免疫沉淀技术 ppt课件
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双荧光素酶染色质免疫共沉淀PPT
分析与生物学功能和表型的研究相结合，可以揭示蛋白质在细胞 或生物体中的具体作用，以及其在疾病发生和发展过程中的作用。
双荧光素酶染色质免疫共
05 沉淀实验注意事项与优化 建议
实验注意事项
确保样本质量
在实验前应确保样本质量，避免使用 过期或污染的试剂和材料。
防止交叉污染
THANKS FOR WATCHING
感谢您的观看
DNA序列。
在双荧光素酶染色质免疫共沉淀实验中，染色质免疫共沉淀技术用于分 离与目的蛋白相互作用的DNA序列，以便进一步分析目的蛋白的转录调 控作用。
双荧光素酶染色质免疫共沉淀实验的原理
双荧光素酶染色质免疫共沉淀实验是一种用于研究目 的蛋白对基因转录调控影响的实验方法。
输标02入题
该实验通过将荧光素酶标记的目标蛋白与细胞核提取 物中的DNA结合，然后利用染色质免疫共沉淀技术将 目标蛋白与DNA复合物分离出来。
免疫共沉淀
利用特定的抗体与染色质中的目标蛋白质或DNA片段进行特异性结合，实现目 标分子的富集。
荧光检测与分析
荧光检测
利用荧光检测仪器检测荧光信号，获 取目标分子在染色质中的定位和表达 情况。
结果分析
对荧光信号进行分析，解读实验结果， 并进一步探讨基因表达调控机制。
04 双荧光素酶染色质免疫共 沉淀实验结果分析
01
03
通过比较不同条件或处理下目标蛋白与DNA结合的情 况，可以研究目的蛋白对基因转录的调控作用。
04
在分离出的复合物中，荧光素酶标记的目标蛋白能够 催化荧光素酶底物发出荧光，从而对目标蛋白进行检 测和定量分析。
03 双荧光素酶染色质免疫共 沉淀实验步骤
细胞培养与处理
细胞培养
选择适当的细胞系，在适宜的培 养条件下进行培养，确保细胞生 长旺盛。
双荧光素酶染色质免疫共
05 沉淀实验注意事项与优化 建议
实验注意事项
确保样本质量
在实验前应确保样本质量，避免使用 过期或污染的试剂和材料。
防止交叉污染
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DNA序列。
在双荧光素酶染色质免疫共沉淀实验中，染色质免疫共沉淀技术用于分 离与目的蛋白相互作用的DNA序列，以便进一步分析目的蛋白的转录调 控作用。
双荧光素酶染色质免疫共沉淀实验的原理
双荧光素酶染色质免疫共沉淀实验是一种用于研究目 的蛋白对基因转录调控影响的实验方法。
输标02入题
该实验通过将荧光素酶标记的目标蛋白与细胞核提取 物中的DNA结合，然后利用染色质免疫共沉淀技术将 目标蛋白与DNA复合物分离出来。
免疫共沉淀
利用特定的抗体与染色质中的目标蛋白质或DNA片段进行特异性结合，实现目 标分子的富集。
荧光检测与分析
荧光检测
利用荧光检测仪器检测荧光信号，获 取目标分子在染色质中的定位和表达 情况。
结果分析
对荧光信号进行分析，解读实验结果， 并进一步探讨基因表达调控机制。
04 双荧光素酶染色质免疫共 沉淀实验结果分析
01
03
通过比较不同条件或处理下目标蛋白与DNA结合的情 况，可以研究目的蛋白对基因转录的调控作用。
04
在分离出的复合物中，荧光素酶标记的目标蛋白能够 催化荧光素酶底物发出荧光，从而对目标蛋白进行检 测和定量分析。
03 双荧光素酶染色质免疫共 沉淀实验步骤
细胞培养与处理
细胞培养
选择适当的细胞系，在适宜的培 养条件下进行培养，确保细胞生 长旺盛。
免疫沉淀试验PPT课件
淀现象。
.
3
沉淀反应分两个阶段
第一阶段
第二阶段
抗原抗体特异性结 形成肉眼可见的大的 合，快速但不可见 免疫复合物。
.
4
二、免疫沉淀试验的分类
液体内 沉淀试验
凝胶内 沉淀试验
环状沉淀试验
免疫扩散试验
絮状沉淀试验
免疫电泳技术
免疫浊度测定
.
5
三、 免疫沉淀试验的特点
1. 阶段性 2. 特异性 3. 抗原性质：可溶性 4. 抗体的选择：2价
第六章 免疫沉淀试验
.
1
教学目的
掌握：液相内沉淀试验、凝胶内沉淀试验 原理
熟悉：沉淀反应的特点、免疫电泳技术、 沉淀反应的应用
.
2
第一节 免疫沉淀试验的基本原理
一、基本原理
免疫沉淀反应（immunoprecipitation
reaction）指可溶性抗原与相应抗体在
适当条件下发生特异性结合而出现的沉
电渗方向与样品运动方向不一致： 样品迁移率降低，甚至倒退
.
46
电泳载体： 琼脂 琼脂糖凝胶
常用浓度：0.8%-1.0% 特点:杂质少、接近电中性，常温易凝 固，色泽透明、质地均匀、富有弹性。
.
47
蛋白质的两性解离性质：
--NH2 + H2O
--NH3+ + OH-
--COOH
--COO- +H+
.
75
.
57
（三）免疫电泳
原理：区带电泳＋双向扩散
1、将蛋白质抗原在凝胶中电泳分成肉眼
不可见的若干区带
2、沿电泳方向挖一与之平行的抗体槽，
加入相应抗血清进行双向扩散
《免疫共沉淀》课件
明确实验目的和预期结果，设计合理 的实验方案。
检查所需的仪器设备是否齐全和正常 工作，如离心机、摇床、离心管等。
实验操作流程
抗体与蛋白质样品的结合
将抗体与蛋白质样品混合，确保抗体与目标 蛋白质充分结合。
共沉淀物的分离
通过离心或过滤等方法将共沉淀物与溶液分 离。
清洗非特异性结合
通过洗涤去除未结合的蛋白质和其他杂质。
结果分析方法
统计学分析
采用t检验或方差分析等统计学方法，对实验数据进行处理和分析，以确定共沉淀物之间的相互作用 是否具有统计学显著性。
生物信息学分析
利用在线生物信息学工具对共沉淀物进行功能注释、基因本体论（GO）分类和蛋白质相互作用网络 分析，以深入了解共沉淀物的生物学功能和相互作用关系。
结果解读与讨论
值的实验数据和结论。
未来可以对这些蛋白质复合物的 功能进行深入研究，探讨其在生 物学和医学中的意义和作用机制
。
同时，随着技术的不断进步和应 用领域的拓展，免疫共沉淀技术 还有望在更多领域发挥重要作用
。
未来研究方向与建议
1
进一步优化免疫共沉淀实验条件和方法，提高实 验的特异性和灵敏度，以分离和鉴定更多蛋白质 复合物。
结果解读
根据实验结果，分析共沉淀物的生物学 意义和功能，探讨它们与目标蛋白的相 互作用机制。
VS
结果讨论
结合已有研究，对实验结果进行深入讨论 ，提出可能的生物学模型或假设，为后续 研究提供思路和方向。同时，对实验的局 限性进行说明，并提出改进方向。
05
结论与展望
结论总结
免疫共沉淀技术是研究蛋白质相互作用的经典方法之一，在生物学和医学 研究中具有广泛应用。
பைடு நூலகம்
检查所需的仪器设备是否齐全和正常 工作，如离心机、摇床、离心管等。
实验操作流程
抗体与蛋白质样品的结合
将抗体与蛋白质样品混合，确保抗体与目标 蛋白质充分结合。
共沉淀物的分离
通过离心或过滤等方法将共沉淀物与溶液分 离。
清洗非特异性结合
通过洗涤去除未结合的蛋白质和其他杂质。
结果分析方法
统计学分析
采用t检验或方差分析等统计学方法，对实验数据进行处理和分析，以确定共沉淀物之间的相互作用 是否具有统计学显著性。
生物信息学分析
利用在线生物信息学工具对共沉淀物进行功能注释、基因本体论（GO）分类和蛋白质相互作用网络 分析，以深入了解共沉淀物的生物学功能和相互作用关系。
结果解读与讨论
值的实验数据和结论。
未来可以对这些蛋白质复合物的 功能进行深入研究，探讨其在生 物学和医学中的意义和作用机制
。
同时，随着技术的不断进步和应 用领域的拓展，免疫共沉淀技术 还有望在更多领域发挥重要作用
。
未来研究方向与建议
1
进一步优化免疫共沉淀实验条件和方法，提高实 验的特异性和灵敏度，以分离和鉴定更多蛋白质 复合物。
结果解读
根据实验结果，分析共沉淀物的生物学 意义和功能，探讨它们与目标蛋白的相 互作用机制。
VS
结果讨论
结合已有研究，对实验结果进行深入讨论 ，提出可能的生物学模型或假设，为后续 研究提供思路和方向。同时，对实验的局 限性进行说明，并提出改进方向。
05
结论与展望
结论总结
免疫共沉淀技术是研究蛋白质相互作用的经典方法之一，在生物学和医学 研究中具有广泛应用。
பைடு நூலகம்
双荧光素酶染色质免疫共沉淀PPT课件
确保实验环境清洁，避免 交叉污染。
使用高质量的抗体和试剂， 确保实验结果的可靠性。
对实验结果进行统计分析， 避免主观偏见和误差。
严格控制实验条件，包括 温度、pH值、时间等， 确保实验的一致性和可重 复性。
实验优化建议
优化抗体与染色质的比例，提高特异性 结合的效率。
对实验结果进行多重验证，包括重复实 验和对照实验，以确保结果的可靠性。
技术发展历程
01
初始阶段
荧光素酶报告基因技术的出现和应用，为研究基因转录提供了有力工具。
02
发展阶段
染色质免疫共沉淀技术的不断完善和应用，为研究基因转录调控提供了
更准确的方法。
03
结合阶段
将荧光素酶报告基因技术与染色质免疫共沉淀技术相结合，形成双荧光
素酶染色质免疫共沉淀技术，为研究基因转录调控提供了更高效、准确
荧光素酶活性检测
荧光素酶活性检测方法
可以使用荧光素酶活性检测试剂盒或PCR仪等方法，对荧光素酶标记的DNA片 段进行检测。
结果分析
根据荧光素酶活性检测结果，可以得出目的基因的表达情况，并进行相关的数 据分析。
03
双荧光素酶染色质免疫共沉淀 实验结果分析
荧光素酶活性检测结果解读
荧光素酶活性检测是双荧光素酶染色质免疫共沉淀实验的重要环节，通过检测荧光 素酶的活性，可以评估实验中荧光素酶的表达情况。
详细描述
miRNA是一类非编码RNA，通过与靶基因mRNA结合，在转录后水平调控基因表达。 在案例二中，研究人员利用双荧光素酶染色质免疫共沉淀技术，发现miRNA与靶基 因在转录水平上的相互作用，进一步揭示了miRNA对靶基因的调控机制。
案例三：表观遗传学研究中的应用
总结词
使用高质量的抗体和试剂， 确保实验结果的可靠性。
对实验结果进行统计分析， 避免主观偏见和误差。
严格控制实验条件，包括 温度、pH值、时间等， 确保实验的一致性和可重 复性。
实验优化建议
优化抗体与染色质的比例，提高特异性 结合的效率。
对实验结果进行多重验证，包括重复实 验和对照实验，以确保结果的可靠性。
技术发展历程
01
初始阶段
荧光素酶报告基因技术的出现和应用，为研究基因转录提供了有力工具。
02
发展阶段
染色质免疫共沉淀技术的不断完善和应用，为研究基因转录调控提供了
更准确的方法。
03
结合阶段
将荧光素酶报告基因技术与染色质免疫共沉淀技术相结合，形成双荧光
素酶染色质免疫共沉淀技术，为研究基因转录调控提供了更高效、准确
荧光素酶活性检测
荧光素酶活性检测方法
可以使用荧光素酶活性检测试剂盒或PCR仪等方法，对荧光素酶标记的DNA片 段进行检测。
结果分析
根据荧光素酶活性检测结果，可以得出目的基因的表达情况，并进行相关的数 据分析。
03
双荧光素酶染色质免疫共沉淀 实验结果分析
荧光素酶活性检测结果解读
荧光素酶活性检测是双荧光素酶染色质免疫共沉淀实验的重要环节，通过检测荧光 素酶的活性，可以评估实验中荧光素酶的表达情况。
详细描述
miRNA是一类非编码RNA，通过与靶基因mRNA结合，在转录后水平调控基因表达。 在案例二中，研究人员利用双荧光素酶染色质免疫共沉淀技术，发现miRNA与靶基 因在转录水平上的相互作用，进一步揭示了miRNA对靶基因的调控机制。
案例三：表观遗传学研究中的应用
总结词
沉淀反应(免疫学检验课件)
第十三章
沉淀反应
沉淀反应
(precipitation)
可溶性抗原（细菌培养滤液、细胞或组织的 浸出液、血清蛋白等）与相应抗体在液相中特异 结合后，形成的免疫复合物受电解质影响出现的 沉淀现象。
反应中的抗原称为沉淀原（precipitinogen） 可以是类脂、多糖或蛋白质等；抗体称为沉淀素 （precipitin）。
❖ (3)溶液中的抗原－抗体复合物的数量要足够多。如果 数量太小，溶液浊度变化太小，对光通量影响不大。
❖ (4)透射比浊是依据透射光减弱的原理来定量的，因此 只能测定抗原－抗体反应的第二阶段，检测需抗原－ 抗体温育反应时间，检测时间较长。
❖ (5)检测用的抗体一般应选择亲和力较高的抗体，且在 检测中应保证抗体过量。
退。实际上在电泳的过程中受
负电荷多
－
电泳力 ＞
电渗力
抗体 负电荷少
电泳力 ﹤ 电渗力
+
步骤：
制板
3－4ml琼脂
打孔
孔间距3mm
加样
约7ul
抗体
抗原
电泳
总电流＝4mA x 1cm/板宽 x N(板数） 20—30分钟
三、免疫电泳技术
免疫电泳技术的用途
是散射比浊法的改良。一般在30～120min内比 浊
用于免疫沉淀反应的缺陷
(1)因为是一次性测定光吸收值，没有考虑每一个待测 样本的吸收和散射效果，可测定结果不准确
(2)测定的仍是抗原－抗体反应的第二阶段，不适合快 速检测。
(3) 终点法存在反应本底（空白管），测定样本的含量 越低，本底比例越大，故在微量测定时，本底的干 扰是影响准确测定的重要因素。
（4）若反应时间过长，IC聚合形成沉淀则导致散射值 偏低。故需掌握最适时间比浊。
沉淀反应
沉淀反应
(precipitation)
可溶性抗原（细菌培养滤液、细胞或组织的 浸出液、血清蛋白等）与相应抗体在液相中特异 结合后，形成的免疫复合物受电解质影响出现的 沉淀现象。
反应中的抗原称为沉淀原（precipitinogen） 可以是类脂、多糖或蛋白质等；抗体称为沉淀素 （precipitin）。
❖ (3)溶液中的抗原－抗体复合物的数量要足够多。如果 数量太小，溶液浊度变化太小，对光通量影响不大。
❖ (4)透射比浊是依据透射光减弱的原理来定量的，因此 只能测定抗原－抗体反应的第二阶段，检测需抗原－ 抗体温育反应时间，检测时间较长。
❖ (5)检测用的抗体一般应选择亲和力较高的抗体，且在 检测中应保证抗体过量。
退。实际上在电泳的过程中受
负电荷多
－
电泳力 ＞
电渗力
抗体 负电荷少
电泳力 ﹤ 电渗力
+
步骤：
制板
3－4ml琼脂
打孔
孔间距3mm
加样
约7ul
抗体
抗原
电泳
总电流＝4mA x 1cm/板宽 x N(板数） 20—30分钟
三、免疫电泳技术
免疫电泳技术的用途
是散射比浊法的改良。一般在30～120min内比 浊
用于免疫沉淀反应的缺陷
(1)因为是一次性测定光吸收值，没有考虑每一个待测 样本的吸收和散射效果，可测定结果不准确
(2)测定的仍是抗原－抗体反应的第二阶段，不适合快 速检测。
(3) 终点法存在反应本底（空白管），测定样本的含量 越低，本底比例越大，故在微量测定时，本底的干 扰是影响准确测定的重要因素。
（4）若反应时间过长，IC聚合形成沉淀则导致散射值 偏低。故需掌握最适时间比浊。
ChIP实验课件
质与DNA相互作用的信息。
何谓ChIP实验技术
主要内容
何谓ChIP实验技术 ChIP技术基本步骤及注意事项
ChIP实验技术的应用
ChIP技术的基本步骤
细胞的固定
染色质的断裂
优D基N秀A本的幻分步析灯骤鉴片定
交联反应的逆转及DNA的纯化
染色质免疫沉淀
细胞的固定
染色质结构本身是动态的， 并甲且醛D是N一A与种非高组分蛋辨白率相的互可作逆用的常交是联瞬剂时的。
染色质免疫沉淀
Input 对照 Beads 选择 抗体的选择 阳性与阴性对照
Input 对照
在进行免疫沉淀前，需要取一部分断裂后的染色质做Input对照。 Input是断裂后的基因组DNA，需要与沉淀后的样品DNA一起经 过逆转交联，DNA纯化，以及最后的PCR或其他方法检测。
必不可少的步骤 Input对照可以验证染色质断裂的效果，还可以根据Input中的靶
抗体的选择
不是所有的抗体都能做ChIP实验的， 只有经过ChIP实验验证后的抗体才能确保实验结果的可靠性，
实验成功的关键
因为在蛋白质与染色质交联结合时，抗体的抗原表位可能因为与结合 位点的距离太近，不能被抗体识别，所以不能有效地在体内形成免疫
沉淀复合物，直接影响ChIP的结果。
染色质免疫沉淀
Input 对照 Beads 选择 抗体的选择 阳性与阴性对照
注意事项
在超声波断裂染色质时，要在冰上进行，且要设计时断时续的 超声程序，保证低温。
超声探头要尽量深入管中，但不接触管底或侧壁，以免产生 泡沫。
总超声时间也不要太长，以免蛋白降解。
ChIP技术的基本步骤
细胞的固定
染色质的断裂
优D基N秀A本的幻分步析灯骤鉴片定
何谓ChIP实验技术
主要内容
何谓ChIP实验技术 ChIP技术基本步骤及注意事项
ChIP实验技术的应用
ChIP技术的基本步骤
细胞的固定
染色质的断裂
优D基N秀A本的幻分步析灯骤鉴片定
交联反应的逆转及DNA的纯化
染色质免疫沉淀
细胞的固定
染色质结构本身是动态的， 并甲且醛D是N一A与种非高组分蛋辨白率相的互可作逆用的常交是联瞬剂时的。
染色质免疫沉淀
Input 对照 Beads 选择 抗体的选择 阳性与阴性对照
Input 对照
在进行免疫沉淀前，需要取一部分断裂后的染色质做Input对照。 Input是断裂后的基因组DNA，需要与沉淀后的样品DNA一起经 过逆转交联，DNA纯化，以及最后的PCR或其他方法检测。
必不可少的步骤 Input对照可以验证染色质断裂的效果，还可以根据Input中的靶
抗体的选择
不是所有的抗体都能做ChIP实验的， 只有经过ChIP实验验证后的抗体才能确保实验结果的可靠性，
实验成功的关键
因为在蛋白质与染色质交联结合时，抗体的抗原表位可能因为与结合 位点的距离太近，不能被抗体识别，所以不能有效地在体内形成免疫
沉淀复合物，直接影响ChIP的结果。
染色质免疫沉淀
Input 对照 Beads 选择 抗体的选择 阳性与阴性对照
注意事项
在超声波断裂染色质时，要在冰上进行，且要设计时断时续的 超声程序，保证低温。
超声探头要尽量深入管中，但不接触管底或侧壁，以免产生 泡沫。
总超声时间也不要太长，以免蛋白降解。
ChIP技术的基本步骤
细胞的固定
染色质的断裂
优D基N秀A本的幻分步析灯骤鉴片定
免疫沉淀实验课件
第39题 解析：参考答案：C [解析] “天下虽安，忘战必危”体现的是矛盾双方在一定条件下可以相互转化的辩证法思想， 因此要居安思危。“贾人旱则资舟，水则资车，以待乏也”意思是商人旱天购买舟船， 涝天购买车辆，等待货有所缺。与题干中的意思相似，体现未雨绸缪、居安思危的逆 向思维。本题答案选C。
第40题 解析：参考答案：D [解析] 植物蛋白的消化、吸收要比动物蛋白差。动物蛋白和人类的营养结构比较吻合，其蛋 白质的种类和结构更加接近人体的蛋白结构和数量，而且一般都含有人体必需的8种氨 基酸。故本题选D。
实验一 免疫沉淀类反应
1
l 免疫沉淀反应：可溶性抗原与相应抗体在 溶液或凝胶中接触形成肉眼可见的抗原抗 体复合物沉淀称为免疫沉淀反应。
2
对流免疫电泳
环状沉淀反应
沉
电
淀 反
琼脂扩散试验
单向扩散试验 双向扩散试验
泳
＋
技 术
应
絮状沉淀反应
火箭免疫电泳
3
一、双向免疫扩散试验
实验原理
l 指可溶性抗原与相应抗体在琼脂介质中相互扩散， 彼此相遇，在浓度比例适当处形成沉淀线。
12
13
试剂和器材
l 抗原：人全血清 l 抗体：兔抗人全血清 l 1％琼脂：0.05mol/L pH8.6的巴比妥缓冲液
配制 l 电泳槽、电泳仪、 l 载玻片、水浴箱、打孔器、微量加样器
14
实验步骤
l 制板 取已经融化的1%琼脂约4ml，加到 水平放置的载玻片上，使成厚度约为 1.5mm的琼脂板，待冷凝。
l 打孔 打梅花孔（如图），各孔间的距离为4-5mm。
1
7
l 倍比稀释抗体 （见下表） l 加样 用微量加样器分别取抗原、抗体10ul加入各
第40题 解析：参考答案：D [解析] 植物蛋白的消化、吸收要比动物蛋白差。动物蛋白和人类的营养结构比较吻合，其蛋 白质的种类和结构更加接近人体的蛋白结构和数量，而且一般都含有人体必需的8种氨 基酸。故本题选D。
实验一 免疫沉淀类反应
1
l 免疫沉淀反应：可溶性抗原与相应抗体在 溶液或凝胶中接触形成肉眼可见的抗原抗 体复合物沉淀称为免疫沉淀反应。
2
对流免疫电泳
环状沉淀反应
沉
电
淀 反
琼脂扩散试验
单向扩散试验 双向扩散试验
泳
＋
技 术
应
絮状沉淀反应
火箭免疫电泳
3
一、双向免疫扩散试验
实验原理
l 指可溶性抗原与相应抗体在琼脂介质中相互扩散， 彼此相遇，在浓度比例适当处形成沉淀线。
12
13
试剂和器材
l 抗原：人全血清 l 抗体：兔抗人全血清 l 1％琼脂：0.05mol/L pH8.6的巴比妥缓冲液
配制 l 电泳槽、电泳仪、 l 载玻片、水浴箱、打孔器、微量加样器
14
实验步骤
l 制板 取已经融化的1%琼脂约4ml，加到 水平放置的载玻片上，使成厚度约为 1.5mm的琼脂板，待冷凝。
l 打孔 打梅花孔（如图），各孔间的距离为4-5mm。
1
7
l 倍比稀释抗体 （见下表） l 加样 用微量加样器分别取抗原、抗体10ul加入各
免疫共沉淀原理和注意事项培训ppt课件
免疫共沉淀原理和注意事项
8
三 实验流程
提取细胞总蛋白
↓
↓
离心，上清电泳(抗原抗体)
准备PA珠子， PBS洗3遍
↓
PA珠子加入蛋白裂解液 (去除非特异性蛋白背景)
↓
离心去PA珠子，取上清
↓
测蛋白浓度 (BCA法)
↓
加一抗反应(4℃过夜)
↓
加PA珠子捕捉复合物 (室温1h或4℃过夜)
↓
离心，收集沉淀，预冷RIPA Buffer洗3遍
2. RIPA裂解液中蛋白样品含有较高浓度的去垢剂，不能用 Bradford法但可用BCA法或改良Lowry法测定蛋白浓度
免疫共沉淀原理和注意事项
16
裂解液成分
国内博士：
细胞裂解液： 50mM Tris-HC (lpH7.5)，
150 mM NaCl, 0.5%NP-40,
1mM EDTA 使用前加入PMSF至终浓度1mM、 proteinase inhibitor cocktail (混合物)。
ECL 试剂 +
一抗
一抗
二 抗 ( 辣 根 酶 标 记 的 羊 抗 兔 IgG)
一抗(兔抗Actin)
曝光后的蛋白条带
含有转印蛋白的PVDF膜
转印膜上蛋白检测示意图
免疫共沉淀原理和注意事项
X光片曝光显影
ECL
12
CO-IP与质谱分析流程
免疫共沉淀原理和注意事项
13
三 实验的关键
v 1. 实验最需要注意点就是抗体的性质。特别是多抗的特异性是问题。 v 2. 为防止蛋白的分解、修饰，溶解抗原的缓冲液必须加蛋白酶抑制
剂，低温下进行实验。
v 3. 考虑抗体/缓冲液的比例。抗体过少就不能检出抗原，过多则就不 能沉降在beads上，残存在上清。缓冲剂太少则不能溶解抗原，过多 则抗原被稀释。
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环状沉淀试验 （ring precipitation test）
Ascoli于 1902年建立
用于检查兽类 内脏、毛皮浸 液等标本中的 炭疽杆菌抗原
免疫比浊法 （immunoturbidimetry）
优点：校正曲线稳定，简便快 速，易于自动化，无放射性核 素污染 缺点：特异性、灵敏度稍差
免疫比浊法的分类
（common antigenic determinant）
3. 决定簇相似
共同抗原的类型
1. 同种抗原 2. 嗜异性抗原（又称Forssman抗原）
抗原抗体反应的最适比例
抗原抗体反应的阶段性
1. 抗原抗体结合阶段 2. 抗原抗体反应阶段
抗原抗体反应的影响因素
1．中性盐的作用 2．pH 3．温度 4．离子强度
免疫沉淀技术
免疫沉淀技术
一. 免疫沉淀反应定义 二. 免疫化学基础 三. 免疫沉淀技术分类 四. 免疫沉淀技术的应用
免疫沉淀技术
一. 免疫沉淀反应定义 二. 免疫化学基础 三. 免疫沉淀技术分类 四. 免疫沉淀技术的应用
免疫沉淀反应
可溶性抗原与相应抗体在液相或凝胶中特异 性结合后，形成的免疫复合物在一定条件下出现 的蛋白质析出现象。
关键因素
1. 抗原的丰度 2. 抗体的结合能力 3. 蛋白和抗体的可接触性
应用范围
免疫共沉淀技术
（Co-Immunoprecipitation assay）
结果分析
Nat Immunol. 2008 Apr;9(4):369-77.
GST PULL DOWN
结果分析
PNAS February 26, 2008 vol. 105 no. 8 2836-2841
沉淀线特点
1. 形成沉淀线的特异性抗原抗体无法通过沉 淀线，只能在沉淀线周围形成沉淀
2. 与沉淀线无关的抗原和抗体分子则可以自 由通过
3. 沉淀线的位置与抗原抗体的浓度和迁移率 有直接关系
单相免疫扩散试验 （single immunodiffusion）
Mol Cancer Ther June 2010 vol. 9 no. 6 1764-1774
RNA免疫沉淀
在生理状态下对结合在RNA上的蛋白质 进行免疫沉淀，然后通过基因芯片或者其它 手段检测目的RNA的含量。
应用范围
1. 研究蛋白与DNA的动态作用
2. 研究组蛋白的各种共价修饰与基因表达之 间的关系
应用范围
1. 寻找新的相互作用蛋白 2. 验证目的蛋白和待测蛋白是否有相互作用
免疫共沉淀的局限性
（1）难以检测低亲和力和短暂的相互作用 （2）不能够确切分辨第三种蛋白的桥联作用 （3）灵敏度不如亲和色谱高 （4）需对未知蛋白的相关信息有一定了解
基因转录调控
染色质免疫共沉淀
染色质免疫共沉淀
结果分析
沉淀反应的种类
1．溶液中沉淀反应 2．凝胶中沉淀反应
溶液中沉淀反应
是指在清彻透明的液体中，呈溶解状态的 抗原与抗体在试管内或凹玻片上混匀，可凝 聚成为肉眼可见的絮状或颗粒状的不溶性沉 淀物。
絮状沉淀试验
康氏反应（Kahn‘s test）: 心肌提取的类脂质抗原+反应素（Aegagin） 敏感性高，特异性差，易出现假阳性。(1991年首批淘汰)
中性盐的作用
加入高浓度盐（如硫酸铵）以脱水，或 者用分子量大约6000，浓度3～4%聚乙二醇 （PEG6000），以其多聚物孔隙排阻脱水来 大大降低抗原抗体复合物的溶解度。
pH值
尽可能调节pH至复合物的等电点附近， 通常此pH值是介于IgG等电点（约pH=7） 和抗原等电点之间，也依赖于抗原与抗体的 比例。
（1）透射比浊法（transmission turbidimetry） （2）散射比浊法（nephelometry） （3）免疫胶乳浊度测定法（immunolatex
turbidimetry）
（4）速率抑制免疫比浊法（rate inhibition
immunoturbidimetry）
免疫沉淀技术 （Immunoprecipitation assay）
抗原的价
抗体的价
IgG、IgA、IgD和IgE类抗体： 两价 分泌型IgA：四价 IgM类抗体：十价
亲和力和亲合力affin源自tyavidity抗原抗体反应的特异性
特异性的物质基础 epitope
交叉反应
交叉反应的物质基础
1. 抗原异质性
（antigen heterogeneity）
2. 共同抗原决定簇
3. 研究蛋白与RNA的相互作用
免疫沉淀中抗体的选择
免疫共沉淀技术的应用
凝胶中沉淀反应
以一定浓度（1～2%）的琼脂（或琼脂 糖）凝胶作为介质，将抗原、抗体溶液分别 放在琼脂凝胶板上并使它们彼此在凝胶中自 由扩散，形成浓度梯度，当抗原与抗体相遇 且比例适当时，在相应位置即可出现可见的 沉淀环或沉淀线。
与凝集反应、中和反应、补体参与的抗原抗 体反应并称经典免疫学技术
免疫沉淀技术
一. 免疫沉淀反应定义 二. 免疫化学基础 三. 免疫沉淀技术分类 四. 免疫沉淀技术的应用
沉淀反应原理
沉淀原 （precipitinogen）
沉淀素 （precipitin）
抗原抗体间的力
沉淀的发生
1. 疏水性的改变 2. 电荷的改变 3. 分子量及结构的改变
温度
温度与抗原抗体反应有密切的关系 温度升高可促使分子运动加快，抗原与
抗体碰撞机会多，容易结合，但也容易再解 离;
温度低，分子运动慢，撞击机会少，但 一旦结合后则不易再分开。
离子强度
（1）有利于抗原抗体结合的条件： 中等或较低离子强度
（2）有利于抗原抗体解离的条件： 高离子强度
免疫沉淀技术
一. 免疫沉淀反应定义 二. 免疫化学基础 三. 免疫沉淀技术分类 四. 免疫沉淀技术的应用
性病研究实验室法(venereal disease research laboratory ，VDRL) 心拟脂及卵磷酯+反应素（Aegagin）
不需加热的血清反应素试验(unheated serum reagin) 心拟脂及卵磷酯+氯化胆碱+反应素（Aegagin）
反应最适比测定
（1）抗原稀释法（Dean-Webb法） （2）抗体稀释法（Ramon法） （3）方阵法或棋盘格滴定法（checkerboard titration）