基因敲除2
基因敲除技术的原理和应用
基因敲除技术是一种基因编辑技术，通过这种技术，研究人员可以删除或改变特定的DNA 序列，以研究基因的功能和作用机制。
基因敲除技术的原理：
1. 基因敲除可以通过同源重组的方法实现。
具体来说，研究人员将一个含有同源序列的筛选标记基因插入到待编辑的基因的3'端，然后加入四环素抗性基因的启动子和终止序列，通过筛选标记基因的表达，选择含有同源序列的细胞，再通过同源序列的识别和同源重组将待编辑的基因删除。
2. 另一种基因敲除方法是随机突变。
研究人员将含有同源序列的筛选标记基因插入到待编辑的基因的3'端，然后加入四环素抗性基因的启动子和终止序列，通过筛选标记基因的表达，选择含有同源序列的细胞，再通过随机突变的方法产生突变体。
基因敲除技术的应用：
1. 研究基因的功能和作用机制。
通过基因敲除技术，研究人员可以删除或改变特定的DNA 序列，以研究该基因的作用和影响。
2. 疾病治疗。
基因敲除技术也可以用于治疗某些疾病，如遗传性疾病、癌症等。
3. 药物开发。
研究人员可以通过基因敲除技术来研究药物的作用机制和效果，以开发新的药物。
同源重组基因敲除原理
同源重组基因敲除原理
同源重组基因敲除是一种基因编辑技术，用于通过删除特定基因的方法来研究该基因的功能。
该技术依赖于同源重组（homologous recombination）的原理，即通过引入一个与目标基因相似但存在缺陷的DNA片段，使其与目标基因发生交换，从而使目标基因的序列被“剪除”。
同源重组基因敲除的过程可以简单概括为以下几个步骤：
1. 构建敲除基因载体：首先，需要构建一种含有目标基因的缺陷的 DNA 片段的敲除基因载体。
这个载体通常包括两个关键
部分：一个能够与目标基因进行同源重组的“同源臂”，以及一个“筛选标记”以区分带有敲除基因的细胞。
2. 转染细胞：将敲除基因载体导入目标细胞中。
这可以通过多种方法实现，如基因枪、电穿孔或病毒介导等。
3. 同源重组：在目标细胞内，敲除基因载体中的同源臂与目标基因的相应部分发生同源重组，并在此过程中将缺陷的片段插入到目标基因的位置。
4. 筛选转基因细胞：为了筛选那些已经发生同源重组的细胞，通常会在敲除基因载体中加入一个筛选标记，如抗生素的抗性基因。
只有那些发生重组的细胞才能生存下来，因为它们可以在含有相应抗生素的培养基上生长。
通过同源重组基因敲除技术，可以实现有针对性地敲除特定基
因的目的。
这种方法广泛应用于功能基因组学研究，为我们理解基因的功能和相互作用提供了重要的工具。
基因敲除
4.制作感受态细胞 参照链霉菌中想要敲除的基因A相应的核 苷酸序列，设计引物1、2，其中引物1中有 EcoR I 的酶切位点，引物2中有BamH I 酶 切位点，以链霉菌的基因组DNA 为模板， 引物1 和引物2 进行PCR 扩增。将PCR 获 得的A基因片段经纯化及EcoR I 和BamH I 双酶切，与经同样双酶切的大肠杆菌－ 链 霉菌穿梭质粒载体pGH112 连接，得到重组 质粒pGH112-A 。将验证正确的重组质粒 pGH112 – A 电转至Ecoli BW25113 /pIJ790 感受态中，获得E． coliBW25113 /pIJ790 /pGH112-A 转化子，将其制作成 感受态细胞。
Thanks
Flowchart of gene disruption by PCR-targeting
1.质粒 质粒pIJ773中安普抗性基因的序列 ( 该序列中还包含转移复制起始点oriT 以及FLP 重组酶的识别位点FRT 序列， oriT 便于后面重组质粒的接合转移) 。
2.引物设计 设计一对长59nt及58nt 的引物( 引 物3 和引物4) ，其中引物3 包含20nt 的安普抗性基因上游的FRT 序列以及A基 因（想要敲除的基因）上游的一段39nt 的互补序列，引物4 包含19nt 的安普抗 性基因下游的FRT 序列以及A基因下游的 一段39nt 的互补序列。 3.PCR产生阻断片段 按此引物PCR 所得产物中应包含一个 安普抗性基因，并且在它的两端含有各 带有39bp 的A基因上下游的同源序列， 将此PCR 产物称为安普抗性框。以含有 安普抗性基因的质粒pIJ773 作为模板， 引物3 和引物4 进行PCR 扩增，产生阻 断片段。
Gene disruption by PCR-targeting
博士专题：基因功能研究技术之基因敲除与基因编辑技术
（一）完全基因敲除
• 基因载体的构建：把目的基因和与细胞内靶基因特异片段同 源的DNA 分子都重组到带有标记基因(如neo 基因，TK 基因 等)的载体上，成为重组载体。基因敲除是为了使某一基因失 去其生理功能，所以一般设计为替换型载体。
基因被完全敲除之后使得表型分析受到很多限制：
有些重要的靶基因被敲除后会引起胚胎早期死亡，使得 无法分析该基因在胚胎发育晚期和成年期的功能；某些基 因在不同的细胞类型中执行不同的功能，完全敲除会导致 突变小鼠出现复杂的表型，使研究者很难判断异常的表型 是由一种细胞引起的，还是由几种细胞共同引起的。
Cre/loxP系统作用原理示意图
FLP／FRT 系统
• 该系统与Cre／loxP系统相同，也是由一个重组酶 和一段特殊的 DNA序列组成。从进化的角度上考虑，Flp／FRT系统是Cre／loxP 系统在真核细胞内的同源系统。其中，重组酶Flp是酵母细胞内的一 个由423个氨基酸组成的单体蛋白。与Cre相似，Flp发挥作用也不需 要任何辅助因子，同时在不同的条件下具有良好的稳定性。该系统的 另一个成分Flp识别位点(Flp recognition target，FRT)与loxP位点 非常相似，同样由两个长度为13bp的反向重复序列和一个长度为8 bp的核心序列构成。在该系统发挥作用时，FRT位点的方向决定了 目的片段的缺失还是倒转。这两个系统比较明显的区别是它们发挥作 用的最佳温度不同，Cre重组酶发挥作用的最佳温度为37℃，而Flp 重组酶为30℃。因此，Cre／loxP系统最适宜在动物体内使用。loxP 和FRT位点的序列如图所示
（二）条件型基因敲除
• 条件型基因敲除法可定义为将某个基因的敲除限 制于小鼠某些特定类型的细胞或发育的某一特定 阶段的一种特殊的基因敲除方法。
基因敲除
基因敲除基因敲除和基因嵌入技术该技术是上个世纪90年代出现的最新外源DNA导入技术。
基因敲除是基因打靶技术的一种，类似于基因的同源重组。
指外源DNA与受体细胞基因组中序列相同或相近的基因发生同源重组，从而代替受体细胞基因组中的相同/相似的基因序列，整合入受体细胞的基因组中。
此法可产生精确的基因突变，也可正确纠正机体的基因突变。
基因嵌入又称基因置换，它是利用内源基因序列两侧或外面的断裂点，用同源序列的目的基因整个置换内源基因。
目前用于基因敲除和基因嵌入的技术有Cre/Lox P 系统、FLPI系统等。
[编辑本段]基因敲除(knock-out)基因敲除技术是20世纪80年代发展起来的，是建立在基因同源重组技术基础以及胚胎干细胞技术基础上的一种新分子生物学技术。
所谓胚胎干细胞(EmbryonicStem cell，ES)是从着床前胚胎(孕3—5天)分离出的内细胞团(Inner cellmass，ICM)细胞，它具有向各种组织细胞分化的多分化潜能，能在体外培养并保留发育的全能性。
在体外进行遗传操作后，将它重新植回小鼠胚胎，它能发育成胚胎的各种组织。
而基因同源重组是指当外源DNA片段大且与宿主基因片段同源性强者并互补结合时，结合区的任何部分都有与宿主的相应片段发生交换(即重组)的可能，这种重组称为同源重组。
基因敲除就是通过同源重组将外源基因定点整合入靶细胞基因组上某一确定的位点，以达到定点修饰改造染色体上某一基因的目的的一种技术。
它克服了随机整合的盲目性和偶然性，是一种理想的修饰、改造生物遗传物质的方法。
这项技术的诞生可以说是分子生物学技术上继转基因技术后的又一革命。
尤其是条件性、诱导性基因打靶系统的建立，使得对基因靶位时间和空间上的操作更加明确、效果更加精确、可靠，它的发展将为发育生物学、分子遗传学、免疫学及医学等学科提供了一个全新的、强有力的研究、治疗手段，具有广泛的应用前景和商业价值。
现在基因敲除技术主要应用于动物模型的建立，而最成熟的实验动物是小鼠，对于大型哺乳动物的基因敲除模型还处于探索阶段。
分子生物学中的基因敲除技术
分子生物学中的基因敲除技术基因是生物体内控制遗传信息传递和表达的基本单位。
基因拥有编码DNA序列，其不同的组合与排列方式决定了生物体的生理和形态特征。
基因突变会导致基因功能的改变，从而引起各种疾病。
因此，人们对于基因的研究一直是分子生物学领域的重点之一。
近年来，基因敲除技术的发展为基因功能的研究带来了革命性的变化。
本文将对分子生物学中的基因敲除技术进行介绍。
一、基因敲除技术的概述基因敲除技术又称基因敲除或基因敲除法，是指通过人工干预的方法，使其中一个或多个基因失去功能的一种技术手段。
它的主要思路是选取某些与目标基因相关的DNA片段进行改造，然后将这些片段通过基因修饰技术导入细胞中，从而抑制目标基因的表达，并从中研究基因功能。
在基因敲除技术的发展史上，一共经历了三个阶段。
第一阶段是限制酶切割技术阶段，该技术主要利用酶切割技术，即利用特定限制酶切割目标基因的特定区域，破坏基因的完整性以达到抑制基因表达的目的。
第二阶段是RNAi技术阶段，该技术利用速度和精度等优势，有效地抑制目标基因的表达。
最新阶段是CRISPR/Cas9基因编辑技术阶段，该技术可以直接在基因组中精确定位和切割目标，其准确性高、效果显著。
二、限制酶切法限制酶切法是利用限制酶断裂DNA，粘性末端互相结合形成重组、重组与质粒互相连接，经过再次引入宿主细胞，利用靶向位点引起相应基因抑制或丧失功能的方法。
具体方法如下：首先选择一个用于酶切靶基因的限制酶；然后，设计基于该酶作用的引物，并用聚合酶链式反应（PCR）扩增目的基因的片段；接下来，利用限制酶切割PCR产物，得到一段粘性端的DNA片段，然后再将其引入宿主细胞中并与目标基因的序列进行重组。
通过该方法，就可以抑制或消除目标基因的表达，对基因功能进行研究。
不过，限制酶切法也具有一些局限性。
例如，它不能实现基因的全局敲除，因为在粘性端重组的过程中，有一定概率发生错误的重组，造成基因复制，而复制后的多个基因片段均可导致基因的表达。
LEU2基因敲除对工业啤酒酵母高级醇生成量的影响_佐一含
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基因敲除
1(CRISPR)/CRISPR-associated (Cas) 是细菌和古细菌一种不断进化适应的免疫防御机制。
CRISPR/Cas9利用一段小 RNA 来识别并剪切DNA以降解外来核酸分子。
刚刚发表在《科学》（Science）（2013年,1,3）的两篇文章，证明Cas9系统 能在293T, K562, iPS等多种细胞中，进行有效的靶向酶切，非同源重组（NHEJ）、同源重组 （HR）效率在3-25%之间，与TALEN酶切效果相当。
文章还证明，多个靶点可以同时进行靶向酶切。
这些工作将进一步靶向基因操纵推向高潮，使得多个基因敲除、敲入变得更为简单、高效。
虽然目前，大家对该技术的特异性，免疫原性还了解甚少，但是随着研究的不断深入，一定会有很大的改善。
在未来的2-3年，动植物育种、干细胞定向分化、遗传疾定点修复等等都将得到迅猛的发展。
图1. RNA指导的CRISPR/Cas9基因剪切系统唯尚立德已经利用CRISPR/Cas9在斑马鱼，哺乳动物细胞上成功实现基因敲除和基因敲入，现推出如下技术服务：1. 应用CRISPR /Cas9提供稳定细胞系靶向基因敲除、敲入技术服务；2. 应用CRISPR /Cas9提供模式生物靶向基因技术服务，包括小鼠，大鼠，斑马鱼等；近几十年来，随着全基因组测序技术的不断成熟，我们在各种细菌和古细菌（archaea）中也陆续发现了很多成簇的、规律间隔的短回文重复序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeat sequences，即CRISPR序列，这就是二十多年前日本科学家发现的那个序列）和CRISPR相关基因（CRISPR-associated genes, Cas gene）。
研究发现，这些CRISPR序列与很多病毒或者质粒的DNA序列是互补的，说明这套CRISPR–Cas系统很有可能是生物体抵御病毒等外来入侵者的一套特异性防御机制，就好像是另外一套适应性免疫反应系统（adaptive immune system）。
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PCR法
PCR方法可以用来筛选基因打靶操作中的阳性克隆。
选择性地扩增发生同源重组的 DNA片段。先在靶载体 中插入neor基因使其突变，然后合成两个引物，它们分别 位于外源靶载体和与靶载体相接处的内源非同源序列上。 将G-418 抗性细胞克隆分别进行PCR。发生同源重组时， 由于两个引物分别从相对的两个方向同时扩增，结果是 DNA片段的拷贝数以指数式增加，得到已知长度DNA双链 片段。与之相反，在随机整合中，由于只有一个引物且为 单方向，所以扩增的片段拷贝数呈线性比例，片段为单链， 长度不定。
正相选择法
在基因敲除载体的目的片段中插入启动子缺失的正向选 择基因neor ，目的基因片段也不包含该基因的启动序列，再 嵌合入打靶载体中与靶位点同源的序列内，将打靶载体转染 进靶细胞，可能出现下面几种情况： 打靶载体不整合入靶细胞基因组，将随传代而丢失； 随机整合，由于neor基因缺失了其自身的启动子和起始码，整 合位点周围亦无启动子，使neor基因的表达受阻； 虽是随机整合，但其整合位点侧翼序列在其它基因的启动子 能启动neor基因的表达； 外源打靶载体与靶位点发生了同源重组，则neor基因可借助靶 基因自然存在的其和起始密码的作用而呈现表达活性。 用G418筛选，则抗性细胞中将只包含③④，根据基因组DNA 酶切图谱的不一致，用Southern印迹杂交可检测出同源重组的 克隆。
筛选方法的特点
PNS及PCR法是对任何靶基因的定点敲除都适用的两 种重要的方法，但它们都有不足之处。 PCR法缺乏直接的选择标记，运用PCR 法进行筛选 时，必须对每个细胞克隆分别进行扩增，因此较为费时费 力，工作量非常大。 PNS法可能是目前应用最广泛的方法，但PNS法要经 过2种药物筛选，有可能对ES细胞产生潜在的影响。 正向选择法适合于敲除那些在细胞中良好表达的基因。
选择筛选已击中的细胞：由于基因转移的同源重组自然 Байду номын сангаас生率极低，动物的重组概率为10-2～10-5，植物的概率 为10-4～10-5。因此如何从众多细胞中筛出真正发生了同 源重组的胚胎干细胞非常重要。 表型研究：通过观察嵌和体小鼠的生物学形状的变化进 而了解目的基因变化前后对小鼠的生物学形状的改变， 达到研究目的基因的目的。 得到纯合体：由于同源重组常常发生在一对染色体上中 一条染色体中，所以如果要得到稳定遗传的纯合体基因 敲除模型，需要进行至少两代遗传。
• 纯合体又称同型合子或同质合子。由两个基因型相同的配 子所结合而成的合子，亦指由此种合子发育而成的生物个 体。纯合体的同源染色体，在其对应的一对或几对基因座 位上，存在着完全相同的等位基因，如AA、aa、AABB、 AAbb、aaBB、AABBcc、aaBBcc等等，具有这些基因型的 生物，就这些成对的基因来说，都是纯合体。在它们的自 交后代中，这几对基因所控制的性状，不会发生分离。
载体构建
1. 2. 3. 获得目的基因（待敲除基因）的同源片段，将此ＤＮＡ 片段克隆到一般的质粒载体中； 从重组质粒中切除目的基因的大部分同源ＤＮＡ序列， 只留部分序列在线性质粒载体的两端； 将neo基因克隆到带有目的基因同源顺序的线性质粒中， 使之位于残留目的基因同源顺序的中间；
4.
在目的基因同源顺序的外侧线性化重组质粒载体，将Ｈ
基因敲除的影响因素
基因打靶的效率是指可检测到的细胞中发生同源重组的 细胞数与转染的细胞总数之比，又称同源重组效率。基因 打靶效率在不同的研究报道中变动范围较大，其波动性来 自较多的影响因素。
(1) 打靶载体的影响
同源片段的来源影响，尽量选择与靶细胞相同品系的基因 片段作为同源片段，可减少碱基错配。当载体同源序列长 度从4kb增加至9kb时，基因打靶效率增加10倍。研究发现， 同源序列达一定长度后，继续的增加对同源重组效率不产 生显著影响。
基因打靶技术的发展简史
• Joshua Lederberg由于在细菌中首先证实同源基因间重组的 原理而获得了1958年的诺贝尔奖。 • Capecchi和Smithies都首先预见到新的遗传物质可以通过同 源重组引入哺乳动物细胞的基因组，并对基因进行特异性 修饰和改造。 • 1980年，Capecchi报道用玻璃针将DNA直接注射入细胞核 可以显著提高基因转移的效率。
同源染色体交叉互换
• 同源重组是指发生在减数分裂或者有丝分裂过程中相同或 者相似DNA序列间的重组。它通常通过一对同源分子非姊 妹染色体间的断裂而产生新的重组片段。同源重组在进化 过程中高度保守。
• 胚胎干细胞（embryonic stem cell,ES）：胚胎干细胞是早期 胚胎（原肠胚期之前）或原始性腺种分离出来的一类细胞。 具有体外培养无限增殖、自我更新和多向分化的特性。 • 嵌合体：遗传学上用以指不同遗传性状嵌合或混杂表现的 个体。免疫学上则指一个机体身上有两种或两种以上染色 体组成不同的细胞系同时存在，彼此能够耐受，不产生排 斥反应，相互间处在嵌合状态。同一器官出现不同性状的 生物体。
• TK：胸苷激酶蛋白基因，可使无毒性的丙氧鸟苷（GANC） 转变为毒性核苷酸而杀死细胞，因而可用丙氧鸟苷筛选排 除随机整合的细胞株。
• HSV-tk：单纯疱疹病毒胸苷激酶基因，编码的酶蛋白，可 以使一些无毒或低毒的前药转化为强细胞毒性物质，杀死 肿瘤细胞。这些基因也被称为自杀基因。
同源重组基因敲除
• G418是一种氨基糖苷类抗生素 ，在分子遗传试验中，是 最常用的抗性筛选试剂。当neo基因被整合进真核细胞 DNA后，能启动neo基因编码的序列转录为ｍＲＮＡ ，从 而获得抗性产物氨基糖苷磷酸转移酶的高效表达，使细胞 获得抗性而能在含有Ｇ418的选择性培养基中生长。
• neo基因：是对新霉素（neomycin)的抗药基因。细胞表达 该基因可以灭活氨基糖甙类抗生素，破坏卡那霉素和新霉 素（原核生物）以及G418。
完全基因敲除
完全基因敲除是通过同源重组直接将靶基因在 细胞或者动物个体中的活性完全消除。 技术路线 基因载体的构建 ES 细胞的获得 同源重组 选择筛选已击中的细胞 表型研究 得到纯合体
打靶载体：基因载体包括载体骨架、靶基因同源序列和 突变序列及选择性标记基因等非同源序列，其中同源序 列是影响同源重组效率的关键因素。通常都包含有两段 与打靶目标位点两端同源的区域，中间一段不同源且为 目的序列，并带有某种药物筛选标记。
2．置换型载体(gene-replacement vector)：断裂位点位于 同源序列区域的外侧或两侧，选择基因位于同源目的序列 内部或外侧。基因重组时以载体的同源序列取代染色体靶 位序列，载体DNA 同源目的序列与染色体靶位点进行两 次同源重组。目前，大多数基因敲除实验都采用置换型载 体进行。
基因打靶的主要筛选策略
基因敲除
韩学凤
概念
• 基因敲除(gene knock-out)又称基因打靶，该技术通过外 源DNA与染色体DNA之间的同源重组，进行精确的定点修 饰和基因改造，具有专一性强、染色体DNA可与目的片段 共同稳定遗传等特点。它是在胚胎干细胞技术和同源重组 技术基础上发展起来的。 • 目前已成为一种较理想的改造生物遗传物质的实验方法。
• 1981年，Evans等和Marin分别报道从正常的小鼠囊胚中分 离了ES细胞。 • Evans等研究小组在1984年证实通过显微注射引入囊胚的 ES细胞可以分化为成体的各种组织并整合入生殖系。 • 1987年，Evans等和Monk等的研究小组在小鼠胚胎干细胞 中分别对次黄嘌呤磷酸转移酶基因(Hprt)的进行改造，并 获得了经生殖系遗传的突变小鼠。 • 1989年，真正通过同源重组获得的基因敲除小鼠诞生。
名词解释
• 同源染色体是指:一条来自父方，一条来自母方，形状，大小， 结构基本相同，且在减数第一次分裂时能两两配对(联会)的染 色体。 • 联会后的两条同源染色体,是经过染色体复制后的。即每条染 色体含有二条姐妹染色单体。二条染色体就含有四条染色单 体， 故叫四分体。 在配对(联会)的一对同源染色体中,由一个 着丝点相连的二条染色单体叫姐妹染色体单体。由不同着丝 点相连的染色单体，就叫非姐妹染色单体。 因此应该说在减 数第一次分裂时,联会(配对)的同源染色体中。既有姐妹染色 单体,也有非姐妹染色单体。
原理：利用DNA转化技术，将含有目的基因和靶基因同源
片段的重组载体导入靶细胞，通过载体与靶细胞染色体上 同源序列间的重组，将外源基因整合入内源基因组内，使 外源基因得以表达。通过研究靶细胞或者个体在目的基因 插入前后遗传特性的改变，达到研究基因功能的目的。
分类：
完全性基因敲除 条件性基因敲除 诱导性基因敲除
新霉素抗性基因Neo具有双重作用，一方面导致靶基因的 插入突变；同时作为重组细胞的正向筛选标志，该基因 产物可使细胞在含有新霉素的培养基中生长。 ES 细胞的获得：现在基因敲除一般采用是胚胎干细胞， 最常用的是鼠，而兔，猪，鸡等的胚胎干细胞也有使用。 常用的鼠的种系是１２９及其杂合体，因为这类小鼠具 有自发突变形成畸胎瘤和畸胎肉瘤的倾向，是基因敲除 的理想实验动物。
• 通过基因打靶技术可以对生物体基因组进行基因灭活、点 突变引入、缺失突变、外源基因定位引入、染色体组大片 段删除等修饰和改造，并使修饰后的遗传信息通过生殖系 遗传，使遗传修饰生物个体表达突变的性状。通过对遗传 修饰生物体的表型分析和机理研究，帮助人类理解生命现 象的本质、揭示疾病发生的机理、探寻疾病预防和诊疗的 有效方法。
• Capecchi随后证明同源重组可以发生在外源DNA和哺乳动 物细胞染色体的同源序列间。证明这种有缺陷的抗性基因 可以通过与外源DNA间的同源重组得到修复。
• 1985，Smithies实现了人工打靶载体和细胞染色体上β-球蛋 白基因间的同源重组。
• Whitten于1956年成功地使单细胞的受精卵在体外发育到囊 胚阶段。 • Brinster于1965年建立了微滴培养技术,用于着床前小鼠胚胎 的培养。 • Mclaren等对输卵管移植和子宫移植条件进行了优化,并最 终使得通过胚胎移植从体外培养的胚胎产生活的小鼠成为 一种常规的技术。 • Gardner（嘉德纳）建立了将分离的细胞注射入宿主囊胚获 得嵌合体小鼠的方法。