谱柱的分离
SEC 体积排 除色谱（ GPC）不同 于 HPLC, 没有化学作 用。
时间 顺序 (A) 样品进入(B) 尺寸分离 (C) 大尺寸 (D) 小尺寸溶质
溶剂流动
溶质 洗提
洗提
混合样品
多孔性填料
SEC 体积排
除色谱（
示差检测器
GPC）依靠
单纯的物理 色谱图（浓度淋洗曲线）
凝胶渗透色谱法测定 分子量分布原理
实验目的
1 掌握GPC测定物质分子量及其分布 的基本原理和仪器的使用方法。 2 测定样品的GPC谱图，由软件获得 Mn,Mw,PDI。
色谱分类
分类
方法
固定相
平衡类型
气 气液色谱
液体吸附于固体 气液间分配
相 气固色谱
固体吸附剂
吸附
色 气相键合色谱 有 机 组 份 键 合 于 液 体和 键合 体
DVB/PS Packing Particle 20,000x
有机 GPC 介质
▪ 悬浮聚合产生苯乙烯基二乙基苯聚合物的单体颗粒 ▪ 开始的小颗粒融合集合成最终的颗粒 ▪仔细控制反应环境产生出合适的单体孔和颗粒的尺寸
Pore Structure Defines Resolving Range
体积排除分离机理
出级份的时间（分子量）和强度进行统计计算 得到分子量分布
色谱仪组成示意图
示差折光检测器恒温区
S R
缓冲柱 柱温箱
进样阀
预热板Biblioteka 色谱柱自动进样器废液管
放空阀
废 液
溶 剂
溶剂输 送系统
I Out n
在线脱气
凝胶渗透色谱 HLC-8320 GPC 生产厂商：日本东曹株式会社
HLC-8320 GPC操作规程