基因敲除小鼠的实验流程
基因敲除小鼠（Knockoutmice）制备技术方法
基因敲除小鼠（Knockoutmice）制备技术方法基因敲除小鼠，人们使用复杂的方法使小鼠体内的某一个基因不表达，从而使小鼠呈现这个基因缺失的状态，可用于研究这个基因的功能。
但如果某个基因功能特别重要，这个基因缺失可能具有胚胎致死性，那我们就无法得到这种基因敲除的小鼠了，于是人们发明了条件性基因敲除技术。
这一技术可以实现在特定的时间、特定的细胞或组织内使某个基因沉默。
方法是首先在目的基因（就是打算敲除的那个基因）的两侧分别插入一段名为LoxP的DNA序列（LoxP序列是一段34bp的DNA序列，两端的13个碱基为回文序列，中间的8个碱基决定LoxP的方向。
然后我们需要用到一种带有Cre酶的转基因小鼠了。
Cre重组酶于1981年从P1噬菌体中发现，属于λ Int酶超基因家族。
Cre重组酶基因编码区序列全长1029bp（EMBL数据库登录号X03453），编码38kDa蛋白质。
是一种位点特异性重组酶，能介导两个LoxP位点（序列）之间的特异性重组，使LoxP位点间的基因序列被删除或重组。
LoxP（locus of X-over P1）序列来源于P1噬菌体，是有两个13bp反向重复序列和中间间隔的8bp序列共同组成，8bp的间隔序列同时也确定了LoxP的方向。
Cre 在催化DNA链交换过程中与DNA共价结合，13bp的反向重复序列是Cre酶的结合域。
其序列如下：5' - ATAACTTCGTATA - ATGTATGC - TATACGAAGTTAT - 3'3' - TATTGAAGCATAT - TACATACG - ATATGCTTCAATA - 5'Cre-LoxP系统的特性Cre重组酶介导两个LoxP位点间的重组是一个动态、可逆的过程，可以分成三种情况：1、如果两个LoxP位点位于一条DNA链上，且方向相同，Cre重组酶能有效切除两个LoxP位点间的序列；2、如果两个LoxP位点位于一条DNA链上，但方向相反，Cre重组酶能导致两个LoxP位点间的序列倒位；3、如果两个LoxP位点分别位于两条不同的DNA链或染色体上，Cre酶能介导两条DNA链的交换或染色体易位。
《锌指核酸酶介导的小鼠MSTN基因敲除的研究》范文
《锌指核酸酶介导的小鼠MSTN基因敲除的研究》篇一一、引言基因编辑技术近年来取得了重大突破，其中锌指核酸酶（ZFNs）技术因其高精度和灵活性在基因功能研究、疾病模型构建以及基因治疗等领域得到了广泛应用。
肌肉生长抑制素（Muscle Growth Suppressor，MSTN）基因是调控肌肉生长的关键基因，其敲除能够显著提高动物肌肉生长量。
本研究旨在利用锌指核酸酶技术介导小鼠MSTN基因敲除，以期为肌肉生长相关研究提供新的思路和实验依据。
二、材料与方法1. 材料（1）实验动物：选用健康小鼠作为实验对象。
（2）锌指核酸酶：根据MSTN基因序列设计并构建的ZFNs 系统。
（3）实验试剂与仪器：包括DNA提取试剂、PCR仪、显微镜等。
2. 方法（1）构建锌指核酸酶介导的MSTN基因敲除系统：利用CRISPR/Cas9系统相关原理，设计并构建针对MSTN基因的ZFNs系统。
（2）小鼠基因组DNA提取与ZFNs介导的基因敲除：从小鼠组织中提取基因组DNA，利用ZFNs系统对MSTN基因进行敲除。
（3）敲除效果检测：通过PCR、测序等方法检测MSTN基因敲除效果及对小鼠肌肉生长的影响。
三、实验结果1. ZFNs介导的MSTN基因敲除效率高：通过PCR和测序结果分析，发现ZFNs系统成功介导了MSTN基因的敲除，且敲除效率较高。
2. 敲除MSTN基因对小鼠肌肉生长有显著影响：与对照组相比，MSTN基因敲除后的小鼠肌肉生长量显著增加，表明MSTN 基因在肌肉生长过程中发挥了重要的调控作用。
3. 敲除后小鼠未出现明显的不良反应：通过对小鼠的生长、发育、行为等方面进行观察，未发现明显的不良反应或并发症。
四、讨论本研究利用锌指核酸酶技术成功介导了小鼠MSTN基因的敲除，并证实了MSTN基因在肌肉生长过程中的重要调控作用。
此外，本研究还发现，敲除MSTN基因后的小鼠未出现明显的不良反应，表明该技术具有较高的安全性和可行性。
基因敲除小鼠的实验流程
基因敲除小鼠的实验流程
一、前期准备
1、检索标记基因：采用全基因组测序技术或大规模基因组关联分析法筛选出敲除对研究有重要作用的基因；
2、设计敲除构建：根据筛选出的基因特异性序列，对基因进行深入分析，结合已有研究成果，根据基因的功能和结构确定可有效敲除的基因结构模型；
3、制备修饰质粒：根据设计模型，制备适当的质粒，使其具有足够的重组能力和具有全套的特异性对象；
4、选择载体：选择合适的载体（含有敲除的质粒），使敲除的基因更容易被载入小鼠细胞中进行修饰；
二、基因敲除实验
1、小鼠胚胎动物模型：小鼠胚胎是敲除小鼠研究的传统动物模型，采用小鼠母体体外受精，利用载体质粒将敲除基因引入胚胎，敲除的基因将被遗传给后代小鼠；
2、小鼠嵌合体模型：采用基因修饰技术将敲除基因嵌入小鼠细胞的质粒，多功能的抗体定位蛋白可以用来将质粒载入小鼠细胞，利用抗体定位系统，将修饰的嵌入小鼠胚胎，诱导而成嵌合体，使敲除的基因能够传递给后代；
3、选择敲除后的小鼠：将敲除实验的小鼠孵化。
基因敲除动物操作
选择20-25g的雌性小鼠
供体母鼠的制备
1.第一天上午11:00腹腔注射PMSG（8IU/只）；
2.第三天上午10:30腹腔注射HCG（8IU/只），然后和公鼠合笼交配（1:1）；
3.第四天早上8:00检查阴栓，阴栓阳性的用于收集胚胎，阴性的间歇14天可再次用于超排；
胚胎的获取方法
4.第四天下午2:00收集原核胚胎，用于原核显微注射。处死供体母鼠，将其背部朝上平放，75％酒精消毒背部，打开背部毛发，于背侧肾下找到脂肪包裹的卵巢，剪下输卵管，在解剖镜下用镊子小心撕开输卵管膨大部，可见一卵丘细胞包裹的卵子团溢出。用300ng/ml透明质酸酶消化，待分散后将卵移入M16液滴中清洗5—6次，然后转入石蜡覆盖的M16溶液里，挑选原核大而清晰者直接用于显微注射。若受精卵的原核尚未出现或太小，可置于37℃、5％CO2细胞培养箱中进行体外培养，直至出现大而清晰的原核。注射结束后，立即移植入同步假孕的受体鼠的输卵管内。
结扎公鼠的制备
挑选毛色光亮健壮的公鼠麻醉，将双侧输精管用烧红的眼科镊夹断，使之不具备受精能力。手术后两周将其与经超排处理的母鼠合笼，以性欲旺盛，可使交配过的母鼠见栓而不怀孕的为优质结扎公鼠。
受体母鼠的制备
供体母鼠与正常公鼠合笼的同时，挑选足量的7-8周龄的发情母鼠与结扎公鼠合笼，次日早晨与供体母鼠一起检栓，有精栓者作为当日的受体母鼠。
基因敲除动物操作
小鼠操作过程
6～7周龄时性成熟，性周期为4～5天，发情期持续6-12h，妊娠期为19～21天，每胎产仔6～15只；小鼠的动情期往往开始于晚间，最普遍的是在晚10点到晨1点，偶尔在早晨1～7点，很少在白天。
交配时间的判断
阴道细胞涂片检查有无精子；
成年雌鼠交配后10～12小时阴道口有白色的阴道栓，这是受孕中央滴入60μlM16培养液，上覆无菌石蜡油，置于显微操作仪上，用持卵针吸住受精卵合适的位置，把已吸有基因的注射针迅速刺入受精卵的雄原核中，看到核膜明显膨大，边界清晰时，立即拔出注射针。待所有胚胎注射完毕后，将其移入新鲜的M16培养液中，置于CO2培养箱，放置15-20min后观察胚胎的存活情况。
TALEN-小鼠-基因敲除流程
Step2 构建TALEN打靶载体
通过FastTALETM一步连接法完成TALEN载体的构建
上游引物测序结果比对
下游引物测序结果比对
Step3 细胞水平TALEN活性验证
Day1:小鼠3T3细胞铺板 筛选出一对高活性的 TALEN质粒用于后续实验 Day2：Fugene 共转TALEN 左右臂质粒和EIP质粒 ①PCR产物测序结果 查看套峰
Day3:药物筛选 （puromycin, 1μg/ml）
②PCR产物进行TA克隆 测序，计算突变率
Day6:收集剩余细胞, 抽基因组DNA
PCR靶向序列片段， 扩增出500bp左右
在靶位点上下游设计PCR引物，对打靶后的细胞基因组 DNA进行PCR
PCR-F >200bp TALEN-L >200bp
Step5 胚胎注射mRNA
TALEN左右臂 mRNA按1:1 比例混合
注射至一细胞 期受精卵 细胞质中
37℃培养24h 至二细胞期
移至代孕雌鼠 中，至小鼠 出生（3周）
注射浓度 300-500 ng/ul 注射体积：5-15 pl
Step6 F0代突变体小鼠检测
F0代小鼠剪尾， 抽提基因组DNA T7E1酶切鉴定法： 剪小鼠的尾巴或脚趾 提取基因组DNA PCR靶向基因序列 PCR扩增靶基因位点 PCR产物于94℃失活、50-60℃退火 T7E1酶切鉴定PCR 产物，进行初步筛选
注：图中第一排WT为原始序列，---表示缺失，红色为插入或置换。
Step4 体外转录生成mRNA
TALEN质粒线性化
根据载体所带启动子选择 相应试剂盒进行体外转录
mRNA浓度、纯度检测
原核启动子：sp6或T7 mRNA转录后的大小检测： 若片段大于1.5kb可用琼脂糖凝胶电泳检测；若片段较小，建议用聚 丙烯酰胺凝胶电泳检测。
基因检测小鼠实验报告
实验名称：基因检测小鼠模型建立及功能研究实验目的：1. 建立基因敲除小鼠模型，验证目标基因的功能；2. 探究目标基因在特定生理或病理过程中的作用；3. 为后续相关疾病的研究和治疗提供实验动物模型。
实验时间：2023年3月1日-2023年6月30日实验地点：XX大学动物实验中心实验材料：1. 实验小鼠：C57BL/6小鼠；2. 基因敲除质粒：含有目标基因的敲除质粒；3. 酶切试剂：DNA酶、T4连接酶等；4. 载体细胞：小鼠胚胎干细胞；5. 细胞培养试剂：DMEM培养基、胎牛血清等；6. 实验仪器：PCR仪、凝胶成像系统、显微镜等。
实验方法：1. 基因敲除质粒构建（1）根据目标基因序列设计特异性引物，进行PCR扩增；（2）将扩增得到的DNA片段与载体连接，构建基因敲除质粒；（3）将构建好的质粒进行测序，确保序列正确。
2. 基因敲除小鼠模型建立（1）将基因敲除质粒转染小鼠胚胎干细胞；（2）将转染成功的细胞进行分裂培养，筛选出基因敲除细胞；（3）将基因敲除细胞进行核移植，获得基因敲除小鼠。
3. 功能验证（1）对基因敲除小鼠进行表型分析，观察其生长发育、生理功能等；（2）对基因敲除小鼠进行病理模型建立，观察其病理特征；（3）对基因敲除小鼠进行分子生物学检测，分析目标基因表达水平及蛋白功能。
实验结果：1. 基因敲除质粒构建成功，测序结果显示序列正确。
2. 基因敲除小鼠模型建立成功，经过表型分析，基因敲除小鼠在生长发育、生理功能等方面与野生型小鼠无显著差异。
3. 在病理模型建立过程中，基因敲除小鼠表现出与野生型小鼠相似的病理特征。
4. 分子生物学检测结果显示，基因敲除小鼠目标基因表达水平降低，蛋白功能受到影响。
实验结论：1. 成功构建了基因敲除小鼠模型，为后续相关疾病的研究和治疗提供了实验动物模型；2. 验证了目标基因在特定生理或病理过程中的作用，为进一步研究该基因的功能奠定了基础；3. 本实验结果为相关疾病的发病机制研究提供了参考，有助于寻找新的治疗靶点。
基因敲除基本步骤
基因敲除基本步骤基因敲除基本步骤示意图利用基因打靶技术产生转基因动物的程序一般为：ES细胞的获得现在基因敲除一般应用于鼠，而最常用的鼠的种系是129及其杂合体，因为这类小鼠具有自发突变形成畸胎瘤和畸胎肉瘤的倾向，是基因敲除的理想实验动物。
而其他遗传背景的胚胎干细胞系逐渐被发展应用，最近来自于C57BL/6×CBN/JNCrjF1小鼠的胚胎干细胞系成功地用于基因敲除。
由于这些远交系遗传背景复杂，所得到的模式小鼠往往不能得到重复性好的实验结果，所以也需要在C57BL/6等近交系小鼠上做回交。
另一方面，因为回交次数不一样，也会造成实验结果重复性差。
这对生物科研，尤其是医药企将基因打靶载体通过一定的方式(常用电穿孔法)导入同源的胚胎干细胞(EScell)中，使外源DNA与胚胎干细胞基因组中相应部分发生同源重组，将打靶载体中的DNA序列整合到内源基因组中从而得以表达。
一般地，显微注射命中率较高，但技术难度较大，电穿孔命中率比显微注射低，但便于使用。
用选择性培养基筛选已击中的细胞一般地，筛选使用正、负选择法，比如用G418筛选所有能表达neo基因的细胞，然后用Ganciclovir淘汰所有HSV-TK 正常表达的细胞，剩下的细胞为命中的细胞。
由于用于TK筛选的Gancyclovir对小鼠的种系传递有影响，最近5年来一般采用DTA(白喉毒素A亚基）进行阴性筛选。
将筛选出来的靶细胞导入鼠的囊胚中，再将此囊胚植人假孕母鼠体内，使其发育成嵌合体小鼠。
观察生物学性状的改变通过观察嵌和体小鼠的生物学形状的变化进而了解目的基因变化前后对小鼠的生物学性状的改变，达到研究目的基因的目的。
《锌指核酸酶介导的小鼠MSTN基因敲除的研究》范文
《锌指核酸酶介导的小鼠MSTN基因敲除的研究》篇一一、引言随着基因编辑技术的发展，锌指核酸酶（ZFNs）作为一种精准的基因编辑工具，在基因敲除、基因修复等研究领域得到了广泛应用。
肌腱生长因子（MSTN）是一种重要的负性调节因子，对肌肉发育、细胞生长等方面起着重要的调控作用。
本研究以小鼠为研究对象，采用锌指核酸酶技术，成功敲除了小鼠MSTN基因，并对其进行了深入的研究。
二、材料与方法1. 材料本实验选用C57BL/6小鼠作为实验对象，实验所使用的锌指核酸酶由本实验室构建。
2. 方法（1）构建锌指核酸酶表达载体：根据小鼠MSTN基因序列设计锌指核酸酶，并构建表达载体。
（2）显微注射：将锌指核酸酶表达载体显微注射到小鼠受精卵中，使锌指核酸酶在受精卵中表达。
（3）筛选阳性小鼠：通过PCR等方法筛选出MSTN基因被成功敲除的小鼠。
（4）实验分组与处理：将小鼠分为实验组和对照组，实验组进行MSTN基因敲除处理，对照组不进行处理。
（5）样本采集与检测：分别采集实验组和对照组小鼠的肌肉、血液等样本，进行相关指标的检测和分析。
三、实验结果1. 锌指核酸酶的表达与活性检测通过PCR等方法检测锌指核酸酶的表达情况，结果表明锌指核酸酶表达成功且具有较高的活性。
通过显微注射将锌指核酸酶导入小鼠受精卵中，锌指核酸酶能够在受精卵中高效地结合到MSTN基因上，并引起基因敲除。
2. MSTN基因敲除效率及效果分析通过PCR等方法筛选出MSTN基因被成功敲除的小鼠，结果表明MSTN基因敲除效率较高，且敲除效果稳定可靠。
通过对实验组和对照组小鼠的肌肉、血液等样本进行检测和分析，发现实验组小鼠的肌肉量和肌肉生长速度均显著高于对照组小鼠。
此外，实验组小鼠的体重也明显增加。
3. 敲除MSTN基因对小鼠其他生理指标的影响分析除了肌肉量和体重外，我们还对实验组和对照组小鼠的其他生理指标进行了检测和分析。
结果表明，敲除MSTN基因对小鼠的生长发育、免疫功能等方面没有明显的不良影响。
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获取鼠尾组织
每只小鼠鼠尾加入500ul裂解液和10ul 蛋白酶 K(20mg/ml)，55度水浴过夜，至鼠尾溶解。
提DNA步骤： 1. 每管鼠尾加入300ul饱和NaCl，充分混匀，
12500rpm 离心20min 2. 取上清700ul至新的离心管中，加入预冷的异丙
醇700ul，上下颠倒混匀，动作轻柔，直至看到 絮状DNA析出为止, 12500rpm 离心20min， 弃上清
琼脂糖凝胶电泳
2x Mix 无菌水 2pmol引物1 2pmol引物2 2pmol引物3 模板DNA
10ul 2ul 2ul℃ 30sec 60℃ 30sec 72℃ 30sec 72℃ 5min
35 cycles
三、琼脂糖凝胶电泳
原理： 在pH8.0~8.3的缓冲液中，核酸分子带负电荷，
基本实验流程
琼脂 糖凝 胶电
成像 分析
PCR
泳
提取基 扩增
获取鼠 尾组织
因组 DNA
一、动物基因组DNA的提取
实验原理 真核生物的一切有核细胞（包括培养细胞）都能用来
制备基因组 DNA。真核生物的DNA是以染色体的形式 存在于细胞核内，因此，制备DNA的原则是既要将 DNA与蛋白质、脂类和糖类等分离，又要保持DNA分 子的完整。提取DNA的一般过程是将分散好的组织细胞 在含SDS（十二烷基硫酸钠）和蛋白酶K的溶液中消化 分解蛋白质，再用酚和氯仿/异戊醇抽提分离蛋白质，得 到的DNA溶液经乙醇沉淀使DNA从溶液中析出。
3. 加入800ul 75%乙醇于离心管中，洗沉淀， 12500rpm离心10min
4. 晾干沉淀，加入100ul的PCR级的水。
二、PCR扩增
变变 90变95变
70变75变
cycle
变变
变变 40变60变
25～30 次循环后，模板DNA的含量可以 放大100万倍以上。
动画
PCR:（20ul体系）