基因敲除新技术
同源重组基因敲除原理
同源重组基因敲除原理同源重组基因敲除，也称为转基因技术，是将两个基因上的片段截取到等位基因之外的 DNA 中，再重新组合到同一个基因上的一种技术。
这个过程也被称为基因敲除技术。
这种技术用于将特殊基因编码的蛋白质从生物体中组装起来，从而达到敲除某种特定的基因，或者研究新的突变和表型。
基因敲除技术可以将DNA片段连接在一起，并且可以融合多种中性拷贝来表达新的基因，这对于基因组结构研究非常重要。
基因敲除技术主要可以分为三类：突变型、常用片段融合型及同源重组型敲除技术。
常用片段融合型敲除技术是在目标基因中添加一个特异的连接头，从而使其具有隐藏的模式，抑制其功能。
而同源重组型敲除技术则是将两个基因的片段植入另一个片段的DNA中，使两个片段插入到一起，形成新的突变。
这些突变可以减弱目标基因的功能，从而屏蔽与此有关的特性或表型。
目前，学者们可以使用同源重组型敲除技术来研究特殊基因编码的蛋白质在生物体中的作用以及在病理、发育等过程中的调控机制。
而且，它还可以用来研究新的突变及其相关的表型，从而开展更多的生物学研究。
传统的同源重组方法，如DNA克隆、引物扩增PCR等，可以很好的实现相关的突变的敲除。
然而，随着生物素质技术的进步，细胞核酸和抗原之间的关系更加清晰。
利用CRISPR/Cas9及其衍生技术，可以有效地对基因组或蛋白质结构模糊位点进行控制，从而实现敲除特定染色体上的特殊基因或者研究新的突变及其相关表型。
同源重组基因敲除技术由其可靠性和卓越的灵敏度被广泛应用于许多生物学研究中。
这种技术可以增强基因上的特性，可以用来改变类型的基因的表观遗传性，可以从模式生物中删除特定的基因，从而探索这些缺失基因在生物体中扮演的角色。
它还可以使用在基因工程领域，有助于改变生物体的结构和功能，从而开发高效的药物等。
基因敲除技术的方法
基因敲除技术的方法
基因敲除技术是一种利用CRISPR-Cas9系统对细胞基因进行定向编辑和删除的新技术。
该技术可以帮助研究人员研究基因功能和疾病发生机制，以及开发新的治疗方法。
基因敲除技术的方法主要包括以下几个步骤：
1. 设计sgRNA：首先需要选择待敲除的基因，然后设计合适的sgRNA序列。
sgRNA是一种小RNA分子，能够将Cas9蛋白精确地指向目标基因，并切割该基因的DNA序列。
2. 转染sgRNA和Cas9：将sgRNA和Cas9蛋白导入目标细胞中。
通常采用的方法有脂质体转染、电穿孔转染等。
3. 筛选细胞：利用细胞内的修复机制，CRISPR-Cas9系统会在目标基因处切割DNA序列，并引起细胞的修复。
通过筛选，可以获得已经敲除目标基因的细胞。
4. 鉴定敲除效果：可以采用PCR、Western blot、qPCR等技术检测目标基因是否已被完全删除。
通过基因敲除技术，研究者能够研究目标基因对某种生物功能的影响，以及对疾病发生的贡献。
这一技术被广泛应用于生命科学研究领域，并在基因治疗等领域也具有广阔的应用前景。
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植物功能基因组研究中的基因敲除技术
植物功能基因组研究中的基因敲除技术植物基因敲除技术是近年来植物功能基因组研究中的一项重要技术。
通过该技术可以精准地删去植物基因组中的某个基因，从而研究该基因在植物生长、发育和代谢等方面的功能。
下面我们将详细介绍植物基因敲除技术的原理和应用。
一、植物基因敲除技术的原理植物基因敲除技术是通过基因编辑技术实现的。
目前主要有CRISPR/Cas9和TALEN两种技术用于植物基因编辑。
这两种技术都是利用人工合成的核酸序列，精准地识别和切割目标基因的DNA 序列，从而实现基因敲除。
先来介绍一下CRISPR/Cas9技术。
CRISPR是一种天然存在于细菌中的免疫系统。
通过CRISPR系统，细菌可以识别并摧毁侵入其体内的病毒DNA。
科学家们发现，CRISPR系统中有一种酶叫做Cas9，可以切割DNA序列。
利用人工合成的RNA序列，可以将Cas9定位到需要切割的基因上，并切割掉该基因。
这样就实现了精准的基因敲除。
TALEN技术原理类似于CRISPR/Cas9，也是通过人工合成的核酸序列，精准地识别和切割目标基因的DNA序列。
TALEN技术主要是利用一种叫做TALEN（转录激活样核酸酶）的酶来实现基因敲除。
二、植物基因敲除技术的应用植物基因敲除技术已经成为植物功能基因组研究中的一项重要技术。
它可以用于研究植物生长、发育和代谢等方面的功能。
以下是该技术的一些具体应用：1.研究基因功能植物基因敲除技术可以用于研究基因在植物生长、发育和代谢等方面的功能。
通过敲除某个基因，可以观察其对植物生长、发育和代谢等方面的影响。
这种方法可以帮助科学家们更好地了解植物基因的功能。
2.筛选基因植物基因敲除技术可以用于筛选植物基因。
在研究植物新陈代谢方面，需要筛选大量的植物基因，以了解这些基因在植物代谢中的作用。
植物基因敲除技术可以快速地筛选出与目标代谢过程相关的基因，从而加速研究进程。
3.改良植物品种植物基因敲除技术可以用于改良植物品种。
基因敲除技术的原理和应用
基因敲除技术是一种基因编辑技术，通过这种技术，研究人员可以删除或改变特定的DNA 序列，以研究基因的功能和作用机制。
基因敲除技术的原理：
1. 基因敲除可以通过同源重组的方法实现。
具体来说，研究人员将一个含有同源序列的筛选标记基因插入到待编辑的基因的3'端，然后加入四环素抗性基因的启动子和终止序列，通过筛选标记基因的表达，选择含有同源序列的细胞，再通过同源序列的识别和同源重组将待编辑的基因删除。
2. 另一种基因敲除方法是随机突变。
研究人员将含有同源序列的筛选标记基因插入到待编辑的基因的3'端，然后加入四环素抗性基因的启动子和终止序列，通过筛选标记基因的表达，选择含有同源序列的细胞，再通过随机突变的方法产生突变体。
基因敲除技术的应用：
1. 研究基因的功能和作用机制。
通过基因敲除技术，研究人员可以删除或改变特定的DNA 序列，以研究该基因的作用和影响。
2. 疾病治疗。
基因敲除技术也可以用于治疗某些疾病，如遗传性疾病、癌症等。
3. 药物开发。
研究人员可以通过基因敲除技术来研究药物的作用机制和效果，以开发新的药物。
基因敲除技术路线
基因敲除技术路线基因敲除技术是一种常用的基因组编辑方法，通过破坏特定基因的功能，以研究该基因在生物体发育、生理和病理过程中的作用。
本文将介绍基因敲除技术的基本原理、常用的敲除方法和技术路线。
一、基因敲除技术的原理基因敲除是指通过人为手段使特定基因在生物体中失去功能。
在细胞层面上，基因敲除可以通过两种方式实现：直接破坏基因编码区域或间接影响基因表达。
直接破坏基因编码区域的方法包括插入缺失、替换和故障等，而间接影响基因表达的方法则通过RNA干扰或基因废弃等方式实现。
二、常用的基因敲除方法1. 全基因敲除方法：全基因敲除是将整个基因组中的某个特定基因进行敲除，即完全破坏该基因的编码区域。
常用的全基因敲除方法包括基因敲除小鼠模型、转基因植物敲除和CRISPR-Cas9等。
2. 特定基因敲除方法：特定基因敲除是指对某个特定基因进行有针对性的敲除，保留其他基因的功能不受影响。
常用的特定基因敲除方法包括siRNA靶向敲除、基因编辑酶的使用和肌肉纤维母细胞的敲除等。
三、基因敲除技术路线基因敲除技术的路线可以分为以下几个步骤：1. 确定目标基因：首先需要确定要敲除的目标基因。
通过文献研究和生物信息学分析，可以确定该基因在生物体发育、生理和病理过程中的作用，以及敲除后可能引起的变化。
2. 设计敲除载体：根据目标基因的序列信息，设计敲除载体。
敲除载体通常包括靶向序列、选择性标记基因和背景基因等。
靶向序列用于特异性识别目标基因，选择性标记基因用于筛选敲除细胞，背景基因用于确认敲除效果。
3. 转染敲除载体：将设计好的敲除载体导入到目标细胞中。
常用的转染方法有化学法、电穿孔法和病毒载体介导法等。
转染后，目标细胞中将存在敲除载体和非敲除细胞。
4. 筛选敲除细胞：通过添加相应的筛选剂或选择标记基因，筛选出成功敲除目标基因的细胞。
敲除细胞可以通过PCR、Western blot 或克隆等方法进行鉴定。
5. 验证敲除效果：通过对敲除细胞进行功能性实验，验证敲除效果。
基因敲除技术
基因敲除技术1．概述：基因敲除是自80年代末以来发展起来的一种新型分子生物学技术，是通过一定的途径使机体特定的基因失活或缺失的技术。
通常意义上的基因敲除主要是应用DNA同源重组原理，用设计的同源片段替代靶基因片段，从而达到基因敲除的目的。
随着基因敲除技术的发展，除了同源重组外，新的原理和技术也逐渐被应用，比较成功的有基因的插入突变和iRNA，它们同样可以达到基因敲除的目的。
2．实现基因敲除的多种原理和方法：2．1． 利用基因同源重组进行基因敲除基因敲除是80年代后半期应用DNA同源重组原理发展起来的。
80年代初，胚胎干细胞（ES细胞）分离和体外培养的成功奠定了基因敲除的技术基础。
1985年，首次证实的哺乳动物细胞中同源重组的存在奠定了基因敲除的理论基础。
到1987年，Thompsson首次建立了完整的ES细胞基因敲除的小鼠模型[1]。
直到现在，运用基因同源重组进行基因敲除依然是构建基因敲除动物模型中最普遍的使用方法。
2.1.1利用同源重组构建基因敲除动物模型的基本步骤(图1)：a． 基因载体的构建：把目的基因和与细胞内靶基因特异片段同源的DNA 分子都重组到带有标记基因(如neo 基因，TK 基因等)的载体上，成为重组载体。
基因敲除是为了使某一基因失去其生理功能，所以一般设计为替换型载体。
b．ES 细胞的获得：现在基因敲除一般采用是胚胎干细胞，最常用的是鼠，而兔，猪，鸡等的胚胎干细胞也有使用。
常用的鼠的种系是１２９及其杂合体，因为这类小鼠具有自发突变形成畸胎瘤和畸胎肉瘤的倾向，是基因敲除的理想实验动物。
而其他遗传背景的胚胎干细胞系也逐渐被发展应用。
[2，3]ｃ．同源重组：将重组载体通过一定的方式(电穿孔法或显微注射)导入同源的胚胎干细胞(ES cell)中，使外源DNA与胚胎干细胞基因组中相应部分发生同源重组，将重组载体中的DNA序列整合到内源基因组中，从而得以表达。
一般地，显微注射命中率较高，但技术难度较大，电穿孔命中率比显微注射低，但便于使用。
基因敲除技术的原理方法和应用
基因敲除技术的原理方法和应用
体外基因敲除是指将靶基因进行人工干扰，通过CRISPR/Cas9系统或RNA干扰技术等手段，敲除特定基因，并在细胞培养系统中观察敲除基因
后细胞的变化。
体外基因敲除的主要方法有：
体内基因敲除是指在整个生物体内敲除特定基因，通常通过转基因技
术将敲除基因的胚胎或细胞转入受体生物体中，使其在整个生命周期内缺
少该基因的作用。
体内基因敲除的主要方法有：
1.胚胎干细胞诱导：通过干细胞技术将敲除特定基因的胚胎干细胞注
射到受体胚胎的早期胚胎或女性动物的卵子中，使得整个个体在发育过程
中缺少该基因。
2.基因敲入技术：通过转基因技术将敲除基因的DNA序列插入目标细
胞的基因组中，使其成为目标细胞的一部分，并在后代中传递下去。
1.功能研究：通过敲除特定基因，可以观察该基因在发育、代谢、免
疫等生理过程中的作用，从而揭示基因功能。
2.疾病模型建立：通过敲除与特定疾病相关的基因，可以建立动物模
型以研究该疾病的机制，如敲除小鼠中的肿瘤抑制基因p53可产生肿瘤模型。
3.药物研发：通过敲除特定基因，可以研究该基因与药物反应的关系，为药物研发提供新的靶点和策略。
4.转基因生物培育：通过敲除或沉默对农业和畜牧业产生负面影响的
基因，可以改良农作物和畜禽品种，提高产量和抗病能力。
总的来说，基因敲除技术是一种重要的生物学研究工具，它为我们深入理解基因功能和疾病机制提供了新的途径，也为药物研发和农业生产提供了新的思路和方法。
随着技术的不断发展，基因敲除技术将在更多领域展现其巨大的潜力和价值。
基因敲除
4.制作感受态细胞 参照链霉菌中想要敲除的基因A相应的核 苷酸序列，设计引物1、2，其中引物1中有 EcoR I 的酶切位点，引物2中有BamH I 酶 切位点，以链霉菌的基因组DNA 为模板， 引物1 和引物2 进行PCR 扩增。将PCR 获 得的A基因片段经纯化及EcoR I 和BamH I 双酶切，与经同样双酶切的大肠杆菌－ 链 霉菌穿梭质粒载体pGH112 连接，得到重组 质粒pGH112-A 。将验证正确的重组质粒 pGH112 – A 电转至Ecoli BW25113 /pIJ790 感受态中，获得E． coliBW25113 /pIJ790 /pGH112-A 转化子，将其制作成 感受态细胞。
Thanks
Flowchart of gene disruption by PCR-targeting
1.质粒 质粒pIJ773中安普抗性基因的序列 ( 该序列中还包含转移复制起始点oriT 以及FLP 重组酶的识别位点FRT 序列， oriT 便于后面重组质粒的接合转移) 。
2.引物设计 设计一对长59nt及58nt 的引物( 引 物3 和引物4) ，其中引物3 包含20nt 的安普抗性基因上游的FRT 序列以及A基 因（想要敲除的基因）上游的一段39nt 的互补序列，引物4 包含19nt 的安普抗 性基因下游的FRT 序列以及A基因下游的 一段39nt 的互补序列。 3.PCR产生阻断片段 按此引物PCR 所得产物中应包含一个 安普抗性基因，并且在它的两端含有各 带有39bp 的A基因上下游的同源序列， 将此PCR 产物称为安普抗性框。以含有 安普抗性基因的质粒pIJ773 作为模板， 引物3 和引物4 进行PCR 扩增，产生阻 断片段。
Gene disruption by PCR-targeting
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锌指核酸酶（Zinc-finger nucleases, ZFN）是人工改造的限制性核酸内 切酶，利用不同的锌指结构识别特异DNA序列，利用核酸酶切断靶DNA。
• 锌指结构中每一个α螺旋可以特异识别 3-4个碱基； • 人工设计识别特异DNA序列的α螺旋采 用如上的通用序列，通过改变其中7个 X来实现识别不同的三联体碱基， TGEK是多个螺旋间的连接序列； • 构建成对人工锌指结构域和FokI融合 蛋白（ZFN）可以在指定区域切断 DNA双链。
2单元模块质粒
pCS2 TALEN真 核表达载体 1+2单元模块质 粒套装 多单元模块质粒 pCS2 TALEN真 核表达质粒
共16种选择
TALEN空载体2种/套 4+16+2共22种质粒/套
20以下任意单元数目 将指定TALEN模块插入pCS2 TALEN真核表达载体
怎样做TALEN
康 为
TALEN质粒 构建
• 一篇人类干细胞 《Genetic engineering of human pluripotent cells using TALE nucleases》 • 一篇大鼠
《Knockout rats generated by embryo microinjection of TALENs》
• 两篇斑马鱼 《Targeted gene disruption in somatic zebrafish cells using engineered TALENs 》
TALEN应用扩展的技术关键： 切实可靠的表达系统。 高效的转基因及克隆筛选技术。
TALEN的植物应用
Ting Li et. al. High-efficiency TALEN-based gene editing produces disease resistant rice， volume 30 number 5 may 2012 Nature Biotechnology
应识别一个目标碱基
人工构建TALE模块识别指定核酸序列
…… 14 – 18个重复
102碱基模块单元 真核表达
…… 14 – 18个重复 34氨基酸单元 特异识别指定的14 -18 个核酸序列并与之结合
TALEN 发展过程
TALEN 基因敲除
TALEN (TALE+FOK I) 表达质粒对 TALEN 表达质粒对转染、表达 切割靶位点 切割诱发DNA损伤修复机制 （nonhomologous end-joining， NHEJ）。由于在此修过程中总是 有一定的错误率存在。在修复中发 生移码突变错误的个体即形成目标 基因敲除突变体
• （点）突变：Silent；Missense； Nonsense；Frame shift （基因敲除， Knockout） • 片段删除
• 片段插入
目的与用途：生物模型；表达工具；基因治疗
靶向基因技术
经典方法 ： 自杀质粒，同源重组 – 几率低(~1 HR event per 106 cells），难！
T A L E N 技 术 服 务
提供两个测序证明的14-18碱基TALEN识别域真核表 达克隆(pCS2)。且以293T细胞系转染，PCR酶切 鉴定，灰度扫描定量证实突变效率高于10%
TALEN靶向 敲除细胞 系构建 TALEN靶向 敲除斑马 鱼构建
提供经克隆测序证明的目标基因移码突变细胞系(杂 合子） 提供目标基因基因移码突变F1斑马鱼（杂合子）
TALEN 发展过程
1989年 植物病原体黄单胞菌属 （Xanthomonas spp.）
avrBs3 基因被克隆。
2007年 发现其序列特异性核酸结合特性， avrBs3 – TA 2009年 Xanthomonas TA氨基酸序列与核酸靶序列的对应关系被破译 由34个aa组成一个单元模块，重复17 -18次 34个aa中的第12和13个氨基酸（Repeat Variant Di-residue, RVD) 对
突变体筛选
• 有限稀释法获得单细胞克隆
• PCR-酶切法鉴定
• PCR测序确认
怎样做TALEN
基本工具质粒
1单元模块质粒：A，G，C, T共4种 2单元模块质粒：4X4=16种 TALEN表达载体：基于PCS2质粒2种
14 – 18bp靶点序列
怎样做TALEN
康 为 T A L E N 定 制 质 粒 产 品 1单元模块质粒 A, G, C, T 4种选择
ZFN 技术
研究人员可以利用ZFN技术进行各种基因编辑，比如基因 敲除。已建立有ZFN库，识别多种DNA序列，但还不能达 到识别任意靶DNA的目的，其应用受到一定的限制。
锌指核酸酶介导的定向染色体删除
崭新的技术解决经典的挑战
崭新的技术 - TALEN 经典的挑战 – 染色体DNA序列的人工编辑修改
TALEN技术成功率影响因素
重组TALEN模块与靶位点的 ‘亲合力’
靶点序列设计原则来自20个天然TLAE的统计规律
细胞系固有特性
K562容易，293中等，MC-10困难
细胞转染效率
不同细胞系转染效率不同，293高， HeLa低
所期待的目标
Heterozygous？Homozygous？Exact point mutation？
X2
TAL 靶点识别模块
FokI
FOKI 内切酶打断靶点区
步骤三. 将TALEN质粒对共转入细胞中实现靶基因敲除
TALEN质粒对共转入细胞后，其表达的融合蛋白即可分别找到其DNA靶位 点并与靶位点特异结合。此时，两个TALEN融合蛋白中的FokI功能域形成 二聚体，发挥非特异性内切酶活性，于两个靶位点之间打断目标基因。
《Heritable gene targeting in zebrafish using customized TALENs》 •
一篇综述 《Move over ZFN》
TALEN靶向（基因敲除）技术 基本流程
1. 选择、确定靶点
2. TALE识别模块串联构建
X2
3. TALEN真核表达质粒构建
X2
Mut
• 当左右靶点之间没有合适的酶切位点时可使用 CEL-I核酸酶检测。
• 经验规律：>= 2%可用，>=10%很好
TALEN切割效率检测
荧光素酶检测法 启动子 – ABCDEF – stop-Target site - DEFHIJK 共转染 荧光素酶检测质粒 + TALEN质粒 1 + TALEN质粒 2 启动子 – ABCDEFHIJK 发光倍数与切割效率之间的定量关系尚缺乏充分研究。 有文献表明，发光倍数达1.5至2倍即可有效获得突变体。
饱含希望与失望的技术： ZFN，被Sigma公司垄断 新的里程碑： TALEN
TALEN技术
基于TALEN (transcription activator-like (TAL) effector nucleases)的靶向 基因敲除技术是一种崭新的分子生物学工具，现已应用于细胞、酵母、 斑马鱼与大鼠等各类研究对象。 技术原理： 表达一个重组核酸酶，在靶点识别结构域的作用下，核酸酶识别靶点核 酸序列，并发挥内切酶活性，从而打断目标基因，完成基因敲除的过程。
具专利保护的克隆构建系统
具专利保护的克隆构建系统
步骤一：靶点识别单元串联
具专利保护的克隆构建系统
步骤二：TALEN表达质粒构建
真核表达TALEN质粒对
将靶点识别模块克隆入真核表达载体，得到Talen质粒对 靶点识别模块串接成功后需克隆入真核表达载体中。此真核表达载体含 有TAL的其它必需结构域并在C端融合有FokI序列。 目前，TALEN系统利用FokI的内切酶活性打断目标基因。因FokI需形成2 聚体方能发挥活性，在实际操作中需在目标基因中选择两处相邻（间隔 17碱基）的靶序列（14 - 18个碱基）分别进行TAL识别模块构建。
TALE识别模块串联构建
• TAL的核酸识别单元
为34aa模块中的双连 氨基酸（RVD） • RVD与A、G、C、T 有恒定的对应关系， 即NI识别A，NG识别T， HD识别C，NN识别G， 非常简单明确 • 欲使TALEN特异识 别某一核酸序列（靶 点），只须按照靶点 序列将相应TAL单元 （14 -18个）串联克 隆即可。
TAL 靶点识别模块
FokI
X2
TALEN介导的同源重组
HR
基因敲入
片段删除 Left arm Right arm
点突变 Left arm Right arm
Donor plasmid
Donor plasmid
Donor plasmid
同源重组发生率升高几个数量级
TALEN的最前沿
2011年8月， Nature Biotechnology 上同时发表了用TALEN 技术 进行基因敲除的4篇研究文章，另加一篇综述。
4. TALEN真核表达质粒转入 （卵）细胞，表达TALEN 重组蛋白
X2
Mut
5. 检测突变效率，筛选 （移码）突变体
选择确定TALE靶点
靶点的DNA序列特征： 相隔17-18bp的两段14-18bp序列作为靶点
参考文献：Cermak et al., Efficient design and assembly of custom TALEN and other TAL effector-based constructs for DNA targeting, Nucleic Acids Research, 2011, Vol. 39, No. 12, e82. 在线靶点选择设计软件：https:///node/add/talef-off/
背景
水稻病原菌 Xanthomonas oryzae pv. oryzae (Xoo)导致细菌性白叶枯病。 细菌天然 TALE AvrXa7 or PthXo3 与水稻Os11N3基因 启动子结合，调控（hijack） 此基因上调表达，促进细胞内糖份向细胞外转运，便于病原菌利用。