cre_loxp基因敲除系统教学文案
Cre鼠和loxp鼠繁殖策略
Cre鼠和loxp鼠繁殖策略
《Cre鼠和loxp鼠繁殖策略》
Cre鼠和loxp鼠是生物学家常用的基因编辑工具，它们的繁殖策略也是重要的研究内容。
Cre鼠是一种基因敲除动物，它的繁殖策略是先将其基因编辑，然后将其与普通小鼠进行
杂交，最后将杂交后的小鼠繁殖起来，从而获得纯种的Cre鼠。
Loxp鼠是一种可以控制基因的动物，它的繁殖策略是将其基因编辑，然后将其与普通小
鼠进行杂交，最后将杂交后的小鼠繁殖起来，从而获得纯种的Loxp鼠。
Cre鼠和Loxp鼠的繁殖策略相似，都是首先进行基因编辑，然后将其与普通小鼠进行杂交，最后将杂交后的小鼠繁殖起来，从而获得纯种的Cre鼠和Loxp鼠。
以上就是Cre鼠和Loxp鼠繁殖策略的基本介绍，它们的繁殖策略是生物学家研究的重要
内容，可以为生物学家在基因编辑研究中提供有用的参考。
[整理]基因敲除2教学讲义PPT课件
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➢ 选择筛选已击中的细胞：由于基因转移的同源重组自然 发生率极低，动物的重组概率为10-2～10-5，植物的概率 为10-4～10-5。因此如何从众多细胞中筛出真正发生了同 源重组的胚胎干细胞非常重要。
• 通过基因打靶技术可以对生物体基因组进行基因灭活、点 突变引入、缺失突变、外源基因定位引入、染色体组大片 段删除等修饰和改造，并使修饰后的遗传信息通过生殖系 遗传，使遗传修饰生物个体表达突变的性状。通过对遗传 修饰生物体的表型分析和机理研究，帮助人类理解生命现 象的本质、揭示疾病发生的机理、探寻疾病预防和诊疗的 有效方法。
• G418是一种氨基糖苷类抗生素 ，在分子遗传试验中，是 最常用的抗性筛选试剂。当neo基因被整合进真核细胞 DNA后，能启动neo基因编码的序列转录为ｍＲＮＡ ，从 而获得抗性产物氨基糖苷磷酸转移酶的高效表达，使细胞 获得抗性而能在含有Ｇ418的选择性培养基中生长。
• neo基因：是对新霉素（neomyc素，破坏卡那霉素和新霉 素（原核生物）以及G418。
➢ 同源重组：将重组载体通过一定的方式(电穿孔法 或显微注射)导入同源的胚胎干细胞(ES cell)中， 使外源DNA与胚胎干细胞基因组中相应部分发生 同源重组，将重组载体中的DNA序列整合到内源 基因组中，从而得以表达。一般地，显微注射优 点是外源基因转移率高，可直接用外源基因进行 转移；缺点是转移基因表达不稳定，技术难度较 大，效率低。电穿孔命中率比显微注射低，但便 于使用。
• TK：胸苷激酶蛋白基因，可使无毒性的丙氧鸟苷（GANC） 转变为毒性核苷酸而杀死细胞，因而可用丙氧鸟苷筛选排 除随机整合的细胞株。
• HSV-tk：单纯疱疹病毒胸苷激酶基因，编码的酶蛋白，可 以使一些无毒或低毒的前药转化为强细胞毒性物质，杀死 肿瘤细胞。这些基因也被称为自杀基因。
四环素诱导基因敲除敲入技术服务详解
四环素诱导基因敲除敲入技术服务详解Cre重组酶是一种位点特异性重组酶，能介导两个LoxP位点（序列）之间的特异性重组，使LoxP位点间的基因序列被删除或重组。
LoxP序列是由两个13bp反向重复序列和中间间隔的8bp序列共同组成，8bp的间隔序列同时也确定了LoxP的方向。
Cre在催化DNA 链交换过程中与DNA共价结合，13bp的反向重复序列是Cre酶的结合域。
Cre重组酶介导两个LoxP位点间的重组是一个动态、可逆的过程，可以分成三种情况：1.如果两个LoxP位点位于一条DNA链上，且方向相同，Cre重组酶能有效切除两个LoxP位点间的序列；2.如果两个LoxP位点位于一条DNA链上，但方向相反，Cre重组酶能导致两个LoxP位点间的序列倒位；3.如果两个LoxP位点分别位于两条不同的DNA链或染色体上，Cre酶能介导两条DNA链的交换或染色体易位。
另外，Cre不仅可以识别LoxP的2个13bp的反向重复序列和8bp的间隔区域，而且当一个13bp的反向重复序列或者8bp的间隔区发生改变时仍能识别并发生重组。
利用这一特点，人们在构建载体时可以根据需要改造LoxP位点序列，以用于特定的基因突变或修复，增加了该系统的应用范围。
诱导性基因敲除以Cre/loxp系统为基础，但却是利用控制Cre表达的启动子的活性或所表达的Cre酶活性具有可诱导的特点，通过对诱导剂给予时间的控制或利用Cre基因定位表达系统中载体的宿主细胞特异性和将该表达系统转移到动物体内的过程在时间上的可控性，从而在loxP动物的一定发育阶段和一定组织细胞中实现对特定基因进行遗传修饰之目的的基因敲除技术。
常见的几种诱导性类型如下：四环素诱导型；干扰素诱导型；激素诱导型；腺病毒介导型。
Cre-LoxP图：该系统包含两个互补系统，分别为tTA依赖和rtTA依赖的基因敲除系统，现在又被称为Tet―Off (tTA依赖)系统和T et―On (rtTA依赖)系统。
分子生物学课件：基因敲除
Neo gene Neor基因进入ES细胞的基因组 在G418、单核苷酸类似物的培养 基中，可以存活。
P53 gene Neo gene HSV-Tk
Neor基因和HSV-TK基因同时进入ES 细胞的基因组 在G418培养基中存活，但是含有单核苷 酸类似物培养基中死亡。
2
3A
3B
嵌合体
与阴性小鼠 交配
1
3D
基因敲除的 纯合子小鼠
杂合子小鼠
3C
扩展知识：
上述基因打靶策略虽然实现了目标基因的特异失活， 但基因组中引入了一个外源标记的基因（NeoR), 该基因会 影响机体正常的功能。怎么改进？
有些基因是胚胎生长发育过程中非常重要的基因，一旦被 敲除可导致胚胎发育受损甚至不能发育为一个个体, 针对这 类基因如何采用基因敲除技术进行研究呢？
➢ 如果Tk 基因进入细胞，在含单核苷酸类似物的培养基中生长时会 因为以上分解反应产生的有毒物质而死亡
筛选标志在这个过程中如何发挥作用的？
正负筛选系统பைடு நூலகம்作原理
1. 同源重组
10-5-10-6
Neo HSV-Tk P53 gene
ES cells
P53 gene P53基因被替换
2. 随机插入，非同源重组
如果基因组序列是：
123
待敲除基因
4
基因敲除载体的结构是：
LoxP
TK
4
LoxP
LoxP
Neo
•使待敲除基因位于两个LoxP位点之间
基本流程：
•条件性基因敲除载体的构建 •在ES细胞中进行第一次常规性基因敲除
Genomic DNA:
123
Cre／loxp重组系统在转基因植物中删除标记基因的应用
安徽 农 学 通 报 ， ｎ ｕ ｎ ｒ Ｓ ｉＢ ｌ ２ １ ，７ ０ ） Ａ ｈｉ ｇｉ ｅ ｕ１ ０ １ １ （ １ ． ． ．
Ｃ ｅ ｌ ｐ重 组 系 统 在 转 基 因 植 物 中 删 除 标 记 基 因 的应 用 ｒ／ｏ ｘ
郑 雪 琴
（ 建 师 范大 学 生 命 科 学 学 院 ， 建 福 州 福 福 ３ ００ ） ５ １８
ｇ ｎ ｃ Ｐｌｎｔ ｅ ｉ ａ ｓ
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＿＝ ・＿ ［ ］◆ －一
组 酶 来 获得 无 标 记 基 因的 转 基 因植 株 。
关键 词 ： ｒ ｌ ｐ Ｃ ｅ ｏ ；转基 因植 物 ；标 记基 因 ；基 因删 除 ／ ｘ
利用Cre-Lox系统如何制备条件性敲除小鼠
利用Cre-Lox系统如何制备条件性敲除小鼠Cre-Lox系统的优势在于可以利用组织特异性启动子特异性控制Cre在特定组织的表达，以实现在特定组织细胞中对目的基因的敲除或改造，更好的规避全身敲除小鼠的胚胎致死现象。
1. Cre鼠的类型及应用为了更好的控制Cre重组酶的表达时间，通过使用具有雌激素受体的突变配体结合结构域的Cre融合蛋白（Cre-ERT），可以实现对Cre活性的时间控制，该蛋白可以通过他莫昔芬诱导而被激活[1]。
在无他莫昔芬诱导时，Cre-ERT融合蛋白与热激蛋白Hsp90结合，定位于细胞质中；当他莫昔芬给药诱导时，Hsp90脱离Cre-ERT融合蛋白，使Cre-ERT融合蛋白暴露核定位信号进入细胞核，发挥基因重组的作用[3]。
这一融合蛋白的介入相当于为Cre-Lox系统加装了一个由他莫昔芬控制的外源开关，使得体内基因编辑更具时空灵活性。
为了提升该系统的灵敏性、特异性，ER配体结合结构域被进一步突变为Cre-ERT2，该系统对他莫昔芬代谢活性物质4-羟基他莫昔芬（TAM主要通过肝脏的细胞色素P450酶代谢为活性产物4-OH-TAM）的敏感性提升了10倍[4]。
同样的，Cre-ERT2并非完美无暇，Poorva Sandlesh等人研究发现CreERT2-Lox系统在敲除SSRP1的应用中，存在效率过低问题[5]。
Cre鼠常用于与Flox小鼠杂交进行条件性的目的基因敲除，但也有研究将Cre鼠用于切割位于报告基因前的终止序列，以达到荧光标记特定细胞的目的，进一步研究细胞命运。
2. Flox鼠与Cre鼠的配繁在实际应用中，通过不同的Flox鼠与Cre鼠的配繁可以实现多种研究目的，通过组织/细胞特异性Cre鼠敲除特定组织/细胞群体的特定基因是最为常见的一种。
F0代与野生鼠互配获得F1代杂合子，F1代杂合子（flox/+）互配得到F2代纯合子（flox/flox），F2代纯合子（flox/flox）与全身/组织特异性工具鼠交配获得F3代（flox/+, Cre），F3代（flox/+, Cre）互配得到F4代（flox/flox, Cre），即cKO/cKI纯合子。
条件性敲除小鼠
条件性敲除小鼠定义：条件性基因敲除小鼠（也叫Flox小鼠）是指在目的基因中含有成对的loxp位点的小鼠，与Cre工具小鼠交配后可在特定的组织或细胞中敲除目的基因。
CKO如何实现？重组酶系统（如：Cre-loxP）介导的位点特异性重组技术。
Cre是重组酶（38kDa），可识别34bp 长的DNA 序列loxP。
loxP 两侧各13bp 构成回文结构，中间8bp为非回文结构，因此loxp具有方向性。
（当DNA 分子上存在两个同向loxP 序列时，Cre可将两个loxP 序列之间的DNA 片段切出并环化，同时将loxP 两侧的序列进行连接；当DNA 分子上存在两个方向相反的loxP 序列时，Cre 可导致loxP 之间的序列发生反转。
）CKO敲除的是什么？条件性基因敲除的靶基因中必须带有可以被Cre 重组酶识别的loxP 序列，这种基因称为floxed gene。
带有floxed 靶基因的小鼠称为flox 小鼠。
在这种小鼠中，通常采用DNA 同源重组方法，在拟敲除基因片段的两侧分别放置一个同向的loxP 位点。
loxP 位点的存在应不影响该基因的功能，故选择对照为flox/flox小鼠CKO敲除何时何地发生？除了flox 小鼠以外，重组酶系统介导的条件性基因敲除还需要另一类重要的基因工程小鼠的参与——Cre 工具鼠。
Cre 工具鼠中，将Cre 重组酶的编码序列置于特定的基因启动子下，Cre 的表达特性决定了靶基因何时何地发生敲除。
Cre 在哪一种组织细胞中表达，靶基因的敲除就发生在哪种组织细胞；Cre 的表达水平将影响靶基因在此种组织细胞中进行修饰的效率；使用诱导型Cre 重组酶可以通过给予诱导剂，决定在特定的发育时期或疾病发生阶段，定时地进行基因敲除。
（范衡宇老师课件）实验时，将flox 小鼠和Cre 工具鼠进行交配，最后获得flox 纯合且Cre 杂合的小鼠。
在这类小鼠中，凡是表达Cre 的细胞，两个loxP 之间的序列被切除，从而实现组织特异性基因敲除。
利用Cre-LoxP系统删除转基因山羊体内的选择标记基因
兰翀 等/利用Cre/LoxP 系统删除转基因山羊体内的选择标记基因Chinese Journal of Biotechnology December 25, 2013, 29(12): 1847−1854 /cjbcn©2013 Chin J Biotech, All rights reservedReceived : March 10, 2013; Accepted : August 2, 2013Supported by : Program of Shanghai Technology Chief Scientist (No. 11XD1422000), Shanghai Technique Innovative Plan (No. 11431921400), Shanghai R&D Base Construction Projects (No. 10dz2251700).Corresponding author : Siguo Liu. Tel: +86-21-51380637; Fax: +86-21-58951012; E-mail: lsg@ *These authors contributed equally to this study.上海市科技术带头人 (No. 11XD1422000)，上海市“科技创新行动计划” (No. 11431921400)，上海市科委研发基地建设项目 (No. 10dz2251700) 资助。
网络出版时间：2013-10-09 网络出版地址：/kcms/detail/11.1998.Q.20131009.1942.001.html生物工程学报利用Cre/LoxP 系统删除转基因山羊体内的选择标记基因兰翀1,2*，任丽娜2*，吴敏1,2，刘思国2，刘国辉2，徐旭俊2，陈建泉2，马恒东1， 成国祥21 四川农业大学动物遗传育种研究所，四川 雅安 6250142 上海转基因动物育种与制药工程技术研究中心 上海杰隆生物工程股份有限公司，上海 201210兰翀, 任丽娜, 吴敏, 等. 利用Cre/LoxP 系统删除转基因山羊体内的选择标记基因. 生物工程学报, 2013, 29(12): 1847−1854.Lan C, Ren LN, Wu M, et al. Deletion of marker gene in transgenic goat by Cre/LoxP system. Chin J Biotech, 2013, 29(12): 1847−1854.摘 要: 在制备转基因家畜过程中的一个关键步骤是使用选择标记基因 (Selectable marker genes ，SMGs) 将转基因整合细胞从大量的正常细胞中筛选出来，这导致了SMGs 整合入家畜的基因组内持续传递给后代。
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（4）囊胚注射
小鼠的遗传背 景取决于ES和 囊胚细胞
（5）嵌合体小鼠
（6）品系纯化
纯合突变小鼠用来和Cre小鼠杂交，杂合突变小鼠保种 Loxp2小鼠品系建立完成
三、Cre工具鼠的构建
DNA显微原核注射，是指将外源DNA通 过显微注射的方法注射到受精卵的原 核内，注射DNA整合到小鼠受精卵的 基因组中，并稳定遗传给后代。
诱导性组织特异性Cre工具鼠的载体构建
MHC (cardiac-specific a-myosin heavy chain) Mer (mutated murine estrogen receptor ligand-binding do to 599, G525R)
同一染色体上含有同源序列的DNA分子之间或分子之内的重新组合。 在基因敲除小鼠制作过程中，需要针对目的基因两端特异性片段设 计带有相同片段的重组载体，将重组载体导入到胚胎干细胞后外源 的重组载体与胚胎干细胞中相同的片段会发生同源重组
同源重组示意图
一、Cre/Loxp系统
Cre重组酶（37℃）
➢ 位点特异性重组酶，介导loxp 位点间的序列同源重组
MerCreMer融合蛋白
该系统将雌激素受体(Estrogen Receptor,ER)的配 体结合区(ligand-binding domain,LBD)和Cre重组 酶进行融合，产生一种嵌合重组酶，该嵌合重 组酶的表达被置于特异启动子的调节之下，从 而使其在特定组织和器官或者特定发育阶段产 生。但是只有该嵌合重组酶并不能发挥Cre重组 酶的活性，因为雌激素受体结合区的存在使其 不能进入核内与loxP位点相结合。只有加入雌 激素后才能使其进入核内发挥作用。
二、基因敲除的基本流程
（1）打靶载体构建
Attention: Exon1 3N GT/AG
Conditional Knockout
（2）转化ES细胞
电转需要的细胞数量2-5x107
电穿孔或是显微注射方法将构 建好的打靶载体导入ES细胞
（3）阳性克隆筛选
➢ 随机整合 ➢ 定点整合 ➢ 没有整合
基因敲除 Knock Out
背景介绍
1981 年Evans 等首次在体 外分离和培养ES，成功建 立了小鼠胚胎干细胞系
1985 年Smithies最早在哺乳动物 细胞中发现并实现了同源重组
同源重组
Homologus Recombination
同源重组是指发生在姐妹染色单体（sister chromatin) 之间或
The End
D.S. Sohal, M. Nghiem. Temporally regulated and tissue-specific gene manipulations in the adult and embryonic heart using a tamoxifen-inducible Cre protein. Circ Res. 89:20-25 (2001).
➢ 70%重组率，无需辅助因子，多种 结构的DNA底物
Loxp site
➢ 34bp反向重复序列
Flp/Frt重组系统
P1噬菌体
（1）重组方式
（2）基因敲除机理
Offspring：50% heterozygous knockout after 1 generation
基因敲除机理 （续）
Offspring: 25% homozygous knockout after 2 generation