cre_loxp基因敲除系统解读

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Cre-loxP、CRISPR-Cas9技术与病毒载体在基因敲除中的联用

基因敲除技术在病毒感染性疾病治疗中的应用
基因敲除技术能够消除病毒复制所需的宿主细胞内基因从而阻止病毒的复制和感染。
基因敲除技术可以用于开发新型抗病毒药物通过抑制病毒复制或干扰病毒生命周期的关键环节来治疗病毒感染。
基因敲除技术可以用于基因治疗通过将正常基因导入宿主细胞替代缺陷基因恢复细胞功能达到治疗目的。
CRISPR-Cs9与病毒载体的联用
Cre-loxP技术用于控制基因表达
CRISPR-Cs9技术用于编辑基因
病毒载体在基因敲除中的重要作用
Cre-loxP、CRISPR-Cs9 技术与病毒载体的联用原理
三者联用的优势与挑战
优势：Cre-loxP、CRISPR-Cs9技术与病毒载体在基因敲除中的联用可以实现高效、精准的基因敲除有助于研究基因功能和疾病治疗。
基因敲除技术简介 Cre-loxP系统在基因敲除中的应用 CRISPR-Cs9系统在基因敲除中的应用病毒载体在基因敲除中的联用
基因敲除技术在癌症治疗中的应用
基因敲除技术能够精准地编辑人类基因为癌症治疗提供了新的手段。
通过敲除致癌基因或激活抑癌基因基因敲除技术可以有效抑制癌症细胞的生长和扩散。基因敲除技术在癌症治疗中具有个体化、精准化的特点可以降低治疗副作用和提高治疗效果。目前基因敲除技术在癌症治疗领域仍处于研究阶段但已取得了一定的成果和进展。
基因敲除技术还可以用于疫苗开发通过消除病毒基因中的关键位点降低病毒的毒力或致癌性从而开发出更安全、更有效的疫苗。
06
未来展望与研究方向
Cre-loxP、CRISPR-Cs9技术与病毒载体联用技术的发展前景
技术改进：随着基因编辑技术的不断进步CreloxP、 CRISPR-Cs9与病毒载体的联用技术将得到进一步优化提高敲除效率和应用范围。

一分钟看懂基因编辑神器「Cre-LoxP」

一分钟看懂基因编辑神器「Cre-LoxP」Q师弟小花师姐，我最近看到什么DO、DIO、FLEX系统的，据说都是Cre-LoxP系统，那么他们之间有什么差异啊？小花师姐师弟，要了解这三种系统的差异，我们首先必须先了解什么是Cre-LoxP系统。

Cre-LoxP系统是一种重组酶系统，能够控制基因组DNA中位点特异性重组的发生，被广泛应用于特异位点的基因敲除、基因插入、基因翻转和基因易位，可达到在基因水平上对生物体进行定向遗传改造的目的，其主要由Cre与LoxP两部分组成。

Cre是一种重组酶，于1981年从P1噬菌体中发现，属于λInt酶超基因家族。

Cre重组酶，能够特异性识别LoxP位点，使2个LoxP 位点之间的DNA进行精确的位点特异性重组。

LoxP则是位于P1噬菌体中的34bp序列，由两个13bp的反向回文序列和8bp的中间间隔序列共同组成，间隔序列决定了LoxP的方向。

LoxP位点的序列如下所示：其中，“N”表示可能变化的碱基。

通过高通量筛选，我们获得了不同的LoxP序列，如下表所示：不同LoxP位点序列表那么当Cre与LoxP相遇时，他们之间又将发生怎样的故事，使得Cre-LoxP系统名气大振呢？主要有以下三种情景哦~✫情景一当两个LoxP位点位于一条DNA链上但方向相反时，Cre重组酶能诱导两个LoxP位点间的序列翻转（图1A）；✫情景二当两个LoxP位点位于一条DNA链上且方向相同，Cre重组酶能有效地敲除两个LoxP位点间的序列（图1B）；✫情景三当两个LoxP位点分别位于两条不同的DNA链或染色体上，Cre 重组酶能诱导两条DNA链发生交换或染色体易位（图1C）。

图1 Cre-LoxP系统基本工作原理示意图However，从以上情景我们也可以看到在Cre酶存在时，A、B、C三种场景的变化其实是可逆的，那么该如何使这种动态变化达到一种稳定状态呢？如下图所示，通过引入两对不同的LoxP位点，经过两组LoxP点的两轮重组我们即可达到一种稳定状态。

cre-loxp系统在大脑特定区域进行基因敲除的原理

cre-loxp系统在大脑特定区域进行基因敲除的原理Cre-loxp系统是一种常用的基因敲除技术，用于特定区域的基因敲除。

该系统是通过两种转基因技术相互配合实现的，即Cre重组酶和loxp位点。

Cre重组酶是一种由细菌噬菌体产生的酶，能够识别和剪切含有loxp位点的DNA序列，从而实现特定区域的基因敲除。

Cre-loxp系统的原理如下：1. Cre重组酶的表达：首先，使用基因工程技术将Cre酶的编码基因嵌入到转基因小鼠的基因组中，使其能够在特定的组织或细胞类型中产生。

通过引入特定的启动子或组织特异性表达的促进子，可以实现Cre重组酶在目标组织或细胞中的表达。

2. 基因敲除载体：在目标基因的启动子或内含子区域，插入一对loxp位点。

loxp位点是一种特殊的DNA序列，约有34个碱基对，呈倒向重复，用于诱导Cre重组酶的作用。

3. Cre重组酶的介导：一旦Cre重组酶在目标组织或细胞中表达，它能够识别和结合含有loxp位点的DNA序列，并结合在loxp位点上。

Cre重组酶在loxp位点间发生酶活性，通过识别和切割这两个loxp位点间的DNA链，将目标基因位点裂解。

4. 基因敲除效应：一旦目标基因位点被裂解，无法继续正常转录和翻译，从而导致目标基因的敲除。

这样，就实现了在特定区域的基因敲除。

Cre-loxp系统具有以下特点和优点：1. 灵活性：Cre-loxp系统可以在不同的组织或细胞类型中实现基因敲除，由于Cre重组酶的表达是由特定启动子或组织特异性表达的促进子控制的，因此可以实现组织或细胞特定的基因敲除。

2. 高效性：Cre重组酶的催化作用很高效，能够在较短的时间内进行特定区域的基因敲除。

3. 精确性：Cre重组酶只能识别和剪切含有完整loxp位点序列的DNA链，因此能够实现精确的目标基因敲除，而不会对其他基因产生影响。

4. 可逆性：如果需要在特定的时期或特定的组织中恢复目标基因的表达，只需停止Cre重组酶的表达即可。

自学自讲(基因敲除)

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治疗措施研究方面的应用
急性排斥反应的半乳糖转移酶基因敲除, 用此方法培育的动物的器官可以移植到人体而无排斥反应。他们已成功培育半乳糖转移酶基因敲除猪, 且已经开展了将该基因敲除猪的心脏移植至狒狒体内的实验,经移植后的狒狒存活了 2 -6 个月( 均值为 78天),且均未出现超急性排斥反应的表现。
gene double knockout mice[ J] . FASEB J. 1999, 13( 6): 667-75.
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参考文献
[ 5 ] Leheste JR, Melsen F , Wellner M, et al.Hypocalcemia and osteopathy in mice with kidney-specific megalin gene defect[ J] .
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免疫学方面的应用
近年来,在免疫学方面出现了几十种免疫分子基因敲除动物模型, 将免疫学研究特别是免疫耐受的研究推到一个新的阶段。例如: TCR 基因敲除后 ,小鼠胸腺发育不全, 脾中 B 细胞增多 ; 免疫球蛋白 u链基因被敲除后 ,B 细胞发育受阻 ; MHC I 和 II 类抗原基因敲除后, 小鼠缺乏 CD4 +、CD8 +型 T 细胞; β2
insights on the pathogenesis of ocular albinism type 1[ J] .Hum Mol
Genet . 2000, 9( 19): 2781-2788. [ 4] Witting PK, Pettersson K, Ostlund-Lindqvist AM , et al.Inhibition by a coantioxidant of aortic lipoprotein lipid peroxidation and atherosclerosis in apolipoprotein E and low density lipoprotein receptor

基因打靶 cre-loxp重组酶系统

基因打靶基因打靶包括：胚胎干细胞的获得和培养、打靶载体的构建、重组ES细胞的筛选、嵌合体小鼠的制备、基因敲除小鼠的建立、Cre-loxP系统、FLP/FRT系统和条件性基因敲除、基因敲入和大规模ES细胞突变库的建立。

基本概念：1.基因打靶：是利用同源重组技术来定点改变物种的基因组顺序和结构，从而在突变的个体内来研究基因及基因组的功能。

2.基因敲除：是使用基因组中某个/某几个基因或基因的顺式元件产生缺陷，从而在突变体内。

3.丧生正常的功能，来推测这些基因或元件原来在体内的功能。

基因敲入：在个体基因组中定点加入某个/某几个基因或顺式元件，使之表达或发挥作用，从而研究该基因或顺式元件在体内的功能。

4.基因打靶技术是一种定向改变生物活体遗传信息的实验手段。

它的产生和发展建立在胚胎干细胞技术和同源重组技术成就的基础之上，并促进了相关技术的进一步发展。

自1987年早期胚胎干细胞技术建立及第一例基因剔除小鼠诞生以来，基因打靶的研究进展迅速，给现代生物学和医学研究带来了革命性的变化，并直接引发了现代生物学和医学研究各个领域中许多突破性的进展，成为后基因组时代研究基因功能最直接和最有效的方法之一。

一、胚胎干细胞的获得和培养基因打靶中用的小鼠ES细胞系有：D3、E14、R1、J1、CCE，均来源于129小鼠品系和其杂交品系（因为这类小鼠具有自发突变形成畸胎瘤和畸胎肉瘤的倾向，是基因敲除的理想实验动物）。

ES 623和B6-IIIES细胞系，来源于C57BL/6小鼠品系。

BALB/c-I，来源于BALB/c小鼠品系。

常用的饲养层细胞为PMEF（小鼠原代胚成纤维细胞。

PMEF需6 Gy的X 射线照射或丝裂霉素C处理细胞抑制生长后才能用作饲养细胞）。

建立ES细胞的过程中，最好采用只传了2-3代的原代小鼠胚胎成纤维细胞作为饲养细胞，所取得的ICM（内细胞团）只有10％-30％的几率建立ES细胞系。

一旦ES 克隆被确定，接下来应该考虑检查ES细胞的核型。

条件性基因敲除的基本原理Cre／loxP重组系统

条件性基因敲除的基本原理Cre／loxP重组系统条件性基因敲除的基本原理 Cre ／ loxP 重组系统条件性基因敲除主要是通过Cre／10xP或者Ftp／FRT重组系统来实现的。

这两个系统都是位点特异性重组酶系统，已发展成为在体内、外进行遗传操作的有力工具。

这两个系统的应用，可以使靶基因的表达或缺失发生在试验动物发育的某一阶段或某一特定的组织器官。

此外，若与控制Cre或Flp表达的其他诱导系统相结合，还可以对某一基因同时实现时空两方面的调控。

1．Cre／loxP系统的原理Cre／loxP系统来源于F1噬菌体，可以介导位点特异的DNA重组。

该系统含有两种成分：①一段长34bp的DNA序列，含有两个13 bp的反向重复序列和一个8 bp的核心序列。

这段34bp序列是重组酶识别的位点，被称为loxP位点(10cus of X―over in P1)。

②Cre重组酶(cyclizationrecombination)，它是一种由343个氨基酸组成的单体蛋白，可以引发loxP位点的DNA重组。

任何序列的DNA，当其位于两个loxP位点之间的时候，在Cre重组酶的作用下要么被缺失(两个loxP位点的方向相同)，要么方向发生倒转(两loxP位点的方向相反)，如图所示。

Cre／loxP系统的作用机制2．Cre／loxP系统优点Cre／10xP系统之所以在基因敲除中获得了非常广泛的应用，是由该系统的诸多优点决定的：①Cre重组酶与具有loxP位点的DNA片断形成复合物后，可以提供足够的能量引发之后的DNA重组过程，因此该系统不需要细胞或者生物体提供其他的辅助因子；②loxP位点是一段较短的DNA序列，因此非常容易合成；③Cre重组酶是一种比较稳定的蛋白质，因此可以在生物体不同的组织、不同的生理条件下发挥作用；④Cre重组酶的编码基因可以置于任何一种启动子的调控之下，从而使这种重组酶在生物体不同的细胞、组织、器官，以及不同的发育阶段或不同的生理条件下产生，进而发挥作用，这一点也是该系统在应用过程中最为重要的一点。

cre_loxp基因敲除系统解读

诱导性组织特异性Cre工具鼠的载体构建
MHC (cardiac-specific a-myosin heavy chain) Mer (mutated murine estrogen receptor ligand-binding domain amino acids 281 to 599, G525R)
MerCreMer融合蛋白
该系统将雌激素受体(Estrogen Receptor,ER)的配体结合区(ligand-binding domain,LBD)和Cre重组酶进行融合，产生一种嵌合重组酶，该嵌合重组酶的表达被置于特异启动子的调节之下，从而使其在特定组织和器官或者特定发育阶段产生。但是只有该嵌合重组酶并不能发挥Cre重组酶的活性，因为雌激素受体结合区的存在使其不能进入核内与loxP位点相结合。只有加入雌激素后才能使其进入核内发挥作用。
（1）打靶载体构建
Attention: Exon1 3N GT/AG
Conditional Knockout
（2）转化ES细胞
电转需要的细胞数量2-5x107
电穿孔或是显微注射方法将构建好的打靶载体导入ES细胞
（3）阳性克隆筛选

随机整合
定点整合没有整合
DTA(白喉毒素A亚基）
（4）囊胚注射
基因敲除 Knock Out
背景介绍
1981 年Evans 等首次在体外分离和培养ES，成功建立了小鼠胚胎干细胞系
1985 年Smithies最早在哺乳动物细胞中发现并实现了同源重组
同源重组
Homologus Recombination

同源重组是指发生在姐妹染色单体（sisபைடு நூலகம்er chromatin) 之间或

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MerCreMer融合蛋白
该系统将雌激素受体(Estrogen Receptor,ER)的配体结合区(ligand-binding domain,LBD)和Cre重组酶进行融合，产生一种嵌合重组酶，该嵌合重组酶的表达被置于特异启动子的调节之下，从而使其在特定组织和器官或者特定发育阶段产生。但是只有该嵌合重组酶并不能发挥Cre重组酶的活性，因为雌激素受体结合区的存在使其不能进入核内与loxP位点相结合。只有加入雌激素后才能使其进入核内发挥作用。
D.S. Sohal, M. Nghiem. Temporally regulated and tissue-specific gene manipulations in the adult and embryonic heart using a tamoxifen-inducible Cre protein. Circ Res. 89:20-25 (2001).
The End
P1噬菌体
（1）重组方式
（2）基因敲除机理
Offspring：50% heterozygous knockout after 1 generation
基因敲除机理
（续）
Offspring: 25% homozygous knockout after 2 generation
二、基因敲除的基本流程
小鼠的遗传背景取决于ES和囊胚细胞
（5）嵌合体小鼠
（6）品系纯化
纯合突变小鼠用来和Cre小鼠杂交，杂合突变小鼠保种 Loxp2小鼠品系建立完成
三、Cre工具鼠的构建
DNA显微原核注射，是指将外源DNA通过显微注射的方法注射到受精卵的原核内，注射DNA整合到小鼠受精卵的基因组中，并稳定遗传给后代。
（1）打靶载体构建
Attention: Exon1 3N GT/AG
Conditional Knockout
（2）转化ES细胞
电转需要的细胞数量2-5x107
电穿孔或是显微注射方法将构建好的打靶载体导入ES细胞
（3）阳性克隆筛选随来自整合定点整合没有整合
DTA(白喉毒素A亚基）
（4）囊胚注射
诱导性组织特异性Cre工具鼠的载体构建
MHC (cardiac-specific a-myosin heavy chain) Mer (mutated murine estrogen receptor ligand-binding domain amino acids 281 to 599, G525R)
同一染色体上含有同源序列的DNA分子之间或分子之内的重新组合。在基因敲除小鼠制作过程中，需要针对目的基因两端特异性片段设计带有相同片段的重组载体，将重组载体导入到胚胎干细胞后外源的重组载体与胚胎干细胞中相同的片段会发生同源重组
同源重组示意图
一、Cre/Loxp系统
Cre重组酶（37℃）位点特异性重组酶，介导loxp 位点间的序列同源重组 70%重组率，无需辅助因子，多种结构的DNA底物 Loxp site 34bp反向重复序列 Flp/Frt重组系统
基因敲除 Knock Out
背景介绍
1981 年Evans 等首次在体外分离和培养ES，成功建立了小鼠胚胎干细胞系
1985 年Smithies最早在哺乳动物细胞中发现并实现了同源重组
同源重组
Homologus Recombination

同源重组是指发生在姐妹染色单体（sister chromatin) 之间或