基因敲除-简介
基因敲除技术
基因敲除技术gene knockoutgene knockout简介基因敲除技术是一种通过破坏特定基因来研究该基因在细胞或生物体中功能的实验方法。
这项技术在基础研究、疾病模型构建以及药物开发等领域中起着重要作用。
通过敲除特定基因，我们可以揭示该基因在生物体中的功能，对其与相关疾病的关联进行研究，并探索其在生物学过程中的作用机制。
基因敲除技术的原理基因敲除技术是通过引入特定的DNA片段使目标基因发生突变或被删除，从而破坏目标基因的功能。
常用的基因敲除技术包括CRISPR/Cas9、转座子、RNA干扰等。
CRISPR/Cas9CRISPR/Cas9是目前应用最广泛的基因敲除技术之一。
它基于细菌和古菌的天然免疫系统中的一种防御机制。
CRISPR （Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats）是一种由短重复序列和变异序列组成的DNA片段。
Cas9是一种具有核酸内切活性的酶。
CRISPR/Cas9技术利用RNA导向的Cas9酶靶向识别和切割特定的DNA序列。
在细胞中引入含有目标基因的RNA分子和Cas9酶后，Cas9酶会与RNA分子结合形成复合物，通过RNA分子的导向，使Cas9酶与目标基因特异性结合，并切割目标基因的DNA序列，导致基因发生突变或敲除。
转座子转座子是一种能在基因组中移动的DNA片段。
转座子可以在基因组中发生插入、删除或重排等事件，从而导致基因的敲除和突变。
转座子技术通过引入含有转座子序列的DNA片段来实现基因敲除。
在细胞中，转座子序列会与基因组发生重组，导致目标基因的敲除或突变。
RNA干扰RNA干扰是一种通过介导靶向特定mRNA分解的机制来抑制基因表达的方法。
在RNA干扰中，特定的siRNA（small interfering RNA）或shRNA（short hairpin RNA）分子与目标mRNA相互作用，导致mRNA的降解，从而抑制特定基因的表达。
巨噬细胞中基因敲除
巨噬细胞中基因敲除
巨噬细胞中的基因敲除是一种基因编辑技术，用于研究特定基因在巨噬细胞中的功能和作用。
这种技术可以通过使用特定的基因编辑工具，如CRISPR-Cas9系统，来精确地删除或失活巨噬细胞中的某个基因，从而观察这个基因缺失后对巨噬细胞功能的影响。
巨噬细胞是一种重要的免疫细胞，具有吞噬、杀菌、抗原呈递等多种功能。
因此，研究巨噬细胞中特定基因的功能，对于深入了解免疫系统的功能和机制，以及开发新的治疗策略具有重要意义。
在进行巨噬细胞基因敲除实验时，首先需要选择合适的基因编辑工具和实验方法，然后制备巨噬细胞，并将基因编辑工具导入到细胞中。
接下来，通过筛选和鉴定，确定基因编辑是否成功，并观察基因缺失对巨噬细胞功能的影响。
需要注意的是，基因敲除实验具有一定的复杂性和风险性，需要严格遵循实验规范和伦理要求。
同时，由于巨噬细胞在免疫系统中的重要作用，基因敲除实验可能会对机体的免疫功能产生一定的影响，因此需要谨慎评估和控制实验风险。
总之，巨噬细胞中的基因敲除是一种重要的实验手段，可以用于研究特定基因在巨噬细胞中的功能和作用，为深入了解免疫系统的功能和机制提供重要的实验依据。
分子生物学综述论文(基因敲除技术)
现代分子生物学课程论文题目基因敲除技术班别生物技术10-2学号 *********** 姓名陈嘉杰成绩基因敲除技术的研究进展要摘基因敲除是自80年代末以来发展起来的一种新型分子生物学技术，是通过一定的途径使机体特定的基因失活或缺失的技术。
此后经历了近20年的推广和应用，直到2007年10月8日，美国科学家马里奥•卡佩奇（Mario Capecchi）和奥利弗•史密西斯（Oliver Smithies）、英国科学家马丁•埃文斯（Martin Evans）因为在利用胚胎干细胞对小鼠基因金星定向修饰原理方面的系列发现分享了2007年诺贝尔生理学或医学奖。
基因敲除技术从此得到关注和肯定，并对医学生物学研究做出了重大贡献。
本文就基因敲除的研究进展作一个简单的综述。
关键词基因敲除、RNAi、生物模型、同源重组前言基因敲除又称基因打靶，该技术通过外源DNA与染色体DNA之间的同源重组，进行精确的定点修饰和基因改制，具有转移性强、染色体DNA可与目的片段共同稳定遗传等特点。
应用DNA同源重组技术将灭活的基因导入小鼠胚胎干细胞（embryonic stem cells，ES cells）以取代目的基因，再筛选出已靶向灭活的细胞，微注射入小鼠囊胚。
该细胞参与胚胎发育形成嵌合型小鼠，再进一步传代培育可得到纯合基因敲除小鼠。
基因敲除小鼠模型的建立使许多与人类疾病相关的新基因的功能得到阐明，使现代生物学及医学研究领域取得了突破性进展。
上述起源于80年代末期的基因敲除技术为第一代技术，属完全性基因敲除，不具备时间和区域特异性。
关于第二代区域和组织特异性基因敲除技术的研究始于1993年。
Tsien等[1]于1996年在《Cell》首先报道了第一个脑区特异性的基因敲除动物，被誉为条件性基因敲除研究的里程碑。
该技术以Cre/LoxP系统为基础，Cre在哪种组织细胞中表达，基因敲除就发生在哪种组织细胞中。
2000年Shimizu等[2]于《Science》报道了以时间可调性和区域特异性为标志的第三代基因敲除技术，其同样以Cre/LoxP系统为基础，利用四环素等诱导Cre的表达。
2007年诺贝尔生理学或医学奖——基因敲除研究
美国科学家奥利弗·史密斯
※ 1925年7月23日出生于英格兰的哈利 法克斯，是英国出生的美国遗传学家。
※ 高中毕业后直接进入牛津大学的贝利 尔学院学习，并于1946年获得牛津大学 生理学学士学位。
※1951年获得牛津大学生物化学博士学 位，现任职于美国北卡罗莱纳大学医学 院病理学教授。
总的来说，原发性肝癌的病因至今未能 完全阐 明，但 已证明 与以下 因素密 切相关 ： 1、病毒性肝炎：流行病学统计表明，乙 肝流行 的地区 也是肝 癌的高 发地区 ，患过 乙肝的 人比没 有患过 乙肝的 人患肝 癌的机 会要高 10倍之 多。长 期的临 床观察 中发现 ，肝炎 、肝硬 化、肝 癌是不 断迁移 演变的 三部曲 。近来 研究表 明，与 肝癌有 关的病 毒性肝 炎主要 包括 乙型肝炎（HBV）、丙型肝炎（BCV），而 其中又 以乙型 肝炎最 为常见 。 2、酒精：俗话说“饮酒伤肝”，饮酒并 不是肝 癌的直 接病因 ，但它 的作用 类似于 催化剂 ，能够 促进肝 癌的发 生和进 展。有 长期酗 酒嗜好 者容易 诱发肝 癌。这 是因为 酒精进 入人体 后，主 要在肝 脏进行 分解代 谢，酒 精对肝 细胞的 毒性使 肝细胞 对脂肪 酸的分 解和代 谢发 生障碍，引起肝内脂肪沉积而造成脂 肪肝。 饮酒越 多，脂 肪肝也 就越严 重，进 而引起 肝纤维 化、肝 硬化、 肝癌的 发生。
奥利弗史密斯的研究
• 埃文斯应用基因打靶技术发展人类疾病的 小鼠模型。他还开发了多种其它的人类遗 传疾病囊肿性纤维化小鼠模型，并利用这 些模型来研究疾病机制和测试基因疗法的 效果。
2020/1/4
马丁埃文斯的研究：
1981年，英国科学家马丁·埃文 斯时任英国卡的夫大学哺乳动物基 因学教授的，首次从老鼠胚胎中提 取出胚胎干细胞（ＥＳＣ），这一 发现为“基因敲除”小鼠的出现奠 定了直接的基础。
如何利用基因编辑技术改造细菌
如何利用基因编辑技术改造细菌引言：基因编辑技术是一种革命性的生物技术，可以对细胞和生物体的基因进行精确的编辑和修改，为人类解决许多问题提供了无限的可能。
其中，利用基因编辑技术改造细菌已经成为了生物学和医学领域的热点研究方向。
本文将介绍如何利用基因编辑技术来改造细菌，以及相关的应用和潜在的风险。
一、基因编辑技术简介基因编辑技术是一种通过改变生物细胞或个体DNA顺序来修改其性状的技术。
最常用的基因编辑技术是CRISPR-Cas9系统。
CRISPR是一种天然存在于细菌中的免疫系统，能够识别和消灭外部的DNA。
人们利用这一系统，将Cas9蛋白与具有特定序列的RNA相结合，使其成为一种高效的基因剪刀，可以切割DNA链，并在修复过程中引入指定的修饰或突变。
二、利用基因编辑技术改造细菌的方法1. 基因敲除基因敲除是指通过基因编辑技术将特定基因从细菌的基因组中去除。
这种方法可以帮助研究人员了解某个基因对细菌的功能和性状的影响。
同时，利用基因敲除还可以设计新型基因工程菌，用于生产特定的化合物或制药工艺的改进。
2. 基因修饰基因修饰是指通过基因编辑技术改变细菌基因组中的某个或某些基因的DNA序列，从而修改细菌性状。
例如，可以通过引入新的代谢途径或增强已有的代谢途径，使得细菌能够从廉价的废弃物中合成有价值的化合物。
此外，基因修饰还可以帮助细菌对抗致病微生物，提高细菌的抗性和适应性。
三、基因编辑技术改造细菌的应用1. 生物材料生产利用基因编辑技术改造细菌可以有效地生产生物塑料、生物燃料和其他生物材料，减少对传统化石资源的依赖。
例如，通过引入新的代谢途径，细菌可以从纳入其生长介质中的废弃物中合成高降解性的生物塑料。
2. 化学品生产细菌的代谢途径和酶系统具有很高的多样性和催化效率，可以用于生产多种化学品。
通过改造细菌的代谢途径和酶系统，可以实现高效、可持续和低成本的化学品生产，如葡萄糖、笨二酸和乳酸等。
3. 抗微生物感染基因编辑技术改造细菌还可以应用于抗微生物感染领域。
CRISPR Cas9基因敲除技术的原理简介
CRISPR Cas9基因敲除技术的原理简介CRISPR/Cas9 基因敲除原理介绍
CRISPR (clustered, regularly interspaced, short palindromic re peats)是一种来自细菌降解入侵的病毒 DNA 或其他外源 DNA 的免疫机制。
在细菌及古细菌中，CRISPR系统共分成3类，其中Ⅰ类和Ⅲ类需要多种CRISPR相关蛋白（Cas蛋白）共同发挥作用，而Ⅱ类系统只需要一种Cas蛋白即可，这为其能够广泛应用提供了便利条件。
目前，来自Streptococcus pyogenes 的CRISPR-Cas9系统应用最为广泛。
Cas9 蛋白（含有两个核酸酶结构域，可以分别切割DNA 两条单链。
Cas9首先与crRNA及tracrRNA结合成复合物，然后通过PAM序列结合并侵入DNA，形成RNA-DNA复合结构，进而对目的DNA双链进行切割，使DNA双链断裂。
由于PAM序列结构简单（5’-NGG-3’），几乎可以在所有的基因中找到大量靶点，因此得到广泛的应用。
CRISPR-Cas9系统已经成功应用于植物、细菌、酵母、鱼类及哺乳动物细胞，是目前最高效的基因组编辑系统。
通过基因工程手段对crRNA和tracrRNA进行改造，将其连接在一起得到sgRNA（single guide RNA）。
融合的RNA具有与野生型RNA类似的活力，但因为结构得到了简化更方便研究者使用。
通过将表达sgRNA的原件与表达Cas9的原件相连接，得到可以同时表达两者的质粒，将其转染细胞，便能够对目的基因进行操作。
图示：Cas9通过向导RNA结合到目标DNA上并进行切割。
CRISPR-Cas9精细原理：基因敲除、点突变、基因插入
1.2CRISPR-Cas系统的结构 CRISPR-CAS 系统的组成主要包括: 由不连续的重复序列
R( repeat) 与长度相似的间区序列S( spacers) 间隔排 列而成的CRISPR 簇，前导序列L( leader) 以及一系列 CRISPR 相关蛋白基因cas。
Cas蛋白是一种双链DNA核酸酶，能在 guide RNA引导下对靶位点进行切割。它 与folk酶功能类似，但是它并不需要形 成二聚体才能发挥作用。
真核细胞的转录激活因子可通过将ｄCas9与单纯疱疹病毒转录激活子 ＶＰ16结合获得。
3、CRISPR-Cas9技术的优势与前景
3.1CRISPR-Cas9技术的优势
而且从实际应用的角度来说，CRISPRs比TALENs更容易操作，因 为每一对TALENs都需要重新合成，而用于CRISPR的gRNA只需要 替换20个核苷酸就行。
只需合成一个sgRNA就能实现对基因的特异性修饰，Cas蛋白不 具特异性。
编码sgRNA的序列不超过100bp，因此比构TALENs和ZFNs更简单 方便。
较短的sgRNA序列也避免了超长、高度重复TALENs编码载体带来 的并发症。
CRISPR-Cas9大PR-Cas系统简介
1.1 CRISPR-Cas系统的研究历史
1987 年，日本课题组在K12 大肠杆菌的碱性磷酸酶基因附近发现串联间 隔重复序列，随后发现其广泛存在于细菌和古细菌的基因组中，2002 年， 正式将其命名为成簇的规律间隔的短回文重复序列
2.2CRISPR/Cas9介导的转录抑制与转录激活
CRISPR／Cas9系统用于转录抑制需要PAM（３bp）和至少12bp的gRNA－ ＤＮＡ配对
利用crＲＮＡ介导dCas9能够精确识别靶基因的特点，将ｄCas蛋白与 具有转录激活的蛋白质功能域融合则可构建具有转录激活活性的 CRISPR－on系统。
大肠杆菌CRISPR-Cas9系统基因敲除简介
1CRISPR-Cas系统的研究进展CRISPR(clustered regularly interspaced short palindromic repeats)，即串联的、间隔的短回文重复序列，最早在1987年研究大肠杆菌的碱性磷酸酶基因时被发现[1]。
随后在细菌和古细菌的基因组中也发现大量存在CRISPR，研究证实它能够保护自身抵御外来病毒和质粒的入侵[2]，作用机制是依靠crRNA(CRISPR RNA)和tracrRNA(trans-activating crRNA)结合并引导Cas蛋白对外源DNA进行特异性降解[3]。
已发现的CRISPR-Cas系统有三种类型：Ⅰ型，Ⅱ型和Ⅲ型，其中以Ⅱ型最为简单，只需一种Cas蛋白，即通过RNA 介导核心蛋白Cas9识别并切割靶序列，引起DNA双链断裂[2]。
受自然界中CRISPR-Cas系统的启发，主要对来自于化脓性链球菌(Streptococcus pyogenes)的Ⅱ型CRISPR-Cas系统进行人为改造和利用，目前已经将其发展成为一种新型的基因编辑技术，实现基因敲除、插入、定点突变和组合编辑[4]，并成功应用于大肠杆菌、酿酒酵母、家蚕、果蝇和人类细胞等[5]。
和传统的基因编辑技术相比，这一新技术具有成本低、操作简便、效率高的优点[6]。
2 CRISPR-Cas系统的组成与机制典型的Ⅱ型CRISPR-Cas系统基因座包含tracrRNA基因、Cas蛋白编码基因(cas9、cas1、cas2和csn2)、CRISPR基因座（引导序列、间隔序列和重复序列）这三个部分[6]。
Ⅱ型CRISPR-Cas系统的作用机制可分为三个阶段，第一是高度可变间隔序列的获得（图1），第二是CRISPR-Cas系统基因座的表达，第三是对外源遗传物质的降解[6]（图2）。
Cas1、Cas2和Csn2蛋白与新间隔序列的获得相关。
与间隔序列同源的外源遗传物质上的原间隔序列(protospacer)，其下游存在一段保守序列，被称为PAM(protospacer adjacent motifs)[7]。
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除了同源重组外，新的原理和技术也逐渐被应用，比较成 功的有基因的插入突变(insertional mutagenesis) 和RNAi
(gene knock-down) 。
a.基因载体的构建
把目的基因和与细胞 内靶基因特异片段同源 的DNA 分子都重组到带 有标记基因的载体上， 成为重组载体。
基本步骤
用设计的同源片段替代靶基因片段，从而达到基因敲除的目
的(gene knock-out)。
同源重组（Homologus Recombination) 是指发生在姐妹染色单体（sister
chromatin)之间或同一染色体上含有同源序列的DNA分子之间或分子之内的重
新组合。同源重组需要一系列的蛋白质催化，如原核生物细胞内的RecA、 RecBCD、RecF、RecO、RecR等；以及真核生物细胞内的Rad51、Mre11Rad50等等。
基因敲除技术简介
龙良鲲
定义:
在基因组水平上改变或破坏靶基因的结构，使 其功能完全丧失的实验技术。
完全基因敲除是指通过同源重组法完全消除细胞或者动
植物个体中的靶基因活性。
条件型基因敲除是指通过定位重组系统实现特定时间和 空间的基因敲除。
基因敲除原理
通常意义上的基因敲除主要是应用DNA同源重组原理，
WT
glrA
T1
PCR1
T1
PCR2
P
hph
1.9 kb LB 2.5 kb
2.9 kb
RB
pAg-DGR
PCR验证∆glrA菌株
Ladder
∆glrA ∆glrA
cglrA
cglrA
WT
WT
NC
PCR 2 (2.89 kb)
pMB-GR3.9
cglrA
NC
Ladder
230 bp 75
∆glrA
hph
glrA
Ta
actin
Ta
hph
glrA
ble
3.9 kb
RT-PCR验证∆glrA及cglrA菌株
影响因素
细菌的限制性修饰系统。
合适的选择性标记。 高效的转化技术(CaCl2法、电转化、原生质体、结合转 移、农杆菌介导的转化）。
Thanks!
ห้องสมุดไป่ตู้
1、建立高效的遗传转化系统。
2、构建基因敲除载体（最好带有双标记）。
3、转化实验。
4、筛选基因敲除的转化子。
5、验证转化子。
构建glrA 基因缺失株、遗传互补株和高表达菌株
PCR 2 (2.67 kb)
∆glrA ∆glrA
WT
WT
NC
PCR 1 (1.52 kb)
NC
Ladder
3 kb 2 1.6 1