超高效液相色谱
超高效液相色谱(Ultra Performance LC )
主讲人：芮雯
ACQUITY UPLC™
超高效液相色谱（Ultra Performance LC™） 是分离科学中的一个全新类别，它借助于 HPLC的理论及原理，涵盖了小颗粒填料、非 常低系统体积及快速检测手段等全新技术，增 加了分析的通量、灵敏度及色谱峰容量。
今天的HPLC
Minutes
恒定柱长时；UPLC™的灵敏度提高1.7倍（170%）！ 恒定L/dp时；UPLC™的灵敏度提高三倍（300%）！
0.050 0.040 0.030 AU
0.020 0.010
0.000 0.050 0.040 0.030
5.0 µm
0.020 0.010 0.000 0.00 0.024 0.020
2 d p
填料颗粒尺寸的演变 70年代早期
40µm薄壳非多孔基质上涂布 100~500 psi 1000塔板数/米 1m长色谱柱
10 min
70年代末期 10µm不规则微多孔填料 1000~2500 psi 25,000塔板数/米 3.9×300mm
10 min
从80年代到现在 3.5~5µm球形微多孔填料 1500~4000 psi 50,000~80,000塔板数/米 3.9×300mm
%
5.22 5.43
15.40 22.61 20.51 2.60 0.62 9.39 11.13 13.75
23.86 33.22 32.78 18.21
44.46 45.79 48.06 43.88 34.96 35.89 42.52 36.99 39.51 52.14
56.48 59.42 61.06 61.54 65.85 53.99
HPLC 3.5µm
超高效液相色谱法
• 理论情况下，配备1.7 μm颗粒的UPLC系 统能产生半峰宽小于1秒的检测峰。这给 UPLC检测带来了挑战。首先，检测器必须 具有较高的采样速率，以在检测峰通过时 捕捉足够的数据点，从而对分析物的检测 峰进行准确而可重现的识别（和积分）
• 检测器必须有最小的扩散体积，以确保分 离效率不降低。检测器的光学部件也必须 具有能体现UPLC灵敏度优势的性能指标。 从概念上讲，对于不同的检测技术，UPLC 检测的灵敏度应是HPLC分离灵敏度的2-3 倍（图5）。例如，质谱检测会极大得益于 UPLC的性能特征,使与UPLC相连的质谱仪 的灵敏度至少提高3倍
• 源于更小颗粒的额外效率可带来更多的明 显益处。更短的色谱柱或更高的流速加快 了速度，同时小颗粒也提高了分辨率。对 于任何给定的分离，都可通过调节这些变 量而达到速度和分辨率的最佳组合
该头发的直径约等于12个5 μm的颗粒，33个1.7 μm的颗粒。
• 图4显示出了目前实验室常用的5 μm颗粒与建议 用于UPLC柱的更小的1.7 μm颗粒的明显差异。 目前，非多孔型1.5 μm颗粒已经上市。虽然这类 颗粒效率较高，但它们的缺点是表面积较小。表 面积小会导致载样量小和保留时间短。为了与 HPLC保持相近的保留时间和载样量，UPLC必须 使用多孔型颗粒。
• 在提到“蛋白组学”或“代谢组学”时，与没有“组” 的差别从分析的角度说就是样品量极大，需要在 短时间分析成千上万的样品。UPLC不损失分离 度的高速度优点在里就能充分体现。多生化样品 及天然产物都十分复杂，
Waters UPLC 超高效液相色谱
超高效液相色谱仪 Nexera UHPLC LC-30A
• UPLC需要一种新颖的耐高压多孔型颗粒。填充 床的均匀性也是至关重要的；特别是当较短的色 谱柱用以保持分辨率的稳定，而同时又要达到加 快分离速度的目标时。另一项要求是色谱柱的内 表面必须足够光滑，以便于填充较小颗粒。应重 新设计色谱柱两端的筛板，使之既能留住小颗粒 又能避免堵塞。
超高效液相色谱仪原理
超高效液相色谱仪原理超高效液相色谱仪（Ultra Performance Liquid Chromatography, UPLC）是一种用于物质分离和分析的先进仪器。
其原理基于液相色谱技术，通过快速高效的液相流动和较小的颗粒尺寸，实现了更高的分离效率和分离速度。
超高效液相色谱仪的关键组成部分包括色谱柱、泵、进样器、检测器和数据处理系统。
色谱柱中填充有具有特定亲和性的固定相，溶液在固定相表面上发生吸附和解吸过程，从而实现了不同组分之间的分离。
泵负责将流动相从溶液瓶中吸取并提供足够的压力，使其通过色谱柱。
进样器负责准确地将待测样品注入色谱柱中，以确保分析的准确性和精确性。
检测器是超高效液相色谱仪的关键部分，常用的检测器包括紫外-可见吸收检测器（UV-Vis）、荧光检测器和质谱检测器等。
检测器根据样品的物化性质，对样品进行监测和检测。
数据处理系统通过采集和处理检测器输出的信号，对样品进行定量和定性分析，并生成相应的色谱图和数据报告。
超高效液相色谱仪相比传统的液相色谱仪具有更高的分离能力和灵敏度。
其原理在于使用非常小的色谱柱和颗粒尺寸，以使样品在色谱柱内的交互作用时间更短，从而实现更高的峰分离度和较低的噪声信号。
此外，超高效液相色谱仪还具有分析速度快、分析精度高、样品量要求低等优点。
总之，超高效液相色谱仪是一种基于液相色谱技术的先进仪器，通过利用快速高效的分离和分析过程，实现了对复杂样品的分离和定量分析。
其原理主要基于色谱柱、泵、进样器、检测器和数据处理系统等关键组成部分。
通过提高色谱柱和颗粒尺寸，超高效液相色谱仪能够实现更高的分离效率和精确度，广泛应用于化学、生物、医药等领域的科学研究和实践中。
超高效液相色谱原理
超高效液相色谱原理
超高效液相色谱（Ultra-High Performance Liquid Chromatography, UHPLC）是一种高效的液相色谱分析技术。
超高效液相色谱的原理是利用特殊的色谱柱和高压泵进行分离，使得液相流动速度更快，分离效率更高。
具体原理如下：
1. 色谱柱选择：UHPLC常用的色谱柱粒径一般为1.8-
2.6 μm，相比传统液相色谱的
3.5-5 μm，更小的粒径可以提高色谱分离效率。
2. 高压泵：UHPLC使用高压泵提供高压力驱动液相流动，一
般工作压力可达到6000 psi或更高。
高压使得液相在色谱柱中
流动更快，加快分离过程。
3. 短柱长：UHPLC一般采用较短的色谱柱（通常为1-5 cm），与传统液相色谱相比，短柱可以减少柱内扩散，使得分离效率更高。
4. 快速检测器：UHPLC通常配备高灵敏度的快速检测器，如
紫外-可见光检测器（UV-VIS），质谱检测器等。
快速检测器
可以实时监测样品的测定信号，加快分析速度。
总的来说，UHPLC通过使用特殊的色谱柱、高压泵和快速检
测器等设备，提高了液相流动速度和分离效果，从而实现超高效的液相色谱分析。
超高效液相色谱仪参数
超高效液相色谱仪参数1、工作环境：1.1环境温度摄氏4-40度.1.2环境湿度20-80%.1.3电压230V（-10%,+8%）2、性能指标2.1四元梯度系统2.1.1流速范围：涵盖所列范围0.000l-5.0000ml∕min,步进以0.000lml∕min为增量2.1.2流量精度：≤0.075%2.1.3溶剂数量：＞42.1.4最高操作压力：＞60MPa2.1.5泵体类型：微体积（柱塞体积≤10μL）双柱塞往复并联泵2.1.6安全机制：高压、低压报警、漏液报警等2.1.7流速准确度:+1.0%2.1.8梯度混合精度：≤0.1%RSD2.1.9溶剂压缩性补偿：可自动,连续进行2.1.10梯度组成范围：0.0-100.0%,0.1%步进2.1.11真空脱气机：N5通道2.1.12物理双泵头：便于维护，独立控制面板：可脱离工作站独立操作2.2样品管理系统2.2.1样品数量:NIoO位L5∕2ml样品瓶2.2.2进样量设定范围:O.lgL~100μL（标准值），可以增加至≥2000uL2.2.3进样方式：全量进样，环路进样2.2.4进样次数：样品1—99次进样2.2.5进样精度：＜0.3%RSD2.2.6进样线性:＞0.9992.2.7样品污染度：≤0.004%2.2.8控温范围：4-40℃2.2.9控温准确度：±ΓC2.3柱温箱2.3.1温度控制类型：强制空气循环，具有液体及气体传感器2.3.2温度控制范围：室温∙10C~85C2.3.3温度准确度：+ΓC2.3.4可放置色谱柱尺寸及数量：≥100mmx6根；30OmmX3根2.3.5色谱柱最小可用1.7μ粒径2.4二极管阵列检测器2.4.1波长范围：190~800nm2.4.2光源：笊灯和鸨灯2.4.3波长准确度：±1nm2.4.4波长精密度：≤0.1nm2.4.5狭缝宽度1.2nm、8nm2.4.6标准池:光程:10mm,池体积:12pL、耐压:12MPa2.4.7web控制：可进行参数设置，日志管理，消耗品管理2.4.8具有智能峰解卷积、智能动态范围扩展功能2.4.9流通池可温控：25~40℃、步进2.4.10UV截止功能：内置UV截止滤光片（开/关可选）2.4.11IPH值范围1~142.5荧光检测器2.5.1波长范围：200~650nm2.5.2光源：岚灯2.5.3光谱带宽：＜20nm2.5.4波长准确度：±2nm2.5.5波长精度：＜0.2nm256灵敏度：水拉曼峰S/N8000或以上（暗背景）2.5.7标准池：体积12μL,最大耐压2Mpa,选配半微量池：体积3μL,最大压力2MPa3、色谱软件3.1软件和仪器主机为同一品牌产品3.2可以双向连接（仪器控制和数据采集）本厂的各种泵和检测器（例如：紫外、示差、二极管阵列、蒸发光散射、荧光、质谱）3.3原厂源代码级全中文版3.4标配数据库3.5多级操作界面：操作者可根据需要，选择不同操作界面，适合初学使用、常规实验分析和专家级分析。
高效液相色谱和超高效液相色谱
高效液相色谱和超高效液相色谱高效液相色谱（HighPerformanceLiquidChromatography，HPLC）和超高效液相色谱（Ultra High Performance Liquid Chromatography，UHPLC），是现代分析化学中常用的分离技术。
它们可以对复杂的混合物进行分离和定量分析，广泛应用于药物分析、食品分析、环境分析、生物分析等领域。
本文将从原理、仪器、方法和应用等方面，介绍高效液相色谱和超高效液相色谱的基本知识。
一、原理高效液相色谱和超高效液相色谱的原理基本相同，都是利用样品在流动相中的分配系数差异，通过固定相和流动相的作用，将混合物中的化合物分离出来。
不同的是，超高效液相色谱采用了更小的颗粒固定相，使得流动相可以更快地通过固定相，从而提高了分离效率和分离速度。
在高效液相色谱和超高效液相色谱中，样品首先被注入流动相中，然后通过固定相的柱子。
固定相通常是一种多孔的固体材料，如硅胶、C18等。
样品中的化合物在流动相中的分配系数不同，因此在通过固定相时，会被分离出来。
分离出来的化合物，会在检测器中被检测到，从而实现分离和定量分析。
二、仪器高效液相色谱和超高效液相色谱的仪器基本相同，主要由注射器、流动相泵、柱子、检测器和计算机控制系统等组成。
（一）注射器注射器是将样品引入流动相中的关键部分。
常用的注射器有手动注射器和自动进样器。
手动注射器通常用于小样品量的分析，而自动进样器可以实现高精度、高效率的样品进样。
（二）流动相泵流动相泵是将流动相送入柱子中的装置。
其主要功能是控制流动相的流速和流量，并确保流动相的稳定性。
常用的流动相泵有恒压流量泵和梯度流量泵。
恒压流量泵可以保持恒定的流量，适用于等浓度的流动相。
梯度流量泵可以实现不同浓度的流动相混合，从而实现更好的分离效果。
（三）柱子柱子是高效液相色谱和超高效液相色谱的核心部分，用于固定相的分离。
常用的柱子材料有硅胶、C18、C8等。
waters超高效液相色谱仪操作步骤
第一部分：仪器准备1. 确保waters超高效液相色谱仪处于正常工作状态，检查仪器是否连接电源，是否有故障指示灯显示。
2. 打开色谱仪软件，检查仪器参数设置是否符合实验要求，包括流速、温度、检测波长等。
3. 准备所需的色谱柱、色谱柱连接器、进样器以及其他实验所需的耗材。
第二部分：样品准备1. 准备实验所需的样品，确保样品已经滤过或者处理过以去除杂质。
2. 根据实验要求，将样品溶解在适当的溶剂中，并进行稀释或者稀释。
第三部分：超高效液相色谱仪操作步骤1. 开始操作前，先进行系统平衡。
具体操作步骤为：将色谱柱连接至色谱柱连接器上，然后连接至色谱仪，用洗脱液平衡色谱柱。
2. 设置色谱仪的操作参数，包括流速、温度、检测波长等。
3. 进行样品进样，具体操作步骤为：将进样器连接至色谱仪，将稀释好的样品注入进样器中，设置好进样量。
4. 开始进行实验，监控色谱图谱的变化，记录实验数据。
5. 实验结束后，对色谱柱和色谱仪进行清洗和维护，确保仪器干净、整洁。
第四部分：数据处理和分析1. 对实验获得的数据进行处理和分析，比对标准曲线，计算样品中所含物质的浓度或者纯度。
2. 对实验结果进行统计分析，进行数据呈现，如绘制色谱图谱、制作数据统计图表等。
3. 通过数据处理和分析，得出实验结论，对实验结果进行解释和讨论。
第五部分：实验安全及注意事项1. 在操作过程中，注意个人安全，避免发生化学品溅泼或者接触有害物质。
2. 操作过程中需严格按照实验要求和操作规程进行，如有疑问请及时向实验指导老师或专业人士请教。
3. 实验结束后，及时清理实验台面和仪器设备，妥善存放试剂和耗材。
通过以上步骤的操作，可以保证在使用waters超高效液相色谱仪进行实验时，能够得到准确、可靠的实验结果，为科研工作和学术研究提供有力支持。
第六部分：精密控制与调试1. 在进行实验操作前，要确保色谱仪的各项参数已经精确调试完毕。
这包括流速、温度、压力、检测波长等参数的精准控制。
液相色谱仪、高效液相色谱仪、超高效液相色谱仪的关系
液相色谱仪、高效液相色谱仪、超高效液相色谱仪的关系液相色谱仪、高效液相色谱仪和超高效液相色谱仪之间的关系如下：
1. 高效液相色谱仪（HPLC）是一种将固相和液相结合运用的液相色谱技术。
其基本原理是将试样通过一根固定相注射器注入高压泵，再通过一定的流路进入色谱柱中，由于流动相对固相有较大的亲和力，所以运行过程中，固相和液相间的交换反应将会发生在色谱柱内，这对分离有很大帮助。
高效液相色谱技术主要应用在生化、制药、食品质量检测和环境检测等领域。
2. 超高效液相色谱仪（UPLC）则是在HPLC技术基础上发展而来的一种新型的液相色谱技术。
它在分离效率、分离速度、峰形对称性、响应灵敏度等方面较HPLC 有很大的提升，能够更快地完成复杂样品的分离和检测。
UPLC在制药、食品质量检测和环境检测等领域也有着广泛的应用。
综上所述，超高效液相色谱仪是液相色谱仪的一种，而高效液相色谱仪又是超高效液相色谱仪的一种特殊形式。
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色谱泵及控制器
数据处理及控制
色谱柱 检测器
Waters 486
进样器
概念
超高效液相色谱技术（ultra performance liquid chcromatography，简称UPLC ）是一种综合了小颗粒填料、 非常低系统体积(死体积)及快 速检测手段等全新的检测技术 。在全面提升HPLC的速度、 灵敏度及分离度的同时，保留 其原有的实用性及原理。
2.2中药药品分析
Waters公司合成了1．7 p．m颗粒度的Acquity UPLC填料， 减少了固定相表面残余硅羟基，因而在分析生物碱类样品时， 流动相中只加入酸抑制剂，不需添加有机胺即可使其获得良 好的分离。由于在流动相中避免了有机胺及盐的加入，可以 在一定程度上降低质谱噪音、减少对质谱的污染，且使用的 流速适合与质谱直接联用，无需分流，可以进一步提高检测 灵敏度，为中药分析提供良好的平台。
1.2食品添加剂分析检测中的应用
随着食品品种和添加剂种类的增加、多种添加剂的复配使用， 迫切需要建立多种添加剂同时快速检测的方法。目前，HPLC 技术是食品添加剂检测的最常用方法；而较这一传统方法而言 ，在技术性能上拥有优势的UPLC 得到了更突出的应用。药物Biblioteka 发领域2.1化学药品分析
在针对药物合成的分析方面，UPLC可实现随时快速准确检 测合成过程中的中间体、副产物或降解产物等。
超高效液
相色谱及 其应用
演讲人：孙硕 ppt制作：宋云龙
材料收集：
任苏瑜 石君
环境科学 班第五组
前言
随着科学技术的进步，对液相色谱技术的要求也不断 提高，单从技术角度的改进已经不行。这就需要同时 从科学与技术的角度出发，或者说从理论高度对液相 色谱重新认识。因此，UPLC（超高效液相色谱）概 念得以提出，将HPLC的极限作为自己的起点。
优点
超高分 离度
基于1．7 m小颗粒技术的UPLC 与人们熟知的高效液相色谱技 术，具有相同的分离原理。不 同的是，UPLC不仅比HPLC具 有更高的分离能力，而且结束 了人们多年不得不在速度和分 度之间取舍的历史。使用UPLC 可以在很宽的线速度、流速和 反压下进行高效的分离工作，
并获得优异的结果。
度保持不变。
图4: UPLC与HPLC：速度比较
图5： UPLC美国药典有关物质分析实例
原有HPLC分析需要4个不同的方法、 三根不同的色谱柱，至少需要65分 钟才能完成；UPLC使用了一根色谱 柱、一种简单方法，在1分钟内即可 完成。
超高灵 敏度
由于待测有机物的浓度越来越低 ，使得灵敏度成为很多分析对象 的关键。
其他 领域
农药残 留检测
水质和 环境监
测
......
化妆品 质量控
制
谢谢 观看
UPLC使用小颗粒技术可以得到 更高的柱效从而改善了分离度、 更窄的色谱宽度，即更高的灵敏 度。
图6: HPLC到UPLCTM：灵敏度的改善无需折衷
方法转 换简便
易与质 谱串联
......
应用
食品安 全领域
1.1农药残留物检测领域
农药残留分析属于微量至超微量分析范畴，要求检测仪器有非 常高的灵敏度；同时，由于其具有种类繁多、结构复杂等特点 ，对检测方法的通量和速度也提出了更高的要求。在农残分析 检测中，UPLC与传统的HPLC 相比较，不仅在分离度、灵敏 度和分析速度上得到较大提高，而且很大程度上减少了样品和 试剂的消耗量，具有很好的应用前景。
构造
原理
范德米特(Van Deemeter)方程
HETP=AdP+B／v+CdP2
HETP：理论塔板高度 A：涡流扩散系数
dP：填料粒径 B：分子径向扩散系数 C：传质因子为流动相线 速度
由该方程可得出结论： 颗粒度越小柱效越高；每个颗粒度尺寸有自己的最
佳柱效的流速；更小的颗粒度使最高柱效点向更高流速 (线速度)方向移动，而且有更宽的线速度范围所以降低颗 粒度不但提高柱效，同时也提高速度。
由右图可见： UPLCTM可以大大 提高分离度，同 时色谱峰强度也 得到了提高。
超高速度
较小的颗粒能提高分 析速度而不降低分离 度；且Van Deemter理 论表明柱长缩短会加 快分离速度，而颗粒 度越小，最佳流速也 越大，进而可以通过 提高流速来进一步加
快分离速度。
新一代UPLC系统用1.7 µm颗粒，柱长可以比 用5 µm颗粒时缩短3倍 而保持柱效不变，而 且使分离在高3倍的流 速下进行，结果使分 离过程快了9倍而分离