酶的固定化
酶与细胞的固定化
发酵液中含菌体少，有利于产品的分离纯化，提高产品质量等
第五节 固定化酶和固定化细胞的表征
• 缺点：酶与载体相互作用力弱，酶易脱落等 1）引入功能团和间隔臂；
第五节 固定化酶和固定化细胞的表征
酶被物理吸附于不溶性载体的一种固定化方 固定化后酶的哪些主要性质发生了变化?变化的趋势及原因分析.
常见非共价法?常见共价法?
法。 少量的持续不断的配基的脱落;
交联法由于不需要活化基团,所以条件比较温和,酶活的回收率比较高? 活力回收:指固定化后固定化酶(或细胞)所显示的活力占被固定的等当量游离酶(细胞)总活力的百分比. 第五节 固定化酶和固定化细胞的表征
颗粒、线条、薄膜和酶管等形状。颗粒状占 绝大多数，它和线条主要用于工业发酵生产 ，薄膜主要用于酶电极。酶管机械强度较大 ，主要用于工业生产。
固定化酶的优势：
① 极易将固定化酶与底物、产物分开；产物溶 液中没有酶的残留，简化了提纯工艺；
② 可以在较长时间内进行反复分批反应和装柱 连续反应
③ 酶反应过程能够加以严格控制； ④ 较游离酶更适合于多酶反应； ⑤ 在大多数情况下，能够提高酶的稳定性； ⑥ 可以增加产物的收率，提高产物的质量； ⑦ 酶的使用效率提高、成本降低。
在中性pH下优先与a-氨基反应,因此有一定的选择性 缺点：在包埋过程发生的化学反应同样会导致酶的失活。
• 优点：酶活性中心不易被破坏，酶高级结构 二、载体活化程度和固定化配基密度的测定
固定化过程中，酶分子空间构象会有所变化，甚至影响了活性中心的氨基酸；
用此法制备的固定化酶有蛋白酶、脲酶、核糖核酸酶等。
酶的固定化方法
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酶的固定化方法
酶的固定化方法不下百种，归纳起来大致可以分为三类，即载体结合法、交联法和包埋法。
载体结合法是指将酶固定到非水溶性载体上的方法。
根据固定方式的不同，这种方法又可以分为物理吸附法、离子结合法和共价结合法。
物理吸附法是指将酶吸附到固体吸附剂表面的方法，固体吸附剂多为活性碳、多孔玻璃等。
离子结合法是指通过离子键将酶结合到具有离子交换基团的非水溶性载体上的方法，载体有离子交换树脂等。
共价结合法是指酶和载体以共价键的形式结合在一起的方法，这种方法需要酶和载体都具有氨基、羧基或羟基等官能团。
交联法是指通过双功能试剂，将酶和酶联结成网状结构的方法。
交联法使用的交联剂是戊二醛等水溶性化合物。
包埋法是指将酶包裹在多孔的载体中，如将酶包裹在聚丙烯酰胺凝胶等高分子凝胶中，或包裹在硝酸纤维素等半透性高分子膜中。
前者包埋成格子型，后者包埋成微胶囊型。
清华同方教育技术研究院。
酶六章酶的固定化
迄今已有许多酶用离子结合 法固定化，例如1969年最早应用 于工业生产的固定化氨基酰化酶 就是使用多糖类阴离子交换剂 DEAE-葡聚糖凝胶固定化的。
（二）化学结合法
——1 共价结合法 ——2 交联法
共价偶联法
酶分子之间共价交联和与水不溶性载体共价偶联
• 酶分子；（a）酶分子之间用双功能基团的化学交联试剂相
N OH
O
O O CO N
O
P-NH2
O CO NH P
CH2COOH SOCl2
CH2COCl
P-NH2 pH8~9
CH2CONH P
多胺载体
CH2NH2 Cl-CS-Cl
CH2 N C S P-NH2
HO CH2 N C NHP
CH2COOH
MeOH HCl
CH2COOMe NH2NH2
CH2CON3 P-NH2
O OH O CH2CH2 O S OH
O
O OH O CH2CH2 O S OH
O
NH2 N N-P
无机载体
——可采用直接法和涂层法（用 活化的聚合物如白蛋白或葡聚糖 涂层）
O P-NH2
Si (CH2)3NH CH(CH2)3CHO
O
(1)
OHC-(CH2)3CHO
O Si (CH2)3NH CH(CH2)3CH=N-P O
O Si OH H2N(CH2)3Si (OEt)3 O Si OH
制备固定化酶要根据不同情况 （不同酶、不同应用目的和应用环境） 来选择不同的方法，但是无论如何选 择，确定什么样的方法，都要遵循几 个基本原则
原则1
——必须注意维持酶的催化活性 及专一性，保持酶原有的专一性、 高效催化能力和在常温常压下能 起催化反应的特点。
酶的固定化
固定化技术
一、固定化酶的概念
固定化酶是指固定在一定载体上并在一定 的空间范围内进行催化反应的酶。 水溶性酶 水不溶性载体
固定化技术 水不溶性酶 （ 固相酶）
酶的固定化技术和固定化酶
酶 可溶 间歇 固定化
吸附
包埋
间歇
交联
连续
结合
固定化酶与游离酶相比，具有下列优点：
1.极易将固定化酶与底物、产物分开； 2.可以在较长时间内进行反复分批反应和装柱连续反应； 3.在大多数情况下，能够提高酶的稳定性； 4.酶反应过程能够加以严格控制； 5.产物溶液中没有酶的残留，简化了提纯工艺； 6.较游离酶更适合于多酶反应； 7.可以增加产物的收率，提高产物的质量； 8.酶的使用效率提高，成本降低。
吸附法
常用的固体吸附剂：活性炭、氧化铝、 硅藻土、羟基磷灰石等。 优点：操作简便，条件温和，不引起 酶失活，载体廉价，而且可反复使用。 缺点：结合力弱，易解吸附由于靠物 理吸附作用，结合力较弱，酶与载体 结合不牢固而容易脱落，所以使用受 到一定的限制。
吸附法
（1）常用载体
无机物
活性炭、白陶土、 氧化铝、多孔玻璃、 硅胶、碳酸钙凝胶 有机物 高分子化合物 淀粉麸质、大孔树脂、 DEAE纤维素、 DEAE葡聚糖凝胶
共价键结合法
酶与不溶于水的载体以共价键形式结合制备 固定化酶的方法。即，通过化学共价键，把与酶 蛋白活性无关的氨基酸功能基团连接在不溶于水 的载体上。
（1）酶与载体反应的主要功能基团
游离羟基：肽链C－末端的α –羧基，天门冬酰氨酸 ，谷氨酸的β－γ羧基 游离氨基：肽链N－末端的δ －氨基， 赖氨酸ε －氨基 巯基：半胱氨酸 羟基：丝氨酸，苏氨酸 酚基：酪氨酸 咪唑基：组氨酸
酶的固定化
1）酶传感器的原理
酶传感器主要由固定 化酶膜和变换器组成： 固定化酶膜：选择性 地“识别”并催化被 检测物质发生化学反 应 变换器：把催化反应 中底物或产物的变量 转换成电信号，通过 仪表显示出来。
65
（2）酶电极（葡萄糖氧化酶电极） 半透膜 酶胶层
感应电极
1967年Updike等采用 酶的固定化技术，将葡萄 糖氧化酶固定在疏水膜上， 然后再和氧电极结合，组 装成了世界上第一个生物 传感器——葡萄糖氧化酶 电极。
酶分子中可以形成共价键的基团：
氨基、羧基、巯基、羟基、酚基、咪唑基
载体 活泼基团
载体活化的方法
1. 活化
酶辅助蛋白交联法
酶分子之间共价交联和与水不溶性载体共价偶联
32
固定化方法与载体的选择
1.必须注意维持酶的催化活性和专一性 2.酶与载体结合牢固 3.载体的机械强度 4.固定化酶要有最小的空间位阻 5.载体稳定，不可与底物、产物发生反应 6.固定化酶要廉价
3
4
5 6
7
游离酶：
固定化酶：
四、固定化酶的应用
Go 1.在工、农业生产上的应用 Go 2.在医药、治疗上的应用 Go 3.在分析化学中的应用
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1、固定化酶在工农业生产上的应用
产物
酶或细胞
L-氨基酸 果糖浆
氨基酰化酶 葡萄糖异构酶或含该酶菌体
6-APA L-门冬氨酸 L-苹果酸 低乳糖牛奶
原料
乙酰-DL-氨基酸 葡萄糖 青霉素G 反丁烯二酸 反丁烯二酸 牛奶 牛奶 蛋白 桔类果汁 生啤酒 植物油 植物油
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产物
类固醇 L-丙氨酸
D-苯甘氨酸 ATP 核苷酸类味 精 乙醇
啤酒
固定化酶的方法和应用
固定化酶是将酶固定在载体上，形成固定化酶催化系统的过程。
通过固定化，可使酶的活性和稳定性得到提高，并能够重复使用。
常用的固定化酶方法包括吸附法、共价连接法、包埋法和交联法等。
1. 吸附法：利用载体表面与酶相互吸附的原理将酶固定在载体表面。
常用的载体包括硅胶、纤维素、聚丙烯酰胺凝胶等。
2. 共价连接法：通过将酶分子与载体分子之间的化学键共价连接，在载体表面上固定酶。
常用的共价连接剂包括辛二酸二酐、戊二酸二酐等。
3. 包埋法：将酶包裹在聚合物中，在聚合物内部形成微观环境，保护酶免受外界环境的影响。
常用的包埋材料包括明胶、蛋白质和聚乙烯醇等。
4. 交联法：将酶和载体分子之间形成交联结构，将酶牢固地固定在载体表面上。
常用的交联剂包括戊二醛、葡萄糖等。
固定化酶在生物技术、食品工业、医药工业等领域有着广泛的应用。
其中，利用固定化酶在生物技术领域中最为突出。
例如，固定化酶可以应用于产生大量纯度高的特定酶，用于DNA重组、制备抗体和识别特定分子等。
此外，在医药工业中也广泛使用固定化酶，如利用固定化酶制备药物、检测生物标志物等方面。
在食品工业中，固定化酶可用于生产乳制品、果汁、啤酒等食品中。
总之，固定化酶是一种重要的生物技术手段，具有广泛应用前景，可推动生物技术、食品工业、医药工业等领域的发展。
第五章-固定化酶
2．离子结合法 酶通过离子键结合于具有离子交换剂的水不溶 性载体的固定化方法。 • 常用载体：各种阴、阳离子交换剂。 如CM-纤
维素、DEAE-纤维素、DEAE-葡聚糖凝胶等
• 优点：操作简单，酶活性中心不易被破坏和酶
高级结构变化少，酶活力损失很少。
• 缺点：载体和酶的结合力 比较弱，酶易脱落。
3.共价结合法
• 相对活力：固定化酶活力与同量蛋白量
的溶液酶活力的比值
固定化酶活力 相对活力 100% 溶液酶总活力 残留酶活力
四、固定化酶（细胞）的半衰期
• t1/2 ：固定化酶（细胞）的活力下降为最 初活力1/2所经历的连续工作时间；衡量 操作稳定性的指标。
Fig. 2. Kinetic of ROL adsorption on the silica aerogels. The activity was measured using olive oil emulsion as substrate at pH 8.5 and 37 °C.
第五章 固定化酶与固定化细胞
第一节 酶的固定化
一、固定化酶（immobilized enzyme）：是 指在一定空间内呈闭锁状态存在的酶，能 连续进行反应，反应后的酶可以回收重复 使用。
优点：
①极易将固定化酶与底物、产物分开，简 化了提纯工艺，提高酶的使用效率； ②在大多数情况下，能够提高酶的稳定；
(五)固定化酶的米氏常数(Km)变化 • 中性载体：固定化酶的表观Km值上升。
• 载体与底物电荷相同：表观Km值显著 上升； • 载体与底物电荷相反：Km
？
四、影响固定化酶性能的因素
1．构象改变、立体屏蔽
• 构象改变：指固定化过程及酶和载体的 相互作用，引起了酶的活性中心构象发 生改变，从而导致酶活性改变的—种效 应。
第五章酶的固定化
收率 Yield (%)
(fold)
2736.9
13080.2 23314.100
30 10 9
Sepharos
e柱层析 HiTrap19 42218 0.3
Q柱层析
实验 木瓜蛋白酶的固定化
实验原理：
载体：尼龙
固定化方法：共价结合法
Enzyme+N, N-甲叉双丙稀酰胺, 丙稀酰胺
引发剂－－inactiation
2）半透膜包埋法（微囊型）
将酶或含酶细胞包埋在高分子半透膜中的固定化方
法。
界面聚合法
是用化学手段制备微囊的方法。利用亲水性单体和
疏水性单体在油水界面上发生聚合反应形成聚合体
而将酶包裹起来。
（3）结合法
1）共价结合法 ☆ 通过共价键将酶与载体结合的方法。 ① 结合方法
化的方法称为包埋法。
凝胶包埋法（网格型） 包埋法 半透膜包埋法（微囊型）
只适合作用于小分子底物和产物的酶。
1）凝胶包埋法（网格型）
将酶或含酶菌体包埋在高分子凝胶细微网格中，制
成一定形状的固定化酶，称为网格型包埋法。也称
为凝胶包埋法。
首先被采用的网格包埋法是：
固定化胰蛋白酶 木瓜蛋白酶 －淀粉酶
在上述条件下，每10min增加0.001个消光值为 1个酶单位(U)(以下同)。
实验 木瓜蛋白酶的固定化
酶活力测定：
（2）残留酶活力测定：方法同溶液酶活力测定。
（3）固定化酶活力测定：取一块尼龙布固定化酶， 加入2.0mL激活剂，其余步骤与溶液酶测定相同。
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酶的固定化
固定化酶是酶工程的核心，利于实现酶的重复利用及产物与酶的分离。
下面以酶的固定化方法为核心，介绍一些有关固定化技术的研究新进展。
1 吸附法
利用多种固体吸附剂将酶或含酶细胞吸附在其表面上而使酶固定方法。
该方法最显著的优点是操作简便，条件温和，不会引起酶的变异失活，且载体价廉易得，可反复使用。
但酶与载体结合不牢，极易脱落，所以它的使用受到一定的限制。
因此，人们不断尝试使用新的载体来解决这易脱落的问题。
通常，吸附法分为物理吸附法和离子吸附法。
酶被载体吸附而固定的方法称为物理吸附法。
从载体对酶的适应性来看，这个方法效果是好的，酶蛋白的活性中心不易受破坏，酶的高级结构变化也不明显，但其缺点是酶与载体的相互作用较弱，被吸附的酶极易从载体表面上脱落下来，不能获得较高活力的固定化酶。
该方法常用的载体有活性炭、多孔陶瓷、纤维素及其衍生物、甲壳素及其衍生物等。
纵伟、刘艳芳等(2008)以磁性壳聚糖微球作为新型载体，并采用物理吸附法固定化脂肪酶，对影响固定化的各种因素进行考察，确定了最优条件，同时比较了游离酶和固定化酶的pH值和热稳定性。
结果表明，固定化的适宜条件为：加酶量600 U／g，温度5℃，pH 7．0，固定化时问2 h。
固定化酶的pH值和热稳定性都优于游离酶，
固定化酶连续使用5次后，其相对酶活仍为使用前的57.8％，具有较好的操作稳定性。
近年来，随着介孔分子筛制备技术的日臻成熟，人们正在考虑用其担当固定化酶的载体。
与其他材料相比，介孔分子筛规则的孔道、大的比表面积、极强的吸附性能、稳定的结构等特点，使其具有担当固定化酶载体得天独厚的优势。
王炎等(2008)以介孔分子筛MCM一41作为载体，采用物理吸附法对漆酶进行了固定化，考察了时间、pH和给酶量对固定化效果的影响，并对固定化酶的活性及其稳定性进行了研究，讨论了影响固定化过程和固定化酶性质的主要原因。
结果显示，在pH为3.0时，酶和载体比例为62.5 mg／g时吸附12 h固定化效果最好，固定化酶活性回收率为50％。
与游离漆酶相比，MCM一41固定化漆酶的最适反应pH略有升高，最适温度没有变化，其pH稳定性和热稳定性都显著优于游离漆酶。
固定化漆酶具有可重复操作的性质，与底物反应反复操作1O批次后剩余活性为4O％。
将酶与含有离子交换基团的水不溶性载体以静电作用力相结合
的固定化方法。
该方法的处理条件温和，且酶的高级结构和活性中心的氨基酸很少发生变化，因而可以得到较高活性的固定化酶。
采用此法固定的酶有葡萄糖异构酶、糖化酶、淀粉酶、纤维素酶等。
陈姗姗等(2008)以阴离子交换树脂为载体、戊二醛为交联剂，对果胶酶进行固定化分析，探讨了温度、pH值、时间、加酶量、戊二醛浓度、交联温度、交联时问对果胶酶固定化效果的影响，同时对固定化果胶酶的酶学特性进行研究。
研究结果表明，果胶酶的最佳固定化条件为：温
度40℃，pH值5.5，固定化6 h，加酶量为O.75 mL/g，戊二醛体积分数为0.1％，交联温度4℃，交联时间4 h。
在此条件下，固定化果胶酶的酶活回收率可达到80％以上。
酶学特性试验表明，固定化果胶酶最适温度为60℃，最适pH值为4.0，具有较好的操作稳定性。
徐娟等(2008)选择以D380大孔弱碱性丙烯酸系阴离子交换树脂为载体，通过先吸附后交联的方法固定化淀粉酶。
通过实验对影响固定化酶活力回收率的因素的进行了研究，得出较优的固定化条件为：戊二醛浓度0.1％、处理时间45 min、加酶量3 mg／g(蛋白量／载体)、酶液在pH5.8、25℃，固定化处理时间6～10 h的条件下，获得的固定化酶活力可达8O U／g(载体)，并进一步对固定化酶的酶学性质作了初步研究。
2 交联法
交联法是用双功能试剂或多功能试剂进行酶分子之间的交联，使酶分子和双功能试剂或多功能试剂之间形成共价键嘲。
常用的交联剂是戊二醛，但单用戊二醛等试剂交联制备的固定化酶活力较低，因此常将此法与吸附法、包埋法结合使用，可以达到既提高固定化酶的活力。
刘颖、高晗等(2008)利用上述混合方法，将杏仁来源的B一葡萄糖苷酶以吸附法固定在用戊二醛交联的壳聚糖上，并对固定化条件进行优化，得到最佳条件：戊二醛浓度为1．5％，溶液pH5．5，在25℃水浴中振荡吸附4 h，固定化B一葡萄糖苷酶，其活力回收率27.34％。
王伟、杨开伦等(2008)以壳聚糖为载体，戊二醛为交联剂，用吸附交
联法对氨基酰化酶进行了固定化。
研究结果表明，在pH值为6.0，温度30℃的条件下，0.1 g壳聚糖微球与5 mL 1％戊二醛交联后，固定O.8 mg氨基酰化酶的固定化效果最佳。
固定化酶的最适温度和pH值分别为50℃和7.0，而游离酶的最适温度为40℃，最适pH值为7.5，固定化酶在50-70℃都保持了较高的酶活力，热稳定性远高于游离酶，固定化酶的Km值为l1.796×10-2之mol／L，较游离酶有所升高，该固定化酶具有良好的操作稳定性。
3 共价键结合法
共价键结合法是将酶与水不溶性载体以共价键结合的一种方法。
此法研究较为成熟，其优点是酶与载体间连接牢固，即使用高浓度底物或离子强度的溶液进行反应，也不会导致酶和载体的分离，因此具有良好的稳定性及重复使用性。
缺点是反应条件比较苛刻，常常会引起酶蛋白高级结构发生改变，导致酶的活性中心受损。
王宝康(2007)就采用分相法制作了多孔玻璃微珠FXBL载体，用物理吸附法、共价偶联法和重氮法分别固定淀粉酶，比较了它们的固定效果，并选择了共价偶联法作为研究多孔玻璃微珠的制作过程对固定淀粉酶的影响的实验方法。
实验结果显示，580℃分相玻璃优于560℃，分相时间到36 h后，分相对固定化酶活力影响不大，多孔玻璃用0-3 mo儿的KOH 溶液扩孑L 3 h最理想。
当盐酸的浓度为0.3 mol／L时侵蚀成孔，固定化淀粉酶活力达到最大值。
4 包埋法
包埋法是将聚合物的单体与酶溶液混合，再借助于聚合助进剂的
作用进行聚合，酶被包埋在聚合物中以达到固定化。
包埋法一般不需要与酶蛋白的氨基酸残基进行结合反应，很少改变酶的空间构象，酶活回收率较高，因此可以应用于许多酶的固定化。
但是此法只适用于小分子底物和产物的酶催化反应，因为只有小分子反应底物或产物，才可以通过高分子聚合物进行扩散。
于殿字、罗淑年等(2008)就以海藻酸钠、明胶为包埋材料，戊二醛为交联剂固定化磷酯酶。
对固定化条件和部分酶学特性进行了优化和研究，确定了最佳条件：海藻酸钠浓度2％，明胶浓度4％，CaCl2浓度7％，戊二醛0．4％。
固定化酶热稳定性增强，重复使用3次相对酶活力仍保留在70％以上。
肖志方、伍林等(2008)利用海藻酸钠凝胶颗粒固定化葡萄糖氧化酶(GOD)，确定了固定化条件，并考察了温度、pH值、储存时间对固定化酶和游离酶酶活力的影响，测定了酶活回收率。
结果表明，固定化的最优条件为：CaC1：5．0％(质量体积比)，海藻酸钠3．0%(质量体积比) 。
固定化酶的最适催化温度为3l℃、最适pH值为6．3，较游离酶分别提高7℃和0．6，固定化酶的平均酶活回收率为61.69％。
此外，酶的储存稳定性能也有所提高，可重复多次使用。