蛋白粉
乳清蛋白粉中蛋白质纯度的探究
蛋白粉，一般是采用提纯的大豆蛋白、或酪蛋白、或乳清蛋白、或上述几种蛋白的组合体构成的粉剂，其用途是为缺乏蛋白质的人补充蛋白质。目前，市场上销售的蛋白粉品牌众多，价格各异，有的品牌声称蛋白质含量高达80%以上，因此，我们要用科学的方法来测定其准确含量，以保护消费者的权益不受侵害。此文将采用传统经典的凯氏定氮法，通过单因素试验，正交试验等对其测定过程进行探究，得出了最佳消化条件，硫酸钾为12.5g，硫酸铜为0.5g，浓硫酸为10 mL。进而在最佳消化条件下，我们又得出了，在消化液变绿色澄清后继续消化45min时测
定，所测定的蛋白质含量最高。
关键词：蛋白质；检测；凯氏定氮
引言
乳清蛋白粉是采用先进工艺从牛奶分离提取出来的珍贵蛋白质，以其纯度高、吸收率高、氨基酸组成最合理等诸多优势被推为“蛋白之王”。乳清蛋白不但容易消化，而且还具有高生物价、高效化率、高蛋白质功效比和高利用率，是蛋白质中的精品。含有人体所需的所有必需氨基酸,其氨基酸组成模式与骨骼肌中的氨基酸组成模式几乎完全一致，极其容易被人体所吸收。乳清蛋白也是最丰富的天然支链氨基酸的来源，支链氨基酸有助于延缓运动疲劳,减少肌肉损伤,促进肌肉合成和缓解运动后的疼痛。由于其含丰富的β-乳球蛋白，α-乳白蛋白，免疫球蛋白，乳铁蛋白等营养物质，所以特别适应于健身健美爱好者、运动员、需美容者、身体瘦弱者、极易疲劳者、孕妇及哺乳期妈妈、生长发育期的少年儿童、手术康复者、贫血、高血压及其它慢性病人以及素食者。
缺乏蛋白质会对人体产生危害。譬如：对疾病的抵抗力差，体弱多病；体力下降，精神萎靡不振，易疲劳；当蛋白质摄入不足时，会出现新细胞生成速度缓慢，生长发育迟缓、体重减轻、身材矮小、智力低下、心脏及神经性疾病；缺乏蛋白质会引起腺体分泌紊乱，导致内分泌失调，并且会引起脸外侧长痘；缺乏蛋白质会导
致手术、创伤、骨折、病后恢复缓慢、伤口不易愈合；缺乏蛋白还会导致睡眠质量差，记忆力衰退。因此摄入丰富的蛋白质具有众多功效，如提供身体构造新组织所需的氨基酸，延缓人体衰老；在体内制造酶，改善肠胃功能；为免疫系统制造对抗细菌和感染的抗体；调节体内的水分、电解质平衡，增强机体抗疲劳能力；向细胞输送氧和各种营养物质，加速机体修复。
近年来，随着科学技术的发展，一些新的检测得以出现，为蛋白粉中蛋白质含量的检测提供了众多方法，但是有很多没有得以广泛的应用，现阶段仍以凯氏定氮法为主。因此，我们通过对经典方法的采用，来做一下探究，以及通过实验条件的干扰，得到最佳的测定条件。
第一章绪论
1.1乳类制品的概述
乳制品（dairy products）以生鲜牛（羊）乳及其制品为主要原料，经加工制成的各种食品，也叫奶油制品。其营养极其的丰富，根据考古学家的推测，早在12000年前，人类就开始驯服牛作为家畜，并把牛奶作为重要的食物来源。
牛乳中蛋白质含量约为2.8～3.6%，主要由酪蛋白和乳清蛋白组成，酪蛋白约占总蛋白的80%，乳清蛋白中包含有重要的免疫球蛋白：IgG、IgA、IgM，我们常能在婴儿奶粉的广告中听到说添加了IgG免疫因子，就是添加了免疫球蛋白，其主要功能是对幼子提供免疫保护。牛乳中蛋白质含有20种以上的氨基酸，包括了人体所必须的全部8种必需氨基酸，消化率可高达98%，是人类摄取优质蛋白很好的食物来源。乳中碳水化合物以乳糖最为重要，乳糖是婴幼儿及动物幼子哺乳期的营养的主要来源。乳糖分解的糖是构成脑神经系统中脑磷脂成分，与婴儿出生后脑的迅速生长有密切关系。但是有些人在幼年的时可正常饮用牛乳，随着年龄的增长，対乳的摄入量越来越少，导致体内缺乏乳糖分解酶，饮用牛乳后，乳中的乳糖不能被分解和吸收，出现呕吐、腹胀、腹泻等不适应的症状，这种现象称为乳糖不耐症。牛乳中钙的含量也非常的高，每100ml中约含有120mg的钙，同时食品中钙的来源以乳及乳制品最好，特别是经发酵的乳（酸奶）可提高钙、磷和铁的利用率，更有
利于钙的吸收，是理想的钙源。维生素是维持正常生命活动必不可少的一类营养素，而牛乳中含有人体所需的各种维生素，种类比较齐全，像维生素A、维生素D、核黄素等含量都比较高。因此奶类及乳制品都是高蛋白食物，长期的食用可增加人体的抵抗力，免疫力，同时也可以增加肌肤的紧致新和弹性。对于改善睡眠质量也能起到一定作用。还有对于胃不好的人应该多吃一些，它可以养胃及起到一定的修复作用。
1.2乳品行业的发展现状及检测方法
乳品行业近几年来发展十分迅速，其运营及发展的能力超过了大大超过了食品制造业。但是，物极必反，随着近几年出现的大头娃娃，三聚氰胺等事件，从不同的侧面反映出我国的乳品行业在行业管理、质量标准体系、产品质量等方面出现的落后、不健全、良莠不齐等问题，使目前我国的乳业发展受到了制约。乳清蛋白是牛乳中最为重要的部分，它可以成为衡量乳制品蛋白含量的一个重要指标。目前，国际上对乳品中蛋白质含量的检测方法主要有凯氏定氮法，即传统的燃烧法，消化法。分光比色法，即考马斯亮蓝G250法，双缩脲法，紫外吸收法等[1]。其中凯氏定氮法与紫外吸收法是常用的经典方法，并且这些方法得到了同行的一致认可。1.2.1反相高效液相色谱法
反相高效液相色谱[2] (Reversed Phase High Performance Liquid Chromatog raphy，RPHPLC)分离蛋白质主要是基于蛋白质的氨基酸侧链与色谱介质的疏水表面即固定相的可逆疏水相互作用。进行RPHPLC分离的首要条件是水溶液,即使蛋白质和静止相周围形成高度有序的水相结构，伴随着蛋白质与固定相的结合,蛋白质会暴露于溶液的疏水表面逐渐变少,此时水相有序性会降低，进而体系的熵值也增加，在该溶液条件下,蛋白质结合到RPHPLC柱的固定相上。随后，改变流动相的组分可以使结合的蛋白质分别洗脱到流动相中。可见蛋白质被洗脱下来的次序是由其疏水性的强弱决定的，因此疏水性最弱的蛋白质最先被洗脱下来，随后是疏水性较强的蛋白。1.2.2高效毛细管电泳法
毛细管电泳也被称为高效毛细管电泳，是以内径20-200nm的柔性毛细管柱作为分离通道、以高压直流电场为驱动力，对各种小分子、大分子以致细胞等进行高效分离、检测或微量制备等的有关技术的总称。毛细管电泳有许多种分离模式，其中毛细管区带电泳(CZE)分离是基于样品中各组分间荷质比的差异，具有更多优点。
例如，不需要高压注射缓冲液、操作简单、缓冲液价格低廉和选择性分离效果好等。20世纪90年代以来，毛细管电泳由于其自动化高、速度快等优点被广泛的用于蛋白的分析与研究。Miralles等人[3]用CE法对乳中变性的β-乳球蛋白和对位-κ-酪蛋白进行了分离和定量测定，并研究了pH值、尿素浓度、柠檬酸浓度、电压等因素对试验结果的影响，结果表明该法可在30min完成乳制品中变性β-乳球蛋白和对位-κ-酪蛋白的定量检测。
1.2.3傅立叶转换红外线法
傅立叶转换红外线(fourier transform infrared,FTIR)法是将收集到的干扰图纹转化为光谱，优点在于：高信噪比、高能量,能在全波段进行快速扫描。基于该方法开发的仪器AegysMi600在欧洲、美国、澳大利亚的8个不同实验室的独立评价表明：该仪器的准确度和标准偏差均达到了AOAC的要求[4]。1996年，Lefier等人[5]使用傅立叶转换红外光谱分析法对原料奶中的粗蛋白和真蛋白含量进行测定，并与凯氏定氮法( IDF 20)进行比较，这2种方法测定粗蛋白、真蛋白含量的标准差(SD)分别为0.042%、0.065%和0.048%、0.035%。从2种方法的性能参数可知，傅立叶转换红外光谱分析法检测结果的精确度与凯氏定氮法接近。
1.2.4凯氏定氮法
测定化合物或混合物中总氮量的一种方法。即在有催化剂的条件下，用浓硫酸消化样品将有机氮都转变成无机铵盐，然后在碱性条件下将铵盐转化为氨，随水蒸气馏出并为过量的酸液吸收，再以标准碱滴定，就可计算出样品中的氮量。由于蛋白质含氮量比较恒定，可由其氮量计算蛋白质含量，故此法是经典的蛋白质定量方法。该方法是先将样品在硫酸铜存在下，以浓硫酸在加热的条件下使蛋白质分解，释放出铵根离子，铵根离子与NaOH作用放出NH3，用硼酸吸收后再以硫酸或盐酸标准溶液滴定，根据酸的消耗量乘以换算系数，即为蛋白质含量[6]。
1.2.5紫外吸收法
蛋白质分子中的酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，使蛋白质具有吸收紫外光的性质。当吸收峰在280nm时，其吸光度值与蛋白质含量成正比。此外，蛋白质溶液在238nm的光吸收值与肽键含量成正比[7]。利用一定波长下，蛋白质溶液的光吸收值与蛋白质浓度的正比关系，可以进行蛋白质含量的测定，所以此法的特点是简便、灵敏、快速；但测定蛋白质含量的准确度较差，干扰物质较多，
样品中的嘌呤、嘧啶及核酸等吸收紫外光的物质会出现较大的干扰，溶液的pH也会影响测定结果。
第二章实验部分
2.1实验试剂和仪器
2.1.1实验试剂
表2-1 试剂
T able 2-1 Agentia
药品名称生产厂家
乳清蛋白粉美国某品牌
氢氧化钠（分析纯）上海科帆化工科技有限公司
硼酸（分析纯）莱阳经济技术开发区精细化工厂
盐酸（分析纯）莱阳经济技术开发区精细化工厂
95%乙醇（分析纯）莱阳经济技术开发区精细化工厂
碘化钾（分析纯）天津市恒兴化学试剂制造有限公司
氯化汞（分析纯）天津市恒兴化学试剂制造有限公司
CuSO4.5H2O(固体)（分析纯）天津市恒兴化学试剂制造有限公司
氯化铵（分析纯）天津市北方天医化学试剂厂
K2SO4(固体)（分析纯）天津市恒兴化学试剂制造有限公司
2.1.2实验仪器
表2-2仪器
T able 2-2 Instrument
仪器名称生产厂家
电子万用炉北京市永光明医疗仪器厂
T203电子天平北京赛多利斯仪器系统有限公司
凯氏定氮装置自制
2.2实验方法
2.2.1凯氏定氮法
（1）实验原理
①蛋白质属于含氮的有机化合物，我们把蛋白质样品与浓硫酸和混合催化剂混合，一起加热消化，蛋白质会慢慢的分解，生成胺基，胺基与硫酸结合会生成硫酸铵。
反应式为：H2SO4=SO2+H2O+[O]
R.CH.COOH+[O]=R.CO.COOH+NH3
R.CO.COOH+[O]=nCO2+mH2O
2NH3+H2SO4=(NH4)2SO4
②然后在碱性条件下进行蒸馏，目的使铵根变为游离的氨，紧接着用硼酸吸收。
反应式为：2NH4++OH-=NH3+H2O
NH3+H3BO3=NH4++H2BO3-
③再用酸的标准溶液滴定，用酸的消耗量乘以换算系数（乳制品的换算系数为
6.38[8]），从而得到蛋白质的含量。
反应式为：H2BO3-+H+=H3BO3
（2）主要试剂的配制
①混合催化剂：无水硫酸铜和硫酸钾分别研碎,按一定的比例混合均匀。
②40%氢氧化钠：化学纯400g氢氧化钠溶于1000mL无氨蒸馏水中。
③2%硼酸：分析纯20g硼酸溶于1000mL无氨蒸馏水中。
④混合指示剂：把溶解于95%乙醇的0.1%溴甲酚绿溶液5份和溶于95%乙醇的0.l %甲基红溶液1份混合而成。
⑤0.1mol/L盐酸：分析纯8.3mL盐酸定容至1000mL, 通过无水碳酸钠标定。
称0.15～0.22ｇ在270～300℃灼烧至衡重的基准无水碳酸钠，放入250ml锥形瓶中，以50ml蒸馏水溶解，加溴甲酚绿－甲基红混合指示剂10滴，用0.1mol／L 盐酸溶液滴定至溶液由绿色变为暗红色，加热煮沸3分钟，冷却后继续滴定至暗红色为终点，平行测定三次。
（3）消化实验
由于实验室缺乏凯氏定氮装置，并且原有的装置消化时间比较长，环境污染较严重，因此我们在传统凯氏定氮法的基础上，对消化过程中的装置及消化时间进行改进研究。
将原微量凯氏定氮法需要固定的凯氏烧瓶换成不需要固定的250mL锥形瓶[9]，准确称取2.000克乳清蛋白粉于锥形瓶中，再加入若干毫升浓硫酸与数克硫酸铜、硫酸钾混合催化剂，同时做空白试验。待溶液混合均匀后，把锥形瓶置于电子万用炉上，在瓶口连接一倒置的长颈漏斗，顶部用玻璃导管连接，出口用橡胶管通入碱性溶液中（注意倒吸）。仪器安装好后，放入通风橱内，打开电炉，缓慢加热。开始温度不要太高，待瓶内溶液碳化后，逐步升温至溶液沸腾，继续消化一段时间，当瓶内液体呈蓝绿色透明时，保持微沸的状态加热一段时间，等消化彻底后，冷却，定容至100mL容量瓶中，待用。
（4）蒸馏实验
①蒸馏装置的改装
原实验装置图[10]：
1.安全管，
2.导管，
3.汽水分离管，
4.样品入口，
5.塞子，
6.冷凝管，
7.吸收瓶，
8.隔热液套，
9.反应管，10.蒸汽发生瓶。
1
10
图 2-1 蒸馏装置图
Fig. 2-1 Installation drawing
由于实验条件有限，缺少凯氏定氮装置，因此，我们在原有的基础上，做了一些改装。改装图如下：
图 2-2 蒸馏改装图
Fig. 2-2 Distillation modified figure
②蒸馏
装好定氮蒸馏装置之后，向水蒸汽发生器内加入2/3的水，再加入几粒沸石，甲基红乙醇溶液10滴及2毫升硫酸，确保溶液呈酸性，插上电源，使水沸腾。向吸收瓶内加入20ml硼酸和几滴混合指示剂，把冷凝管的下端插入液面下。准确吸取3mL试样处理液由漏斗注入反应室，以15mL水洗涤小玻杯并使之流入反应室内,再将15ml氢氧化钠加入反应室，随后用止水夹夹紧橡胶管。开始蒸馏，蒸馏20min 后移动蒸馏液接收瓶，液面离开冷凝管下端，再蒸馏2min。然后用少量水冲洗冷凝管下端外部，取下蒸馏液接收瓶。
（5）滴定实验
将接收到的蒸馏液用盐酸标准溶液滴定，当发现颜色由酒红色变成绿色时为滴定终点，同时作试剂空白实验，分别记录消耗盐酸的用量。
（6）计算方法[11]
123()0.0140
100/100
V V C X F m V -??=
??? 公式2-(l)
式中：
X
－试样中蛋白质的含量，单位为克每百克g/100g
1V －试液消耗硫酸或盐酸标准滴定液的体积，单位为毫升
mL
2V －试剂空白消耗硫酸或盐酸标准滴定液的体积，单位为毫升mL
3V －取消化液的体积，单位为毫升
mL
m －试样的质量，单位为克g
F －氮换算为蛋白质的系数，为
6.38
2.2.2紫外吸收法
（1）实验原理
样品与硫酸和催化剂一同加热分解，蛋白质分解的氨与硫酸生成硫酸铵，硫酸铵与纳氏试剂在碱性情况下生成黄棕色的化合物，在最大吸收波长为420 nm 下，吸光度与氨浓度符合朗勃-比耳定理，据此进行定量。结果乘以换算系数，计算样品中蛋白质的含量。
（2）实验方法 ①绘制标准曲线
吸取0.01mg/mL 的标准液0.0、0.5、1.00、2.00、3.00、5.00、7.00、10.00ml 分别于50ml 比色管内，加水至标线，分别加入1.0mL 酒石酸钾钠溶液，1.5mL 纳氏试剂，混匀。放15min 后，在波长420nm 处，用光程为10mm 的比色皿，以水为参比，测定其吸光度。由测得的吸光度，减去零浓度空白管的吸光度后，得到校正吸光度，绘制以氨氮含量(mg)对校正吸光度的标准曲线。
②样品的测定
取样品消化液2ml 稀定容至100ml ，取50mL 的样品稀释液于50ml 比色管内，分别加入1.0mL 酒石酸钾钠溶液，1.5mL 纳氏试剂，混匀。放置15分钟后，进行
测定，同时做试剂空白试验。
（3）计算方法[12]
X( g/100g) = m1×6. 38×100. 0×100÷2 .00 公式2-(2)
式中：
X—样品中蛋白质含量
m1—根据标准曲线计算测定用样品消化液中的氨氮量(g)
第三章 结果与讨论
3.1盐酸标准溶液的标定
三组平行试验所得的数据如下表所示：
表3-1 滴定结果
T able 3-1 Titration consequence
试剂 1号 2号 3号 4号 碳酸钠／克 0.1662 0.1786 0.2071 0 盐酸／毫升
33
35
45
3
盐酸标准滴定溶液的浓度按下式[13]计算：
10()0.0530
H C l m
C V V =
-? 公3-(l)
式中：
H C l C —盐酸标准溶液的浓度mol/L
m —基准无水碳酸钠的质量g
1V —盐酸溶液的用量mL
0V —空白试验中盐酸溶液的用量mL
0.0530— 1/2Na 2CO 3毫摩尔质量g/mmol 计算结果如下：
表3-2 标定结果
T able 3-2 Demarcate consequence
1号 2号 3号 平均值 浓度（mol ／L ） 0.104
0.105
0.093
0.1006
3.2单因素实验
消化过程所使用的催化剂是硫酸钾与硫酸铜的混合物。其中硫酸钾能提高溶液的沸点，加快有机物的分解，并且与浓硫酸作用生成的硫酸氢钾可以提高反应温度，但是，硫酸钾加入量太大会使消化环境的温度过高，从而引起铵盐的损失；硫酸铜不仅能当催化剂，而且还可以作为消化终点的指示剂。但由于催化剂及浓硫酸的比例不确定，会导致消化时间过长，从而会对环境造成污染。而且，不同文献所提供的硫酸铜与硫酸钾的比例不同，有1:10,1:15,1:15,1:20,1:25,1:30等[14]。因此，我们就其不同的比例进行消化实验，以消化液变为绿色透明为终点，找出最短消化时间，得出最佳消化条件。
（1）固定硫酸铜与浓硫酸的用量，通过改变硫酸钾的量来对比消化时间。试验结果如下：
表3-3 消化时间对比试验
T able 3-3 The contrast test of digestion time
硫酸铜（g）浓硫酸（ml）硫酸钾（g）消化时间（min）
1 0.5 20 0.5 120
2 0.5 20 5 100
3 0.5 20 7.5 90
4 0.
5 20 10 85
5 0.5 20 12.5 60
6 0.5 20 15 70
图3-1 硫酸钾的量对消化时间的影响
Fig. 3-1 K 2SO 4 content on the effectof digestion time
由表3-3和图3-1可知，在浓硫酸为20ml ，硫酸铜为0.5g ，硫酸钾为12.5g 时，所用的消化最短时间为60min 。
(2) 固定硫酸铜与硫酸钾的量，改变浓硫酸的量进行消化对比试验，结果如下：
表3-4 消化时间对比试验
T able 3-4 The contrast test of digestion time
硫酸铜（g ）
浓硫酸（ml ）
硫酸钾（g ）
消化时间（min ）
1 0.5 20 10 85
2 0.5 15 10 72
3 0.5 10 10 65 4
0.5
8
10
60
0.5, 120
5, 100
7.5, 90
10, 85
12.5, 60
15, 70
20
40
60 80 100 120 140 0
2
4
6
8 10
12
14
16
K 2SO 4/g
T /m i n
续表3-4
5 0.5
6 10 55 6
0.5
5
10
60
图3-2 浓硫酸的量对消化时间的影响
Fig. 3-2 Sulfuric acid content on the effect of digestion time
由表3-4和图3-2可以看出，在浓硫酸为6ml 时，硫酸钾用量为10g ，硫酸铜为0.5g 时所用的消化最短时间为55min 。
(3)固定硫酸钾与浓硫酸的量，改变硫酸铜的量进行消化实验，结果如下：
表3-5 消化时间对比试验
T able 3-5 The contrast test of digestion time
硫酸铜（g ）
浓硫酸（ml ）
硫酸钾（g ）
消化时间（min ）
1 0.1 10 12.5 65 2
0.2
10
12.5
60
20, 85
15, 72
10, 65
8, 60
6, 55
5, 60 40
45 50 55 60 65 70 75 80 85 90 0
5
10
15
20
25
H 2SO 4/ml
T /m i n
续表 3-5
3 0.25 10 12.5 58
4 0.3 10 12.
5 55 5 0.4 10 12.5 50 6
0.5
10
12.5
45
图3.3 硫酸铜的量对消化时间的影响
Fig. 3-3 Copper sulphate content on the effectof digestion time
由表3-5与图3-3可得，在浓硫酸为10 ml ，当硫酸钾用量为12.5g ，硫酸铜为0.5g 时所用的最短消化时间为45min 。
(4)通过以上试验，我们得出，在样品质量为2g 的前提下，硫酸铜的量为0.5g ，硫酸钾的量为12.5g ，浓硫酸用量为6ml 的条件下，所用消化时间最短，为最佳消化条件，可以缩短整个凯氏定氮过程的试验时间。
0.1, 65
0.2, 60
0.25, 58
0.3, 55
0.4, 50
0.5, 45
40 45
50
55
60 65 70
0.1
0.2
0.3 0.4
0.5
0.6
CuSO 4/g
T /m i n
3.3 正交试验
通过单因素实验，得出了单个因素的最适条件，但是还不确定消化时间的各因素之间是怎样相互影响的。为此，我们把硫酸铜的量（A），硫酸钾的量（B），浓硫酸的量（C）, 3个可能有交互影响的因素进行了3因素，3水平的L9( 3)3正交试验，因素水平设计见下表：
表3-6 试验因素水平
T able 3-6 Factors and lelves
水平因素A
K2SO4(g)
因素B
CuSO4.5H2O(g)
因素C
H2SO4(mL)
1 2 3
6
12.5
10
0.2
0.5
0.25
15
6
10
表3-7 正交试验结果
T able 3-7 The consequence of orthogonal test
试验号 A B C 消化时间/min
1 6 0.
2 15 65
2 6 0.5 6 60
3 6 0.25 10 55
4 12.
5 0.25
6 45
5 12.5 0.5 10 42
6 12.5 0.25 15 50
7 10 0.2 10 52
8 10 0.5 15 43
9 10 0.25 6 46
R1 180 162 158
R2 137 145 151
R3 141 151 149
R1／3 60 54 52.66
R2／3 45.66 48.33 50.3
R3／3 47 50.3 49.6
优水平A2 B2 C3
续表3-7 R 13 5.67 3.06
因此，由正交试验结果看出，各因素对消化时间的影响是有差异的。各因素的优水平为：CuSO4.5H2O为0.5g，K2SO4为12.5g，浓H2SO4为10mL。优水平组合为A2B2C3，主次顺序为A﹥B＞C。硫酸铜与硫酸钾的比例与单因素试验的结果符合，但是浓硫酸的用量有差异。
3.4 验证实验
根据正交试验得出的结果，我们取最优水平进行三组平行消化实验，同时做空白试验。实验结果如下表：
表3-8 实验结果
T able 3-8 T est consequence
1 2 3 平均时间
T／min 42 40 43 41.66
因此，通过验证试验可得，以最优水平消化，消化时间为41.66min，可以大大缩短测定时间。
3.5蛋白质含量的测定
3.5.1 蛋白质含量测定可行性研究
由于我们对实验装置自行进行的改装，因此需要对其可行性与准确性进行研究，所以，我们对任意一组消化样品分别通过紫外吸收法和凯氏定氮法来进行测定，对其结果做一下对比。
（1）紫外吸收法测定结果
①氨氮标准曲线的绘制：
表3-9 吸光度
T able 3-9 Absorbtion
续表 3-9
标液体积(ml) 0.00 0.50 1.00 2.00 3.00 5.00 7.00 10.00 吸光度（扣除空白）
0.0000
0.0150
0.0291
0.0579
0.0918
0.1593
0.2252
0.3560
图3-4 氨氮标准曲线 Fig. 3-4 The standard curve
②样品的测定
表3.10 样品吸光度
T able 3-10 The absorbtion of sample
编号
1 2 3 吸光度（扣除空白） 4.9443 5.2344 5.0567 氨氮质量（μg ）
1414.885
1497.771
1447.000
利用公式2-(2)计算可得：
y = 0.0035x - 0.0078
R 2 = 0.9949
-0.05
0 0.05
0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.35 0.4 0
20
40
60 80
100
120
quality/μg
a b s o r b a n c e
表3.11 蛋白质含量
T able 3-11 Protein content
编号 1 2 3 平均X（g/100g）45.53 47.78 46.16 46.49
（2）凯氏定氮法测定结果
实验结果如下：
表3-12蛋白质含量
T able 3-12 Protein content
编
号V1（mL）V2（mL）V3（mL）蛋白质含量X(g/100g)
平均值
X(g/100g)
1号 4.26 1.25 3 44.548
44.99
2号 4.32 1.25 3 45.436
3号 4.29 1.25 3 44.992
由表3-11和表3-12中数据可知，3组测定结果的平均值相对平均偏差为1.479％，说明这两种方法的测定结果的偏差较小，有较好的一致性，继而说明了我们改装的实验仪器是可行的。
3.5.2测定结果的分析
由于实验的要求，样品消化液在变蓝绿色透明之后需继续加热一段时间，对于这一段时间，有不同的说法，譬如有继续加热20min，30min，60min等[15]~ [17] 。因此，我们在最佳消化条件下，以样品消化液变透明绿色之后分不同的时间段开始计时，测定不同时间段对测定结果的影响。我们分四个时间段，在每个时间段取三个样，同时做空白试验。结果如下：
表3-13蛋白质含量
T able 3-13 Protein content
时间/min V1（mL）V2（mL）V3（mL）蛋白质含量X(g/100g)
平均值
X(g/100g)
15 4.20 1.20 3.00 44.400
44.795 4.22 1.20 3.00 44.696
4.26 1.20 3.00 4
5.288
表3-14蛋白质含量
T able 3-14 Protein content
时间/min V1（mL）V2（mL）V3（mL）蛋白质含量X(g/100g)
平均值
X(g/100g)
30 4.26 1.15 3.00 46.028
46.324 4.28 1.15 3.00 46.324
4.30 1.15 3.00 46.620
表3.15蛋白质含量
T able 3-15 Protein content
时间/min V1（mL）V2（mL）V3（mL）蛋白质含量X(g/100g)
平均值
X(g/100g)
45 4.34 1.18 3.00 46.768
47.015 4.35 1.18 3.00 46.916
4.38 1.18 3.00 47.360