基因敲除技术样本
巨噬细胞中基因敲除
巨噬细胞中基因敲除
巨噬细胞中的基因敲除是一种基因编辑技术，用于研究特定基因在巨噬细胞中的功能和作用。
这种技术可以通过使用特定的基因编辑工具，如CRISPR-Cas9系统，来精确地删除或失活巨噬细胞中的某个基因，从而观察这个基因缺失后对巨噬细胞功能的影响。
巨噬细胞是一种重要的免疫细胞，具有吞噬、杀菌、抗原呈递等多种功能。
因此，研究巨噬细胞中特定基因的功能，对于深入了解免疫系统的功能和机制，以及开发新的治疗策略具有重要意义。
在进行巨噬细胞基因敲除实验时，首先需要选择合适的基因编辑工具和实验方法，然后制备巨噬细胞，并将基因编辑工具导入到细胞中。
接下来，通过筛选和鉴定，确定基因编辑是否成功，并观察基因缺失对巨噬细胞功能的影响。
需要注意的是，基因敲除实验具有一定的复杂性和风险性，需要严格遵循实验规范和伦理要求。
同时，由于巨噬细胞在免疫系统中的重要作用，基因敲除实验可能会对机体的免疫功能产生一定的影响，因此需要谨慎评估和控制实验风险。
总之，巨噬细胞中的基因敲除是一种重要的实验手段，可以用于研究特定基因在巨噬细胞中的功能和作用，为深入了解免疫系统的功能和机制提供重要的实验依据。
生物技术本科毕业论文pcr方法在apoe基因敲除小鼠基因型鉴定中的应用
湖北中医药大学本科生毕业论文题目：PCR方法在ApoE基因敲除小鼠基因型鉴定中的应用姓名：学号：专业：生物技术年级：2008级实习单位：武汉大学心血管病研究所指导老师：完成日期：2012 年5 月1 日PCR方法在ApoE基因敲除小鼠基因型鉴定中的应用作者肖明瑶指导者张艳摘要目的为ApoE基因敲除鼠探索快速、简单的基因型PCR检测方法。
方法设计两对引物扩增野生型ApoE基因和ApoE缺陷突变基因的DNA片段，用PCR仪梯度方案测试最佳退火温度，然后用PCR鉴定方案检测小鼠基因型并将所得基因型结果与已经过经典的Southern blot方法检测得到的基因型结果比较。
结果野生型仅在155 bp处有一条条带，突变纯舍子仅在245 bp处有一条条带，杂合子则在155和245bp处出现两条条带。
用PCR方法获得的ApoE基因分析结果与经典的Southern blot方法获得的结果完全一致。
结论用PCR方法分析ApoE基因敲除鼠的基因型具有快速、简单、廉价和适用的特点。
关键词聚合酶链反应基因型基因打靶载脂蛋白EGenotype identification of ApoE Gene Knockout Mice withPolymerase Chain ReactionObjective This study was to explore a simple and quick polymerase chain reaction（PCR）method for genotyping of ApoE knockout mice.Method Two pairs of primers were designed to amplify genomic DNA fragment of wild-type ApoE gene and the same region on ApoE targeting veceor respectively.A gradient PCR strategy was used to test the best annealing temperature. Results A 155bp band was found in wild-type ApoE mice,a 245 bp band in homozygous mutated ApoE mice and both bands in hetemzygous mice.The genotyping results were completely coincided with those from typical Southern blot. Conclusion PCR is a simple,fast and practical method for the genotyping of ApoE gene knockout mice.Key words Poiymerase Chain Reaction genotype gene targeting ApoE载脂蛋白(apolipoprotein，ApoE)是清除乳糜微粒和极低密度脂蛋白的受体的配体，因此，缺乏ApoE则会导致血液循环中富含胆同醇的物质积累而更加容易引起动脉粥样硬化(atl-rosclerosis，AS)病灶形成。
《锌指核酸酶介导的小鼠MSTN基因敲除的研究》范文
《锌指核酸酶介导的小鼠MSTN基因敲除的研究》篇一一、引言基因编辑技术近年来取得了重大突破，其中锌指核酸酶（ZFNs）技术因其高精度和灵活性在基因功能研究、疾病模型构建以及基因治疗等领域得到了广泛应用。
肌肉生长抑制素（Muscle Growth Suppressor，MSTN）基因是调控肌肉生长的关键基因，其敲除能够显著提高动物肌肉生长量。
本研究旨在利用锌指核酸酶技术介导小鼠MSTN基因敲除，以期为肌肉生长相关研究提供新的思路和实验依据。
二、材料与方法1. 材料（1）实验动物：选用健康小鼠作为实验对象。
（2）锌指核酸酶：根据MSTN基因序列设计并构建的ZFNs 系统。
（3）实验试剂与仪器：包括DNA提取试剂、PCR仪、显微镜等。
2. 方法（1）构建锌指核酸酶介导的MSTN基因敲除系统：利用CRISPR/Cas9系统相关原理，设计并构建针对MSTN基因的ZFNs系统。
（2）小鼠基因组DNA提取与ZFNs介导的基因敲除：从小鼠组织中提取基因组DNA，利用ZFNs系统对MSTN基因进行敲除。
（3）敲除效果检测：通过PCR、测序等方法检测MSTN基因敲除效果及对小鼠肌肉生长的影响。
三、实验结果1. ZFNs介导的MSTN基因敲除效率高：通过PCR和测序结果分析，发现ZFNs系统成功介导了MSTN基因的敲除，且敲除效率较高。
2. 敲除MSTN基因对小鼠肌肉生长有显著影响：与对照组相比，MSTN基因敲除后的小鼠肌肉生长量显著增加，表明MSTN 基因在肌肉生长过程中发挥了重要的调控作用。
3. 敲除后小鼠未出现明显的不良反应：通过对小鼠的生长、发育、行为等方面进行观察，未发现明显的不良反应或并发症。
四、讨论本研究利用锌指核酸酶技术成功介导了小鼠MSTN基因的敲除，并证实了MSTN基因在肌肉生长过程中的重要调控作用。
此外，本研究还发现，敲除MSTN基因后的小鼠未出现明显的不良反应，表明该技术具有较高的安全性和可行性。
基因敲除
线虫基因敲除的方法由俄克拉荷马医药研究中心的Bob Barstead 和Gary Moulder 等人创立，并由此衍生和发展。
该方法的理论基础在于：诱导大量线虫发生突变，提取这些突变线虫的DNA，利用巢式PCR 检测突变的位点，最终通过测序确认突变序列，从而建立线虫某一基因突变的种系。
具体步骤如下：
1.诱导大量线虫突变：将怀孕成虫用碱性漂白剂裂解得到卵，在20℃生长52小时，到L4幼虫期时用EMS,DEB,TMP等诱变剂诱导线虫突变，生长24小时得到PO代怀孕成虫，再用漂白剂裂解得到F1代卵，生长24小时得到F1代L1期幼虫，收集线虫，每个琼脂糖平板涂布500只F1代L1期幼虫，共1152个平板，生长5天，收集F2代。
如图2所示
2.提突变线虫DNA：将F2代线虫放入1152个60mm NGM 琼脂糖平板培养，收集25％加入到微滴微阵列中，再加入蛋白酶K，65℃孵育，剩下75％保存在15℃恒温箱中。
收集DNA 样本，准备做PCR。
3.巢式PCR检测：查出需要敲除的目的基因序列片段，设计2对引物AD,BC，第2对引物要在第1对之间。
PCR反应成分：96孔板中加入上步提取的DNA（模板），Buffer，dNTPs,Taq，引物A,D，跑35个循环。
将反应产物作为模板转移到另一块96孔板上，按上述PCR体系再做一次PCR，其中引物换成B,C，跑35个循环。
将PCR产物跑胶，分析。
大意如下图所示，对比MARKER找到与目的片段大小不同的条带，切胶回收，测序，与目的基因比较确认是否是突变序列，确认后找到相应线虫保存，建立基因突变体系。
结缔组织病相关间质性肺病的基因敲除动物模型与疾病机制研究
REPORTING
信号通路研究
利用磷酸化蛋白质组学、转录组学等方法 ，研究相关信号通路（如NF-κB、Smad 等）在疾病发展中的作用。
PART 06
结论与展望
REPORTING
研究成果总结
成功构建基因敲除动物模型
本研究成功构建了结缔组织病相关间质性肺病的基因敲除动物模型，为深入研究该疾病 的发病机制提供了有力工具。
细胞生物学层面研究
细胞凋亡与自噬
研究细胞凋亡和自噬在结缔组织病相关间质性肺病中的变化，探讨 其与疾病进程的关系。
细胞信号传导通路
分析细胞信号传导通路在疾病过程中的变化，寻找关键信号分子和 通路。
细胞因子与趋化因子
研究细胞因子和趋化因子在结缔组织病相关间质性肺病中的表达和作 用，探讨其在炎症和纤维化过程中的作用。
02
目前对CTD-ILD的发病机制仍不完全清楚，缺乏有效的治疗手
段和药物。
因此，建立基因敲除动物模型深入研究CTD-ILD的发病机制和
03
寻找新的治疗策略具有重要意义。
国内外研究现状及发展趋势
国内外已建立多个CTD-ILD的动 物模型，包括小鼠、大鼠和兔等 ，用于研究疾病的发病机制和评 价治疗效果。
疾病机制探讨
纤维化机制分析
检测纤维化相关因子（如TGF-β、CTGF等 ）的表达水平，探讨纤维化形成的机制。
A 炎症机Байду номын сангаас分析
检测炎症相关因子（如TNF-α、IL1β等）的表达水平，分析炎症在疾
病发展中的作用。
B
C
D
药物靶点筛选
结合已有药物数据库和疾病机制研究结果 ，筛选潜在的药物靶点，为药物研发提供 理论支持。
基因敲除的新技术_RNAi
缺点 (表 1) 。哪种是最好的方法 ,取决于实验目的 。 除了方法 3 以外 ,其他方法在制备 siRNA 前都
需要单独设计 siRNA 序列 。关于怎样设计 siRNA 以 及 siRNA 设计对 siRNA 功能的影响 ,尽管不断掌握 了越来越多有关设计原则的信息 ,但仍然不精确 。通 常来说 ,每个目标序列设计 3～4 对 siRNA s ,在后面 的实验中选择最有效的 1 个即可 。网上可提供免费 的 siRNA 设计工具 。
中图分类号 : R457. 4
文献标识码 :A
文章编号 :167324130 (2007) 1121016204
基因敲除是一种反向的遗传学研究方法 ,是八十 年代后发展起来的一种新型的分子生物学技术 ,是通 过一定的途径使机体特定的基因失活或缺失的技术 。 通常意义上的基因敲除主要是应用 DNA 同源重组原 理 ,但此技术较复杂且成功率不高 。随着基因敲除技 术的发展 ,除了同源重组外 ,新的原理和技术也逐渐 被应用 ,比较成功的有基因的插入突变和 RNA 干扰 ( RNA interference , RNAi) ,它们同样可以达到基因 敲除的目的 。其中 RNAi 由于方法简便 ,周期较短 , 因此近几年来越来越多的基因敲除采用了 RNAi 方 法[1～3 ] 。RNAi 是指双链 RNA 诱导同源 mRNA 降解 导致基因表达抑制的现象 ,又称基因沉默. 是一种转 录后 基 因 沉 默 (po st t ranscriptio nal gene silencing , P T GS) 现象 ,是生物体在进化过程中抵御病毒感染及 防御重复序列和突变引起基因组不稳定的保护机制 。
细胞分子遗传学的研究方法
细胞分子遗传学的研究方法细胞分子遗传学是研究细胞遗传物质结构、功能和遗传变异的学科，其研究的基本单位是基因。
在现代分子生物学的蓬勃发展下，细胞分子遗传学得到快速发展，涌现出了许多重要的研究方法。
一、PCR（聚合酶链式反应）PCR是在体外不依赖于生物体的核酸聚合酶酶直接扩增DNA分子的技术，可以快速、准确地获得大量DNA样本，其应用广泛，如疾病诊断、基因工程、遗传治疗等。
PCR的应用非常灵活，可以应用在不同领域的研究中，例如：基因克隆、病毒检测、疾病诊断等。
二、基因敲除技术（CRISPR/Cas9）基因敲除技术是通过将外源DNA序列引入细胞内，利用CRISPR/Cas9酶来切断特定靶点DNA序列，从而实现基因敲除或突变。
该技术可以选择性地切断不同的基因，准确实现对生物表型的调控，不仅可以被应用在基础研究领域，还可在生物工程和医学应用中发挥重要作用。
三、基因转染技术基因转染技术是将外源化学物质引入到细胞内，引起目标基因的表达或抑制，或者使目标细胞发生一些变化。
基因转染技术是DNA递送系统的一种，主要应用于基因工程、疾病治疗、组织再生和干细胞研究等。
常见的转染方式有质粒转染、病毒载体转染、脂质体转染等。
四、全基因组测序技术全基因组测序技术即通过对整个基因组的测序，获得生物体所有基因的完整信息，该技术可以分析出人的基因序列，也可以研究各类动植物的基因。
该技术可以被广泛应用在基础研究、医学领域和农业领域，可以解决许多医疗问题、疾病诊断、新药物研发等。
五、原位杂交技术原位杂交技术是一种对单条DNA或RNA分子进行定位和检测的方法。
该技术可以确定某个DNA区域或RNA的存在、形态和浓度等，同时也可以研究DNA或RNA的组织分布、发生变化的区域和情况，具有足够的灵敏度和特异性。
该技术可以被应用于生态学、演化学、病理学和基因组学的研究等。
六、CAGE-seq技术CAGE-seq技术是全基因组转录测序技术中的一种，可以检测出mRNA序列起始的位置，并测量其相对表达强度。
全基因敲除小鼠基因型鉴定原理及方法
全基因敲除小鼠基因型鉴定原理及方法下载提示：该文档是本店铺精心编制而成的，希望大家下载后，能够帮助大家解决实际问题。
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基因敲除技术
点击次数: 2605 发布日期: -5-25 来源: 本站仅供参考, 谢
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1．概述:
基因敲除是自80年代末以来发展起来的一种新型分子生物学技术, 是经过一定的途径使机体特定的基因失活或缺失的技术。
一般意义上的基因敲除主要是应用DNA同源重组原理, 用设计的同源片段替代靶基因片段, 从而达到基因敲除的
目的。
随着基因敲除技术的发展, 除了同源重组外, 新的原理和技术也逐渐被应用, 比较成功的有基因的插入突变和iRNA, 它们同样能够达到基因敲除的目的。
2．实现基因敲除的多种原理和方法:
2．1．利用基因同源重组进行基因敲除
基因敲除是80年代后半期应用DNA同源重组原理发展起来的。
80年代初, 胚胎干细胞( ES细胞) 分离和体外培养的成功奠定了基因敲除的技术基础。
1985年, 首次证实的哺乳动物细胞中同源重组的存在奠定了基因敲除的理论基础。
到
1987年, Thompsson首次建立了完整的ES细胞基因敲除的小鼠模型[1]。
直到现在, 运用基因同源重组进行基因敲除依然是构建基因敲除动物模型中最普遍的
使用方法。
2.1.1利用同源重组构建基因敲除动物模型的基本步骤(图1):
图1.基因同源重组法敲除靶基因的基本步骤
a．基因载体的构建: 把目的基因和与细胞内靶基因特异片段同源的DNA 分子
都重组到带有标记基因(如neo 基因, TK 基因等)的载体上, 成为重组载体。
基因敲除是为了使某一基因失去其生理功能, 因此一般设计为替换型载体。
b．ES 细胞的获得: 现在基因敲除一般采用是胚胎干细胞, 最常见的是鼠, 而兔, 猪, 鸡等的胚胎干细胞也有使用。
常见的鼠的种系是１２９及其杂合体, 因为这类小鼠具有自发突变形成畸胎瘤和畸胎肉瘤的倾向, 是基因敲除的理想实验动物。
而其它遗传背景的胚胎干细胞系也逐渐被发展应用。
[2, 3]
ｃ．同源重组: 将重组载体经过一定的方式(电穿孔法或显微注射)导入同源的胚胎干细胞(ES cell)中, 使外源DNA与胚胎干细胞基因组中相应部分发生同源重组, 将重组载体中的DNA序列整合到内源基因组中, 从而得以表示。
一般地, 显微注射命中率较高, 但技术难度较大, 电穿孔命中率比显微注射低, 但便于使用。
[4,5]
ｄ．选择筛选已击中的细胞: 由于基因转移的同源重组自然发生率极低, 动物的重组概率为10－2～10-5, 植物的概率为10－4～10－5。
因此如何从众多细胞中筛出真正发生了同源重组的胚胎干细胞非常重要。
当前常见的方法是正负筛选法( PNS法) , 标记基因的特异位点表示法以及PCR法。
其中应用最多的是PNS法。
[6]
ｅ．表型研究: 经过观察嵌和体小鼠的生物学形状的变化进而了解目的基因变化前后对小鼠的生物学形状的改变, 达到研究目的基因的目的。
[2, 3,7]
f．得到纯合体: 由于同源重组常常发生在一对染色体上中一条染色体中,因此如果要得到稳定遗传的纯合体基因敲除模型, 需要进行至少两代遗传。
[8]( 见图2)
图2. 由嵌合体得到基因敲除的纯合体小鼠
2.1.2条件性基因敲除法
条件性基因敲除法可定义为将某个基因的修饰限制于小鼠某些特定类型的细胞或发育的某一特定阶段的一种特殊的基因敲除方法[2]。
它实际上是在常规的基因敲除的基础上, 利用重组酶Cre介导的位点特异性重组技术, 在对小鼠基因修饰的时空范围上设置一个可调控的”按钮”, 从而使对小鼠基因组的修饰的范围和时间处于一种可控状态。
条件性敲除的原理( 图2, 3) :
利用Cre／LoxP 和来自酵母的FLP—frt 系统能够研究特定组织器官或特定细胞中靶基因灭活所导致的表型[7]。
经过常规基因打靶在基因组的靶位点上装上两个同向排列的1oxP, 并以此两侧装接上loxP 的(”loxP floxed”)ES 细胞产生”loxPfloxed”小鼠,然后, 经过将”loxP floxed”小鼠与Cre 转基因鼠杂
交(也能够其它方式向小鼠中引入Cre 重组酶), 产生靶基因发生特定方式(如
特定的组织特异性)修饰的条件性突变小鼠。
在”loxP floxed”小鼠, 虽然靶基因的两侧已各装上了一个loxP, 但靶基因并没有发生其它的变化, 故”1oxP
n oxed”小鼠表型仍同野生型的一样。
但当它与Cre 转基因小鼠杂交时, 产生的子代中将同时带有”loxP floxed”靶基因和Cre 基因。
Cre 基因表示产生的Cre 重组酶就会介导靶基因两侧的1oxP 间发生切除反应, 结果将一个loxP 和靶基因切除。
这样, 靶基因的修饰(切除)是以Cre 的表示为前提的。
Cre 的表示特性决定了靶基因的修饰(切除)持性: 即Cre 在哪一种组织细胞中表示, 靶基因的修饰(切除)就发生在哪种组织细胞; 而Cre 的表示水平将影响靶基因在此种组织细胞中进行修饰的效率。
因此只要控制Cre 的表示特异性和表示水平就可实现对小鼠中靶基因修饰的特异性和程度[9,10]。
图3, 利用Cre／LoxP实现靶基因的切除原理
图4. 条件性基因敲除的基因重组及切除步骤
2.1.2.2 诱导性基因敲除法
诱导性基因敲除也是以Cre/loxp 系统为基础, 但却是利用控制Cre 表示的启动子的活性或所表示的Cre 酶活性具有可诱导的特点, 经过对诱导剂给予时间的控制或利用Cre 基因定位表示系统中载体的宿主细胞特异性和将该表示系统转移到动物体内的过程在时间上的可控性, 从而在1oxP 动物的一定发育阶段和一定组织细胞中实现对特定基因进行遗传修饰之目的的基因敲除技术。
人们能。