昆虫分子生态学

2.主要理论 主要理论
分子生态学是建立于群体遗传学理论、 分子进化理论和系统发生学理论等理论支 柱之上的实验性和理论性都很强的科学。 与之相关的一些主要理论有： （1）种群分化 （2）随机遗传漂变 （3）归祖理论 （4）中性理论 （5）哈德-温伯格理论
二．昆虫分子生态学的研究方法
昆虫分子生态学研究包括2个核心 部分，即分子标记的建立和分子数据 的获取。其中，分子标记的建立是及电泳 PCR反应在Hybaid热循环仪中进行，总反应体积 50µL：40.2µL超纯水、5µL 10×反应缓冲液（100 mmol/L Tris-HCl,pH8.3,500mmol/LKCl,15mmol/L MgCl2），0.8µL 10mmol/L dNTP混合液，25µmol/L正反引物各1.2µL，1µL 模板DNA，0.6µL GIBCOBRL Taq酶（5U/µL）。扩增ITS2 区段（两端含部分5S和28S序列）的引物为：TrichLSf-5′TTC TCG CAT CGA TGA AGA ACG-3′(forward)和TrichLSr5′-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3′(reverse)。PCR循环 程序为：97℃变性1min，接着进行35个循环：95℃变性 1min、50℃退火1min、72℃延伸2min，最后72℃延伸7min， 置于4℃保存。PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳分离， 1×TAE缓冲液（0.04mol/L Tris-acetate pH8.0,0.002mol/L Na2EDTA）100bpDNA Ladder 相对分子质量标准参照物， 电泳胶用溴化乙啶（EB）染色。
1.基本原理 基本原理
通过分子生物学的方法检测昆虫种群或个 体的遗传变异，分析和解释遗传变异的特点与 规律，揭示遗传变异所反映的规律性的东西， 从而进一步阐明昆虫之间以及昆虫与环境之间 的相互作用关系。 其研究的最典型特色是运用分子遗传标记 来检测研究对象的遗传变异特征，以揭示事物 所隐含的演化规律。
（4）克隆及测序 ） 电泳后，将约564 bp 的PCR产物割下，分别置于 1.5µL 离心管，采用DNA快速纯化试剂盒（Promega） 回收PCR产物，每样用25µL TEbuffer(10 mmol/L TrisHCl,pH8.0,1 mmol/L Na2EDTA)收集。连接反应使用5µL 回收DNA，载体为Pgem-T Vector System Ⅰ，操作按用 户指南。连接产物热激转化入感受态大肠杆菌细胞。阳 性克隆鉴定时，先纯化质粒，再用内切酶 BstZⅠ(Eco521)(Promega)进行酶切鉴定。酶切反应体积 20µL ，包括0.2-1.5µg DNA底物和内切酶，混合液37℃ 水浴3 h，用1 % 琼脂糖胶检测消化反应。最后将每板1-3 个阳性克隆测序（ABI PRISM,Model 377），采用 Pharmacia DNA测序试剂盒双脱氧链终止法。
常用于 ， 要求大量的DNA，通 要求大量的 ， 通过限制性内切 常用于mtDNA，效 果较好，也较为方便，常要求放射性标记探针， 酶能识别单个位 果较好，也较为方便，常要求放射性标记探针， 点的核苷酸差异、 点的核苷酸差异、有标准的探针以供比 只能分析单个或几个座 较之用。 相对较贵， 基因频率和碱基 较之用。 位，相对较贵，对技术 对差异。 与操作要求较高。 对差异。 与操作要求较高。 基因频率资料 只需要少量的DNA， 需要专一性引物。 ， 需要专一性引物。 只需要少量的 可以通过EB显色而 可以通过 显色而 不用放射性探针标记， 不用放射性探针标记， 相对便宜且比标准的 RFLP灵敏。 灵敏。 灵敏
1.分子标记的方法 分子标记的方法
①同工酶（蛋白质电泳技术）方法； ②限制性片段长度多态性（RFLP）方法； ③随机扩增DNA多态性（RAPD）方法； ④微卫星DNA和小卫星DNA标记方法； ⑤扩增片段长度多态性（AFLP）标记。
表1 昆虫分子生态学常用技术比较
技术名称 同工酶 （蛋白质电泳技 术） RFLP 区别水平及 所获得资料类型 氨基酸所带电荷 及电性，基因频 及电性， 率资料。 率资料。 优点 相对便宜， 相对便宜，已有的方 法较多，产生在生理 法较多， 上重要的共显性孟德 尔遗传。 尔遗传。 缺点 与DNA系列方法相比 系列方法相比 灵敏度较差，较多的试 灵敏度较差， 验数量局限于小型昆虫， 验数量局限于小型昆虫， 酶易受环境条件影响。 酶易受环境条件影响。
（5）地理种群序列间差异分析 ） 首先采用软件DNAMAN v.4.0 进行手工对比，并在 GenBank作BLAST搜索，然后用 另一个软件MegAlign，基于 Clustal 算法对ITS2进行遗传分歧 和相似性分析。Clustal方法通过 将所有序列进行两两对比计算其 距离，并将序列进行聚类。来自 同一个体的阳性克隆用作单个个 体内ITS2拷贝间序列差异分析。 （6）数据分析 ）
PCR-RFLP
RAPD
核DNA中单核苷酸 中单核苷酸 的变化，基因频率 的变化， 资料。 资料。
对已知的遗传信息较 少的种较为适用，频 少的种较为适用， 率高，相对便宜， 率高，相对便宜，只 要求少量的DNA. 要求少量的
浓度十分敏感， 对DNA浓度十分敏感， 浓度十分敏感 在PCR产物中不能提 产物中不能提 供任何遗传信息， 供任何遗传信息，重 复性较差， 复性较差，所做的标 记难以鉴定。 记难以鉴定。
以利用ITS2序列分析赤眼蜂不同地理种群的 遗传变异为例。
（1）样品采集 ） 将不同地方采集的赤眼蜂分装于1.5mL消毒微量离心 管中，置于-80℃保存待用。 （2）DNA提取 ） 提取 将单头预冻赤眼蜂置于预冷的1.5mL离心管，加入 20µL抽提缓冲液（200mmol/L Tris-HCl，pH8.0， 70mmol/L Na2EDTA，2 mol/L NaCl，20 mmol/L 偏重亚硫 酸钠），用微型研杵在冰浴中将昆虫研碎。再加5 µL 3% 十 二烷基肌氨酰钠溶液和5 µL 蛋白酶K，并混匀，置于56℃ 水浴2 h，接着用95-99℃加热10 min。所抽提的DNA置于20℃保存待PCR、克隆和测序。
DNA序列 序列
核DNA和mtRNA单 和 单 一核苷酸的差异； 一核苷酸的差异； 基因频率和碱基对 变化。 变化。 同RFLP
AFLP
2.遗传变异的检测方法 遗传变异的检测方法
从所揭示的遗传变异信息的类型和层次上 看，遗传变异的检测方法包括两大类： （1）序列分析 序列分析（sequence analysis） 序列分析 直接对DNA标记的核苷酸组成进行分析； （2）片段分析 片段分析（fragment analysis） 片段分析 通过检测多肽片段的长度或构象来区分不 同的基因型。 进行遗传变异的最基本的检测方法是电泳 技术。
小卫星DNA 小卫星 微卫星DNA 微卫星
同RFLP 个体和群体间核 DNA串联序列的差 串联序列的差 异。 鉴别力高、 鉴别力高、较快且较 相对较多的高纯分子 质量DNA，要求有标 ， 为便宜，能鉴定专一 质量 为便宜， 性定位点，专一性高， 记探针， 性定位点，专一性高， 记探针，相对较贵且 费时， 对复杂的交配系统尤 费时，难以获得可靠 其适用。 产物。 其适用。 的PCR产物。 产物 只需相对少量的DNA，费时费钱，，在技术 ，费时费钱，， 只需相对少量的 ，，在技术 上比PCR-RFLP和 和 分辨率高， 分辨率高，一些通用 上比 引物。 RAPD要求更高。 要求更高。 的PCR引物。 引物 要求更高 兼有RFLP的可靠性 相对较贵且费时，步 的可靠性 相对较贵且费时， 兼有 骤较繁。 的高效性， 与PCR的高效性，只 骤较繁。 的高效性 需少量的DNA且相对 需少量的 且相对 纯度要求不高，重复 纯度要求不高， 性比RAPD好，预先 性比 好 不必知道引物序列。 不必知道引物序列。
昆虫生态学
一．主要原理
•分子生态学是应用分子进化和群体遗传学的理论、 分子生物学的技术手段、系统发生学和数学的分析 方法以及其他学科的知识（如地学、古气候学等） 去研究种群、进化、生态、行为、分类、生物地理 演化、生物保护等学科领域的各种问题。它主要通 过大量使用分子生物学先进的技术和方法，在分子 水平上研究生态现象，阐明生态现象的分子机制。 •昆虫分子生态学就是以昆虫为研究对象，应用分 子生态学的原理与方法研究昆虫进化与适应机制的 一门学科。
谢 谢 ！
三．昆虫分子生态学研究内容
（1）由于昆虫迁飞、扩散或外来种、地理隔离的 昆虫种群在分子水平上的遗传多样性及遗传结构； （2）昆虫种群的生物型； （3）昆虫—植物相互作用的分子机理； （4）昆虫抗药性分子机理； （5）昆虫对环境适应（如耐寒性）的分子机理。
四．昆虫分子生态学的应用
1.昆虫地理种群的遗传变异分析 2.昆虫生物型差异的分子特征 3. 3.昆虫嗅觉的分子识别 4.昆虫与共生菌互作的分子机制
昆虫分子生态学的 主要原理与研究方法
陈 川
昆虫生态学（ 昆虫生态学（Insect ecology） ）
以昆虫为 研究对象，研 究昆虫及其周 围环境相互关 系的科学。它 是昆虫学和生 态学的分支学 科。
按研究对象的层次分类： 按研究对象的层次分类：
昆虫分子生态学 昆虫生理生态学 昆虫种群生态学 昆虫群落生态学 生态系统生态学