膜片钳原理PPT课件

.
12
全细胞模式中，电极内液与细胞内液扩 散混合会改变胞内液成分而影响细胞的电变 化，还使得全细胞记录经常发生run down现 象。用穿孔膜片钳法（perforated patch）做 成全细胞模式记录即即可避免此情况，即把 制 霉 菌 素 （ nystatin ） 和 二 性 霉 素 （amphotericns）充灌到微电极中，与细胞膜 的类固醇作用后，形成只允许一价离子通过 而较大颗粒成分不能通过的小孔，这些小孔 为导电性孔道，不会影响所记录的电流。相 比之下制霉菌素效果较好。
.
1
前言
一般认为，电生理学研究起于1791年，基本上随 电学仪器的进步而发展的，主要经历了微电极技术、 电压钳技术和膜片钳技术。微电极技术由来以久，在 此基础之上发展起来 的电压钳技术为阐明细胞兴奋 性的生理机制作出了巨大贡献。在电压钳的基础上， 1976年德国马普所的E.Neher和B.Sakman在电压钳的基 础上建立了膜片钳技术（patch clamp recording technique)，并首次报道了用膜片钳技术记录到的细胞 膜离子通道电流， 但是实验记录的背景噪声仍然很大。
膜片钳技术包括细胞的分离和膜处理技术，膜片钳放 大器等试验仪器的安装和调试，微电极的制作，数据 的采集和处理技术等。
.
4
膜片钳实验的构成
膜片钳实验仪器设备主要有放大器、微 型操纵器（微超）、倒置显微镜、防震台、 屏蔽笼、灌流槽和数据采集和处理设（计算 机 ） 。 其 中 膜 片 钳 放 大 器 （ amplifier ） 、 微 型操纵器（微操micromanipulator）、倒置显 微镜(inverted microscope)是膜片钳实验区别 于一般电生理实验所需要的仪器。
.
7
合格的微电极是成功封接细胞膜的基本条件
膜片钳实验要成功的封接，一是设法造成 干净的细胞表面，二是制成合格的电极。电极 采用两步拉制工艺。电极的充灌是利用毛细管 由尖端通过虹吸作用吸入溶液，再用注射器连 接的微细塑料管，由电极粗端插入电极尖端作 反向充灌，避免有气泡留在电极尖端。每一种 标本的制备方法各不相同，在此不详细介绍。
.
8
膜片钳的四种工作模式
1.细胞贴附式（cell-attached） 2.全细胞模式（whole -cell recording） 3.内面向外式（inside-out） 4.外面向外式（outside-out）
.
9
.
10
以全细胞模式为例对膜片钳作一简要介绍
在倒置显微镜下，使微电极逐渐靠近细胞，在微 电极接触细胞的同时给与微电极一个小的负压，形成 当吉欧封接，再向微电极管内加入一个小的负压，使 电极覆盖下的细胞膜破裂（rupture），形成电极内液 和胞内液相通，但与浴池内的溶液绝缘，形成全细胞 模式。全细胞模式是记录全细胞面积的而不是小片膜 的离子电流，虽然电极内的膜片被吸破，但微电极与 细胞的封接阻抗很高（100兆欧），这是保持全细胞 记录的重要条件。
.
5
膜片钳的放大器
膜片钳放大器是膜片钳技术的核心仪器，放大器主 要有差分放大器、频率提升部分、加法器、瞬时补偿和 钳位放大器等部件组成。放大器的核心部分是差分放大 器，此差分放大器是一电流-电压转换器，可将记录到的 电流以电位差的形式输出。到目前为止放大器的发展已 经经历了三代的发展过程。目前普遍应用的膜片钳放大 器有德国HEKA公司的EPC系列(最新的产品是EPC-9)和 美国Axon公司生产的Axon Patch 系列(最新产品是Axon200B)，日本NIHONKOHDEN公司的CEZ系列。国产放 大器有华中理共大学的PC-Ⅰ和 PC-Ⅱ系列(最新的产品 是PC-ⅡB)，上海生理所的IP-Ⅰ型等。
.
11
电极内液可更换为药物或毒素等非生理 性成分，研究药物对电压依赖性通道的影响， 从而对通道开关动力学的作用达到从微观水 平上研究药物作用的功能机制。也可任意改 变膜片内外液的浓度组分，研究各组分对膜 通 透 性 的 影 响 ， 值 得 注 意 的 是 H+ 、 Ca2+ 浓 度要适宜。也可用相应的激动剂作用于膜受 体，在监测离子通道电流流动过程中，了解 经G蛋白介导的第二信使作用，研究跨膜信 息转导的途径。
.
13
膜片钳实验中几个常用术语
吉欧封接（gigant seal） 指玻璃微电极与细胞 表面接触紧密，在电学上与细胞膜的其它部分相 分离。
破膜（rupture） 是指达到吉欧封接后，再 施加一个小的负压，使细胞膜破裂，从而形成全 细胞模式。
run-down 在全细胞模式中破膜后，细胞 浆在负压的作用下进入微电极中，细胞很快就萎 缩。正常情况下，全细胞模式可以维持１个小时 左右。
.
6
因为膜片钳实验所用的标本多为急性分离 的细胞或是培养的细胞，故需要倒置显微镜放 置标本。目前性能最好的倒置显微镜是德国产 的Zeiss显微镜。
在膜片钳实验中，微操起着十分重要的作 用，微操的性能的优劣主要体现在稳定性上。 现在使用的微操主要有机械操纵性、三维液压 操纵性、压电操纵性３种，其中以压电微超的 稳定性最佳。其它相关设备在此不一一介术是用微管电极接触细胞膜，以千兆欧 姆（gigaohm seal GΩ）以上的阻抗使之封接，使于电 极尖开口处相接的细胞膜的小区域（膜片patch）与其 周围在电学学上分隔，在此基础上固定电位，对此膜 片上的离子通道的离子电流（pA级最小可达0.06pA） 进行检测记录的方法。
.
2
1980年Neher于在一次实验中偶然的向微电极 内施加一点负压（20-30cmH2O）,封接电阻骤然增 大了两个数量级，达到10-100GΩ，且背景噪声显 著减低，后来将这种电阻大于gigaΩ(109 Ω)的封接 称为giga-seal。1981年，Hamill等在实现giga-seal 的基础上建立了膜片钳记录的4种基本模式，在此 基础上，以后有发展了许多新的记录模式，从而大 大扩展了它的应用领域。Neher 和Sakman 也因此获 得1991年度的诺贝尔医学和生理学奖。当今全世界 每年有1000篇以上采用膜片钳技术的研究论文发表。