固定化酶
酶的固定化
3.扩散限制效应
酶固定化使生物催化反应从均相转化为多相，于是产 生了扩散阻力：
●
外扩散阻力是底物从宏观环境向酶颗粒表面传递过
程中的一种扩散限制效应，发生在固定化颗粒周围的液膜
层。它会使底物在固相酶周围形成浓度梯度，通过增加搅 拌速度和底物流速的方法可以减少外扩散效应。
●
内扩散阻力是指底物分子达到固相酶表面后传递到
缺点：
● ● ●
固定化时，酶活力有损失； 增加了生产的成本，工厂初始投资大； 只能用于可溶性底物，而且较适用于小分子底物， 与完整的菌体相比不适于多酶反应，特别是需要辅 胞内酶必须经过酶的分离手续。
对大分子底物不适宜；
●
助因子的反应；
●
三、影响固定化酶性质的因素
分配效应 空间障碍效应 扩散抑制效应
在具体选择时，一般应遵循以下几个原则：
（1）必须注意维持酶的构象, 特别是活性中心的构象。
（2）酶与载体必须有一定的结合程度。
（3）固定化应有利于自动化、机械化操作。 （4）固定化酶应有最小的空间位阻。 （5）固定化酶应有最大的稳定性。 （6）固定化酶的成本适中。
1.吸附法
吸附法（Adsorption） 是通过载体表面和酶分子 表面间的次级键相互作用 而达到固定目的，是固定 化中最简单的方法。只需 将酶液与具有活泼表面的 吸附剂接触，再经洗涤除 去未吸附的酶便能制得固 定化酶。
●
●
●
1.分配效应
由于载体和底物的性质 差异引起了微环境和宏观 环境之间的性质不同。微 环境是在固定化酶附近的 局部环境，而将主体溶液 称为宏观环境。由这种不 同造成的底物、产物和各 种效应物在两个环境之间 的不同分配，被称为分配 效应。
2.空间障碍效应
酶与细胞的固定化
发酵液中含菌体少，有利于产品的分离纯化，提高产品质量等
第五节 固定化酶和固定化细胞的表征
• 缺点：酶与载体相互作用力弱，酶易脱落等 1）引入功能团和间隔臂；
第五节 固定化酶和固定化细胞的表征
酶被物理吸附于不溶性载体的一种固定化方 固定化后酶的哪些主要性质发生了变化?变化的趋势及原因分析.
常见非共价法?常见共价法?
法。 少量的持续不断的配基的脱落;
交联法由于不需要活化基团,所以条件比较温和,酶活的回收率比较高? 活力回收:指固定化后固定化酶(或细胞)所显示的活力占被固定的等当量游离酶(细胞)总活力的百分比. 第五节 固定化酶和固定化细胞的表征
颗粒、线条、薄膜和酶管等形状。颗粒状占 绝大多数，它和线条主要用于工业发酵生产 ，薄膜主要用于酶电极。酶管机械强度较大 ，主要用于工业生产。
固定化酶的优势：
① 极易将固定化酶与底物、产物分开；产物溶 液中没有酶的残留，简化了提纯工艺；
② 可以在较长时间内进行反复分批反应和装柱 连续反应
③ 酶反应过程能够加以严格控制； ④ 较游离酶更适合于多酶反应； ⑤ 在大多数情况下，能够提高酶的稳定性； ⑥ 可以增加产物的收率，提高产物的质量； ⑦ 酶的使用效率提高、成本降低。
在中性pH下优先与a-氨基反应,因此有一定的选择性 缺点：在包埋过程发生的化学反应同样会导致酶的失活。
• 优点：酶活性中心不易被破坏，酶高级结构 二、载体活化程度和固定化配基密度的测定
固定化过程中，酶分子空间构象会有所变化，甚至影响了活性中心的氨基酸；
用此法制备的固定化酶有蛋白酶、脲酶、核糖核酸酶等。
第六章固定化酶
变；
这是由于固定化载体成为扩散障碍，使反应
产物向外扩散受到一定的限制所造成的。当
反应产物为酸性时，由于扩散受到限制而积
累在固定化酶所处的催化区域内，使此区域 内的pH比降低，必须提高周围反应液的pH， 才能达到酶所要求的pH。为此，固定化酶的 最适pH比游离酶要高一些。反之，反应产物
固定化酶作用的最适温度可能会受到固定方法和固定化载 体的影响。
5． 底物特异性变化
固定化酶的底物特异性与游离酶比较可能有些不同， 其变化与底物相对分子质量的大小有一定关系。
作用于小分子底物的酶
特异性没有明显变化
既可作用于小分子底物又可作用于大分子底物的酶 特异性往往会变化。
Eg：胰蛋白酶：高分子蛋白、低分子（二肽、多肽），固定在羧甲基 纤维素上，对二肽或多肽的作用保持不变，而对酪蛋白的作用仅为游 离酶的3%；
为碱性时，由于它的积累使固定化酶催化区 域的pH升高，故此使固定化酶的最适pH比游 离酶的最适pH要低一些。
固定化酶最适温度的变化
一般与游离酶差不多，但有些会有较明显的变化
Eg：用重氮法制备的固定化胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶，其 作用的最适温度比游离酶高5—10
以共价结合法固定化的色氨酸酶，其最适温度比游离酶高
——这种固定化的酶既具有酶的催化特性， 又具有一般化学催化剂能回收、反复使 用等优点，并且生产工艺可以连续化、 自动化。
3
进展
1916年Nelson和Griffin利用活性炭吸附蔗糖酶
固定化酶的研究从20世纪50年代开始
1953年德国的Grubhofer和Schleith采用聚氨基苯 乙烯树脂为载体，经重氮法活化后，分别与羧肽 酶、淀粉酶、胃蛋白酶、核糖核酸酶等结合，而 制成固定化酶。
固定化酶的三种方法
固定化酶的三种方法固定化酶是把酶结合到一定的表面上，使其失去活性的过程，因此可以用来改变酶的性质、增加酶的稳定性和提高酶的反应效率。
固定化酶的三种方法是物理化学固定化、生物化学固定化和免疫化学固定化。
一、物理化学固定化物理化学固定化是一种将未固定化酶与支架分子相互作用，使酶与支架分子结合，形成可操作的固定化酶系统的方法。
其基本原理是通过多种物理、化学或生物学方法，将酶与支架分子进行结合，从而形成一个可操作的固定化酶系统。
物理化学固定化可以大大提高酶的反应活性、稳定性和重复利用性，并可以改变酶的特性。
常用的物理化学固定化方法有水解结合、热结合、冷结合、电结合、化学结合、离子结合和生物结合等。
二、生物化学固定化生物化学固定化是指将酶与生物聚合物结合，使酶形成可操作的固定化酶系统的方法。
其基本原理是在酶表面分子和支架分子之间形成一种亲和力，使得酶和支架分子之间形成紧密的结合。
生物化学固定化的优势在于，它可以改变酶的特性，使酶更加稳定和可操作，而且不必进行大量的实验，可以节省时间和费用。
常用的生物化学固定化方法有抗体结合法、抑制剂结合法和蛋白结合法等。
三、免疫化学固定化免疫化学固定化是一种将酶与抗体结合，形成可操作的固定化酶系统的方法。
其基本原理是将酶和抗体进行结合，从而形成一个稳定的固定化酶系统。
免疫化学固定化具有较强的特异性，可以在具有极强抗性的环境中实现高效固定化；且不仅能实现酶的固定化，还可以改变酶的特性，使酶更加稳定和可操作。
常用的免疫化学固定化方法有免疫结合法、单克隆抗体结合法和抗体体外表达法等。
综上所述，固定化酶的三种方法是：物理化学固定化、生物化学固定化和免疫化学固定化。
它们可以改变酶的特性，使酶更加稳定和可操作，提高酶的反应活性、稳定性和重复利用性，从而更好地满足人们在实验中的需求。
固定化酶的方法
固定化酶的方法
固定化酶是将酶固定在载体上，形成固定化酶，具有高效、稳定、重复使用等优点。
下面是一种常用的固定化酶方法。
材料：
- 酶
- 载体（如聚丙烯脂、硅胶、玻璃等）
- 活性剂（如戊二醛、双醛、聚乙二醇等）
- 缓冲液（如PBS缓冲液）
- 洗涤液（如去离子水或PBS缓冲液）
步骤：
1. 制备载体：将载体清洗干净并消毒，然后在室温下干燥或烘干。
2. 固定化酶：将制备好的载体浸泡在含有活性剂的缓冲液中，搅拌均匀。
然后加入适量的酶，搅拌均匀并放置一段时间（根据不同的活性剂和载体类型，时间不同）。
最后用洗涤液洗净固定化酶。
3. 检测固定化酶活性：采用适当的方法检测固定化酶的活性，如比色法、荧光法等。
4. 贮存固定化酶：将固定化酶保存在干燥、阴凉、密闭的容器中，避免受潮和受热。
注意事项：
1. 活性剂的选择应根据酶的特性和载体的特点进行选择。
2. 固定化酶活性与载体、活性剂、酶的比例等因素有关，需要进行优化实验。
3. 贮存时要避免温度过高或过低，否则会影响固定化酶的稳定性和活性。
以上是一种常用的固定化酶方法，具体操作时应根据实验要求和条件进行调整。
第九章固定化酶
（游离α--氨基，lys—ζ—NH2, Arg胍基，-COOH, Asp—γ--羧基Glu--羧基， 酚羧基，巯基，咪唑基) 但是，载体、酶分子上的基团是不能直
接反应，功能基团要活化，
第九章 固定化酶
1)重氮化
芳香氨基载体
方法特点：
载体先用亚硝酸处理成重氮盐衍生物， 在温和条件和酶分子上相应基团直接偶联。
现有多孔物质包络法，超过滤法 等。实际上用包埋法最多
第九章 固定化酶
各种固定化方法的优、缺点比较
吸附法
固定化方法 物理吸附法 离子吸附法 包埋法 共价键结合法 交联法
制备难易
易
易
较难
难
较难
结合程度
弱
中等
强
强
强
活力回收 高,酶易流失 高
高
低
中等
再生
可能
可能 不能 不能
不能
费用
低
低
低
高
中等
底物专一性 不变
第九章 固定化酶
2)微囊型包埋 常用微囊型包埋剂有尼龙膜、火棉胶、
醋酸纤维素等。
用半透膜将酶包埋在里面， 半透膜容许底物和产物自由出入膜囊，
囊的表面积相对体积的比值大， 底物和产物的交换进行迅速。
第九章 固定化酶
例子：尼龙膜界面聚合包埋
(酶+己二胺水溶液)+庚二酰氯有机溶剂(氯仿)
混合
乳化，二种单体(己二胺和庚二酰氯) 在水相、有机相交界处聚合
芳香族重氮化具疏水性，倾向于进入分子 中Tyr等集中的疏水区偶联而导致失效。
a.当载体为电中性或疏水性时，这种倾向 性越大。
b.当载体用亲水极性物质时，这种疏水区 的特性就大大减小了。
固定化酶的方法和应用
固定化酶是将酶固定在载体上，形成固定化酶催化系统的过程。
通过固定化，可使酶的活性和稳定性得到提高，并能够重复使用。
常用的固定化酶方法包括吸附法、共价连接法、包埋法和交联法等。
1. 吸附法：利用载体表面与酶相互吸附的原理将酶固定在载体表面。
常用的载体包括硅胶、纤维素、聚丙烯酰胺凝胶等。
2. 共价连接法：通过将酶分子与载体分子之间的化学键共价连接，在载体表面上固定酶。
常用的共价连接剂包括辛二酸二酐、戊二酸二酐等。
3. 包埋法：将酶包裹在聚合物中，在聚合物内部形成微观环境，保护酶免受外界环境的影响。
常用的包埋材料包括明胶、蛋白质和聚乙烯醇等。
4. 交联法：将酶和载体分子之间形成交联结构，将酶牢固地固定在载体表面上。
常用的交联剂包括戊二醛、葡萄糖等。
固定化酶在生物技术、食品工业、医药工业等领域有着广泛的应用。
其中，利用固定化酶在生物技术领域中最为突出。
例如，固定化酶可以应用于产生大量纯度高的特定酶，用于DNA重组、制备抗体和识别特定分子等。
此外，在医药工业中也广泛使用固定化酶，如利用固定化酶制备药物、检测生物标志物等方面。
在食品工业中，固定化酶可用于生产乳制品、果汁、啤酒等食品中。
总之，固定化酶是一种重要的生物技术手段，具有广泛应用前景，可推动生物技术、食品工业、医药工业等领域的发展。
第五章-固定化酶
2．离子结合法 酶通过离子键结合于具有离子交换剂的水不溶 性载体的固定化方法。 • 常用载体：各种阴、阳离子交换剂。 如CM-纤
维素、DEAE-纤维素、DEAE-葡聚糖凝胶等
• 优点：操作简单，酶活性中心不易被破坏和酶
高级结构变化少，酶活力损失很少。
• 缺点：载体和酶的结合力 比较弱，酶易脱落。
3.共价结合法
• 相对活力：固定化酶活力与同量蛋白量
的溶液酶活力的比值
固定化酶活力 相对活力 100% 溶液酶总活力 残留酶活力
四、固定化酶（细胞）的半衰期
• t1/2 ：固定化酶（细胞）的活力下降为最 初活力1/2所经历的连续工作时间；衡量 操作稳定性的指标。
Fig. 2. Kinetic of ROL adsorption on the silica aerogels. The activity was measured using olive oil emulsion as substrate at pH 8.5 and 37 °C.
第五章 固定化酶与固定化细胞
第一节 酶的固定化
一、固定化酶（immobilized enzyme）：是 指在一定空间内呈闭锁状态存在的酶，能 连续进行反应，反应后的酶可以回收重复 使用。
优点：
①极易将固定化酶与底物、产物分开，简 化了提纯工艺，提高酶的使用效率； ②在大多数情况下，能够提高酶的稳定；
(五)固定化酶的米氏常数(Km)变化 • 中性载体：固定化酶的表观Km值上升。
• 载体与底物电荷相同：表观Km值显著 上升； • 载体与底物电荷相反：Km
？
四、影响固定化酶性能的因素
1．构象改变、立体屏蔽
• 构象改变：指固定化过程及酶和载体的 相互作用，引起了酶的活性中心构象发 生改变，从而导致酶活性改变的—种效 应。
简述固定化酶的优点和不足
固定化酶的优点：
1.稳定性增强：固定化酶可以降低酶的降解，提高酶的稳定性，使
酶能够更长时间地保持活性。
2.反复使用：固定化酶可以在反应后分离出来，进行重复使用，从
而降低了生产成本。
3.方便操作：固定化酶可以方便地进行分离和纯化，减少了后续处
理的复杂性。
4.可控性高：通过控制固定化酶的条件，可以更好地控制反应条件，
提高反应的效率和产物的纯度。
5.适用范围广：固定化酶可以适用于不同类型的酶和不同的反应系
统，扩大了酶的应用范围。
固定化酶的不足之处：
6.酶活性的损失：在固定化过程中，酶的活性可能会受到一定的损
失。
7.物质传递限制：由于固定化载体和酶之间的传递阻力，可能会影
响反应速率。
8.载体材料的稳定性：一些载体材料在反应条件下可能会发生分解
或破坏，影响酶的稳定性和固定化效果。
9.成本较高：与游离酶相比，固定化酶的生产成本通常较高。
第三章固定化酶
活
化 载
辅基
体
连接臂
载体的选择
没有特异性吸附 具有多孔性 有适合引入配基的官能团 化学稳定性 具有适当的机械强度等。
目前使用的载体主要是琼脂糖，此外还有纤维素、玻 璃珠及合成高分子材料等。
4、化学结合法－共价结合法
原理: 酶蛋白分子上的功能基
团（酶的非活性必需侧 链基团）和固相支持物
表面上的反应基团之间 形成共价键，因而将酶 固定在支持物上。
最常用的偶联基团： -NH2、COOH、-SH、-OH、酚 基、咪唑基
两种固定方式
1. 将载体有关基团 活化，然 后此活泼基团再与酶分子上 某一基团反应形成共价键。
第三章
酶的固定化
第一节 酶的固定化 第二节 辅酶的固定方法 第三节 固定化细胞 第四节 固定化酶的性质及其影响因素 第五节 固定化酶催化反应动力学
对于现代工业来说，酶不是一种理想的 催化剂
绝大多数水溶性的酶，酶蛋白对外界环境很敏 感，极易失活。催化结束后极难回收，只能进 行分批生产。
交联法常与吸附法结合使用，或者与 包埋法配合，目的是使酶紧紧地结合 于载体上。
酶直接交联法
在酶液中加入适量多功能试剂，使其形成不 溶性衍生物。
固定化依赖于酶与试剂的浓度、溶液pH和离 子强度、温度和反应时间之间的平衡。
例：木瓜蛋白酶在0.2％酶蛋白浓度、2.3％戊 二醛、pH5.2-7.2、0℃下交联24h，可形成固 定化酶。
定向固定化方法
① 酶和抗体的亲和连接 ② 酶通过糖基部分固定化 ③ 酶和金属离子连接 ④ 分子生物学方法 基因融合法
翻译后修饰法 特定位点基因突变法
第二节 辅酶的固定方法
原因
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固定化酶的制备及应用摘要：本文主要从酶的固定化载体、固定化方法等方面介绍了固定化酶制备中的研究进展情况，并且从医药、食品、环保、等方面其在其中的新应用出发，对固定化酶在新领域中的应用作了综述，给固定化酶研究的发展前景进行了展望，并且指出了今后酶固定化研究的主要方向是多酶的固定化及制备高活性、高负载、高稳定性的固定化酶。
固定化酶是20世纪60年代发展起来的一项技术。
以往用的酶绝大多数是水溶性性的酶。
这些水溶性的酶催花结束后，极难回收，因而阻碍了酶工业的进一步发展。
60年代后，在美学研究领域内涌现出固定化酶，最早被称为“水不容酶”或“固相酶”，此技术将水不溶性的自然酶与不溶性载体相结合，成为不溶于水的酶的衍生物。
固定化酶（immobilized enzyme）这个术语是在1971 年酶工程会议上被推荐使用的。
利用固定化技术，解决了酶应用过程中的很多问题，为酶的应用开辟了新的前景。
如可使所使用的酶、细胞能反复使用，使产物分离提取容易，并在生产工艺上可以实现连续化和自动化，故在20世纪70年代后得到迅速发展。
其新的功能和新的应用正在迅速不断地扩展，是一项研究领域宽广、应用前景极为引人瞩目的新研究领域和新技术。
1固定化酶的优缺点1.1 优点（1）同一批固定化酶能在工艺流程中重复多次地使用；（2）固定化后，和反应物分开，有利于控制生产过程，同时也省去了热处理使酶失活的步骤；（3）稳定性显著提高；（4）可长期使用，并可预测衰变的速度；（5）提供了研究酶动力学的良好模型。
（6）酶的使用效率提高，产物得率提高，产品质量有保证，成本低。
1.2缺点（1）酶固定化时酶的活力有所损失，同时也增加了固定化的成本。
（2）比较适应水溶性底物和小分子底物。
（3）不适于多酶反应，特别是需要辅酶的反应。
2.固定化酶的制备原则（1 ）必须注意维持酶的催化活性及专一性。
酶的催化反应取决于酶本身蛋白质分子所特有的高级结构和活性中心，为了不损害酶的催化活性及专一性，酶在固定化状态下发挥催化作用时，既需要保证其高级结构，又要使构成活性中心的氨基酸残基不发生变化。
这就要求酶与载体的结合部位不应当是酶的活性部位，应避免活性中心的氨基酸残基参与固定化反应；另外，由于酶蛋白的高级结构是凭借疏水键、氢键、盐键等较弱的键维持的，所以固定化时应采取尽可能温和的条件，避免那些可能导致酶蛋白高级结构破坏的条件，如高温、强酸、强碱、有机溶剂等处理。
（2 ）酶与载体必须有一定的结合程度。
酶的固定化既不影响酶的原有构象，又能使固定化酶能有效回收贮藏，利于反复使用。
（3 ）固定化应有利于自动化、机械化操作。
这要求用于固定化的载体必须有一定的机械强度，才能使之在制备过程中不易破坏或受损。
（4 ）固定化酶应有最小的空间位阻。
固定化应尽可能不妨碍酶与底物的接近，以提高催化效率和产物的量。
（5 ）固定化酶应有最大的稳定性。
在应用过程中，所选载体应不和底物、产物或反应液发生化学反应。
（6 ）固定化酶的成本适中。
工业生产必须要考虑到固定化成本，要求固定化酶应是廉价的，以利于工业使用。
3.酶的固定化方法3.1吸附法吸附法（adsorption ）是通过载体表面和酶分子表面间的次级键相互作用而达到固定目的的方法，是固定化中最简单的方法。
酶与载体之间的亲和力是范德华力、疏水相互作用、离子键和氢键等。
吸附法又可分为物理吸附法和离子吸附法。
3.1.1物理吸附法物理吸附法(physical adsorption) 是通过物理方法将酶直接吸附在水不溶性载体表面上而使酶固定化的方法。
是制备固定化酶最早采用的方法，如α- 淀粉酶、糖化酶、葡萄糖氧化酶等都曾采用过此法进行固定化。
（1）无机载体常见的有活性炭、氧化铝、皂土、多孔玻璃、硅胶、二氧化钛、羟基磷灰石等。
（2）有机载体常见的有纤维素、胶原、赛珞玢、陶瓷、淀粉及面筋等。
物理吸附法制备固定化酶，操作简单、价廉、条件温和，载体可反复使用，酶与载体结合后，酶活性中心不易被破坏切酶高级结构变化少，故所制得的固定化酶活力较高。
但由于靠物理吸附作用，酶和载体结合不牢固，在使用过程中容易脱落，所以使用受到限制。
3.1.2离子交换吸附法离子吸附法(ion adsorption) 是将酶与含有离子交换基团的水不溶性载体以静电作用力相结合的固定化方法，即通过离子键使酶与载体相结合的固定化方法。
离子吸附法所使用的载体是某些离子交换剂。
常用的阴离子交换剂有DEAE- 纤维素、混合胺类(ECTEOLA)- 纤维素、四乙氨基乙基(TEAE)- 纤维素、DEAE- 葡聚糖凝胶、Amberlite IRA-93 、410 、900 等；阳离子交换剂有羧甲基(CM)- 纤维素、纤维素柠檬酸盐、Amberlite CG-50 、IRC-50 、IR-200 、Dowex-50 等。
离子吸附法具有操作简便、条件温和不会引起酶变性或失活。
载体廉价易得，而且可反复使用。
此外，吸附过程同时可以纯化酶。
但是由于依靠吸附法固定的酶与载体相互作用力弱、酶容易从载体上脱落下来，进而影响酶的纯度和酶的稳定性。
3.2包埋法包埋法（entrapment ）是将酶包埋在各种多孔载体中使酶固定化的固定化方法。
包埋法操作简单，由于酶分子只被包埋，未受到化学反应，可以制得较高活力的酶，对大多数酶、粗酶制剂甚至完整的微生物细胞都适用。
包埋法根据载体材料和方法不同，可分为凝胶包埋法和微胶囊包埋法。
3.2.1凝胶包埋法也叫网格型包埋法，是指将酶或含酶菌体包埋在凝胶细微网格中，制成一定形状的固定化酶或固定化含霉菌体。
常用的载体有海藻酸钠凝胶、角叉菜胶、明胶、琼脂凝胶、卡拉胶等天然凝胶以及聚丙烯酰胺、聚乙烯醇和光交联树脂等合成凝胶或树脂。
3.2.2微胶囊包埋法把酶包埋在由高分子聚合物制成的小球内，制成固定化酶。
由于形成的酶小球直径一般只有几微米至几百微米，所以也称为微囊化法。
它使酶存在于类似细胞内的环境中，可以防止酶的脱落，防止微囊外的环境直接接触，从而增加了酶的稳定性。
常用于制造微胶囊的材料有聚酰胺、火棉胶、醋酸纤维素等。
（1）界面分离法是利用某些高聚物在水相和有机相的界面上溶解度极低而形成皮膜将酶包埋的方法。
（2）界面聚合法是指利用亲水性单体和疏水性单体在界面发生聚合的原理包埋酶的方法。
（3）表面活性剂乳化液膜包埋法是指在酶的水溶液中添加表面活性剂，使之乳化形成液膜达到包埋目的的一种方法。
3.3共价键结合法酶蛋白分子上与不溶性固相支持物表面上通过离子键结合而使酶固定的方法，叫离子键结合法。
其间形成化学共价键结合的固定化方法叫共价键结合法。
共价键结合法结合力牢固，使用过程中不易发生酶的脱落，稳定性能好。
该法的缺点是载体的活化或固定化操作比较复杂，反应条件也比较强烈，所以往往需要严格控制条件才能获得活力较高的固定化酶。
使载体活化的方法有很多，主要有重氮法、叠氮法、溴化氰法和烷基化法等。
3.3.1重氮法重氮法是将酶蛋白与水不溶性载体的重氮基团通过共价键相连接而固定化的方法，是共价键法中使用最多的一种。
常用的载体有多糖类的芳族氨基衍生物、氨基酸的共聚体和聚丙烯酰胺衍生物等。
3.3.2叠氮法即载体活化生成叠氮化合物，再与酶分子上的相应基团偶联成固定化酶。
含有羟基、羧基、羧甲基等基团的载体都可用此法活化。
如CMC 、CM-sephadex （交联葡聚糖）、聚天冬氨酸、乙烯- 顺丁烯二酸酐共聚物等都可用此法来固定化酶，其中使用最多的是羧甲基纤维素叠氮法。
3.3.3溴化氰法即用溴化氰将含有羟基的载体，如纤维素、葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶等，活化生成亚氨基碳酸酯衍生物，然后再与酶分子上的氨基偶联，制成固定化酶。
任何具有连位羟基的高聚物都可用溴化氰法来活化。
由于该法可在非常缓和的条件下与酶蛋白的氨基发生反应，近年来已成为普遍使用的固定化方法。
尤其是溴化氰活化的琼脂糖已在实验室广泛用于固定化酶以及亲和层析的固定化吸附剂。
3.3.4烷化法和芳基化法以卤素为功能团的载体可与酶蛋白分子上的氨基、巯基、酚基等发生烷基化或芳基化反应而使酶固定化。
此法常用的载体有卤乙酰、三嗪基或卤异丁烯基的衍生物。
3.4交联法交联法（cross-linking ）是使用双功能或多功能试剂使酶分子之间相互交联呈网状结构的固定化方法。
由于酶蛋白的功能团，如氨基、酚基、巯基和咪唑基，参与此反应，所以酶的活性中心构造可能受到影响，而使酶失活明显。
但是尽可能地降低交联剂浓度和缩短反应时间将有利于固定化酶活力的提高。
常用的双功能试剂有戊二醛、己二胺、异氰酸衍生物、双偶氮联苯和N,N′- 乙烯双顺丁烯二酰亚胺等，其中使用最广泛的是戊二醛。
戊二醛和酶蛋白中的游离氨基发生Schiff 反应，形成薛夫碱，从而使酶分子之间相互交联形成固定化酶。
4.固定化酶的性质4.1酶活力固定化酶的活力在多数情况下比天然酶的活力低，其原因可能是：①酶活性中心的重要氨基酸残基与水不溶性载体相结合；②当酶与载体结合时，它的高级结构发生了变化，其构象的改变导致了酶与底物结合能力或催化底物转化能力的改变；③酶被固定化后，虽不失活，但酶与底物间的相互作用受到空间位阻的影响。
也有在个别情况下，酶经固定化后其活力升高，可能是由于固定化后酶的抗抑能力提高使得它反而比游离酶活力高。
4.2固定化酶的稳定性游离酶的一个突出缺点是稳定性差，而固定化酶的稳定性一般都比游离酶提高得多，这对酶的应用是非常有利的。
其稳定性增强主要表现在如下几个方面：（1 ）操作稳定性酶的固定化方法不同，所得的固定化酶的操作稳定性亦有差异。
固定化酶在操作中可以长时间保留活力，一般情况下，半衰期在一个月以上，即有工业应用价值。
（2 ）贮藏稳定性固定化可延长酶的贮藏有效期。
但长期贮藏，活力也不免下降，最好能立即使用。
如果贮藏条件比较好，亦可较长时间保持活力。
例如，固定化胰蛋白酶，在0.0025mol/L 磷酸缓冲液中，于20℃保存数月，活力尚不损失。
（3 ）热稳定性热稳定性对工业应用非常重要。
大多数酶在固定化之后，其热稳定性都有所提高，但也有一些酶的耐热性反而下降。
一般采用吸附法来进行酶的固定化时，有时会导致酶热稳定性的降低。
（4 ）对蛋白酶的稳定性酶经固定化后，其对蛋白酶的抵抗力提高。
这可能是因为蛋白酶是大分子，由于受到空间位阻的影响，不能有效接触固定化酶。
例如，千畑一郎发现，用尼龙或聚脲膜包埋，或用聚丙烯酰胺凝胶包埋的固定化天门冬酰胺酶，对蛋白酶极为稳定，而在同一条件下，游离酶几乎全部失活。
另外固定化后酶对有机试剂和酶抑制剂的耐受性也得到了提高。
（5 ）酸碱稳定性多数固定化酶的酸碱稳定性高于游离酶，稳定pH范围变宽。
极少数酶固定化后稳定性下降，可能是由于固定化过程使酶活性构象的敏感区受到牵连而导致的。