连续稀释分离法
微生物的分离和纯培养无菌技术无菌技术
连续培养：在微生物培养的过程中，不 断地供给新鲜的营养物质，同时排除含菌 体及代谢产物的发酵液，让培养的微生物 长时间地处于对数生长期，以利于微生物 的增殖速度和代谢活性处于某种稳定状态。 连续培养理论基础：由于对典型生长曲 线中稳定期到来原因的认识，采取相应有 效措施推迟其来临，从而发展出现在的连 续培养技术。
连续培养原理 当微生物在单批培养方式下生长达到对 数期后期时，一方面以一定的速度流进新 鲜培养基并搅拌，另一方面以溢流方式流 出培养液，使培养物达到动态平衡，其中 的微生物就能长期保持对数期的平衡生长 状态和稳定的生长速率。
连续培养和单批培养的比较
连续流入 新鲜培养液 单批培养 恒浊法
lg细胞数（个/ml）
4、选择性培养分离法 为了从混杂的微生物群体中分离出某种 微生物，可以根据该微生物的特点，包括 营养、生理、生长条件等，采用选择培养 的方法进行分离。 利用选择培养基进行直接分离 富集培养
三、微生物的培养
1、好氧培养和厌氧培养 好氧培养以空气为氧的来源。实验室 的培养方法用平皿培养和斜面培养；工业 生产时用自然对流和机械通风法来供氧； 液体培养时微生物利用培养液中的溶解氧； 液体三角瓶培养时利用摇床机达到供氧的 目的；发酵罐培养时用通入无菌压缩空气 达到供氧的目的。
微生物的分离和纯培养
一、无菌技术
无菌技术：是将微生物分离、转接及培 养时防止被其它微生物污染的技术。 1、对使用的器皿及用具的灭菌 2、对培养基的灭菌 通常使用的方法有高温蒸汽灭菌和高 温干热灭菌，效果达到无菌（不含任何微 生物)。
3、无菌的环境 （1）在操作过程中的无菌要求：接种、 分离过程的无菌效果（在火焰上部进行操 作）。 （2）在超净工作台、无菌室和无菌箱中 进行操作。使用甲醛、紫外线、75%的乙 醇等进行预处理及其他的必要措施。 （3）如进行好氧培养需对空气进行处理， 实验室用多层纱布、棉塞和硅胶塞过滤空 气，工业中使用空气过滤器过滤空气。
四大类微生物菌落形态的比较和识别
四大类微生物菌落形态的比较和识别一、实验目的和内容目的：1 熟悉四大类微生物菌落的主要特征2 掌握识别四大类微生物菌落形态的依据和要点，并应用于识别未知菌落内容：1 观察已知的四大类微生物菌落特征2 辨认未知的四大类微生物菌落特征实验原理掌握识别四大类微生物菌落形态的要点对于从事菌种的筛选、杂菌的识别和菌种鉴定等项工作都有重要意义。
菌落是由某一微生物的少数细胞或孢子在固体培养基表面繁殖后所形成的子细胞群体，因此，菌落形态在一定程度上是个体细胞形态和结构在宏观上的反映。
由于每一大类微生物都有其独特的细胞形态，因而其菌落形态特征也各异。
在四大类微生物的菌落中，细菌和酵母菌的形态较接近，放线菌和霉菌形态较相似。
菌和酵母菌的异同细菌和多数酵母菌都是单细胞微生物。
菌落中各细胞间都充满毛细管水、养料和某些代谢产物，因此，细菌和酵母菌的菌落形态具有尖似的特征，如湿润、较光滑、较透明、易挑起、菌落正反面及边缘、中央部位的颜色一致，且菌落质地较均匀等。
它们之间的区别如下：细菌：由于细胞小，故形成的菌落也较小，较薄、较透明且有“细腻”感。
不同的细菌会产生不同的色素，因此常会出现五颜六色的菌落。
此外，有些细菌具有特殊的细胞结构，因此，在菌落形态上也有所反映，如无鞭毛不能运动的细菌其菌落外形较圆而凸起；有鞭毛能运动的细菌其菌落往往大而扁平，周缘不整齐，而运动能力特强的细菌则出现更大、更扁平的菌落，其边缘从不规则、缺刻状直至出现迁居性的菌落，例如变形杆菌属和菌种。
具有荚膜的细菌其菌落更粘稠、光滑、透明。
荚膜较厚的细菌其菌落甚至呈透明的水珠状。
有芽孢的细菌常因其折光率和其他原因而使菌落呈粗糙、不透明、多皱褶等特征。
细菌还常因分解含氮有机物而产生臭味，这也有助于菌落的识别。
酵母菌：由于细胞较大（直径约比细菌大10倍）且不能运动，故其菌落一般比细菌大、厚而且透明度较差。
酵母菌产生色素较为单一，通常呈矿蜡色，少数为橙红色，个别是黑色。
微生物分离纯化的方法
微生物分离纯化的方法微生物分离纯化的方法是一种将复杂微生物混合物分离为纯化菌株的过程。
这是研究微生物多样性，发现新的微生物物种，以及从微生物中获得新的代谢产物等研究领域的关键步骤之一、以下是几种常见的微生物分离纯化的方法：1.常规分离法：常规分离方法是一种最常用的微生物分离技术。
该方法基于微生物菌落形态和特性的观察和比较，通过选取和分离菌落来获取纯化的微生物。
常见的常规分离方法包括移植法、罐培养法和环扩散法等。
2.筛选培养基：筛选培养基是通过优化微生物的培养条件，选择能够选择性生长其中一特定微生物的培养基。
这种方法常用于分离特定类型的微生物，例如革兰氏阳性菌、细菌等。
常见的筛选培养基包括含有特定抗生素、特定营养物质或特定pH值的培养基。
3.稀释分离法：稀释分离法是一种通过连续稀释样品来使微生物单个分离的方法。
首先，将样品连续稀释，然后在培养基上接种稀释液，并进行培养。
稀释分离法适用于稀释样品中含有少量微生物的情况，可以帮助分离纯化微生物。
4.毛细管扩散法：这是一种通过毛细管将微生物分离到培养基上的方法。
首先，将培养基注入玻璃毛细管中，并将其将培养基表面用火焰加热，使其与空气接触。
然后，将毛细管插入样品中，微生物通过毛细管扩散到培养基中。
这种方法使用较少的培养基和试剂，能够直接从样品中获得纯化的微生物。
5.细胞分离技术：细胞分离技术是通过分离微生物细胞来纯化微生物的方法。
这种方法包括细胞离心、滤膜分离和凝胶过滤等。
通过这些方法，可以将微生物细胞从细胞混合物中分离出来，从而获得纯化的微生物。
以上是几种常见的微生物分离纯化的方法。
根据具体的实验目的和样品特点，可以选择合适的方法进行微生物的分离纯化。
这些方法在微生物研究和应用中起着至关重要的作用，有助于深入了解微生物的多样性和功能。
微生物菌种分离和鉴定技术
微生物菌种鉴定技术
表征（表型）特征 形态特征 生理和代谢特征 生态特征
遗传（基因型）特征 蛋白质比较 核酸碱基组成 核酸序列
分子标尺
多相鉴定技术 Polyphasic Identification
新型显色培养基：
利用微生物自身代谢产生的酶与相应显色底物反应显色的原理来检测微生物 的培养基 。
微生物快速分离、计数方法
Petrifilm Plate (3M)
微生物快速分离、计数方法
3M Petrifilm Plate
Aerobic Count Plate Coliform Count Plate Rapid Coliform Count Plate E. coli /Coliform Count Plate Enterbacteriaceae Count Plate Yeast and Mold Count Plate Staph. aureus Express Count Plate Environmental Listeria Plate
单细胞（孢子）分离
选择培养基分离
传统选择性培养基
血平板：适于各类细菌的生长，一般细菌检验标本的分离，都应接种此平板。 巧克力血平板：其中含有V和X因子，适于接种疑有嗜血杆菌、奈瑟菌等的标
本。 中国蓝平板或伊红美蓝平板：可抑制革兰阳性细菌，有选择地促进G-菌生长，
是较好的弱选择性培养基。 麦康凯平板：具中等强度选择性，抑菌力略强，有较少革兰阴性菌不生长。 SS琼脂：有较强的抑菌力，用于志贺菌和沙门菌的分离。 碱性琼脂：用于从粪便中分离霍乱弧菌及其它弧菌。 血液增菌培养基：用于从血液、骨髓中分离常见病原菌。 营养肉汤：用于标本及各类细菌的增菌
土壤、水质检测——放线菌、霉菌、大肠杆菌的分离方法
土壤、水质检测——放线菌、霉菌、大肠杆菌的分离方法微生物因为体积小、质量轻、适应性强、繁殖能力强等特点，广泛分布于自然界中。
它们存在于食品、化妆品、饲料、环境等人们能触及的各个角落中。
某些微生物对产品的污染，不仅影响到产品本身的质量，更严重的是它危及消费者的健康和安全。
科标检测研究院凭借多年的微生物检测经验，可提供快速、高效、权威的第三方微生物检测服务，赢得社会业内广泛认可。
主要针对食品、医药、化妆品、农产品、一次性产品以及工业产品等进行微生物检测以及产品微生物污染分析。
以下介绍几种菌的分离方法：一、从土壤中分离放线菌1.制作高氏一号培养基，趁热注入培养皿中，凝成平板，待用。
2.称取土壤10克，放入装有100毫升无菌水的锥形瓶中，并加入10%酚10滴，以抑制细菌生长。
振荡10分钟，制成10-1菌悬液。
按照连续稀释分离法，进一步制成10-3菌悬液。
3.用移液管吸取0.1毫升10-3菌悬液，注入平板培养基上，用无菌玻璃刮刀将菌悬液均匀涂抹在整个培养基上。
然后将培养皿倒置于25-30℃温箱中，培养7-10天，培养基上会出现微生物菌落。
如果菌落的硬度较大，干燥致密，且与基质紧密结合，不易被针挑起，这就是放线菌菌落。
4.挑取放线菌菌落，接种于斜面培养基上。
二、从土壤中分离霉菌1.制作豆芽汗葡萄糖培养基，并添加80%乳酸数滴，以抑制细菌生长。
将培养皿中，凝成平板，待用。
2.称取10克土壤，按上述分离放线菌的方法制成10-4或10-5的菌悬液。
3.取0.1毫升菌悬液注入培养皿内培养基上，用玻璃刮刀涂抹均匀。
然后将培养皿倒置于2 5-30℃温箱内培养3-4天。
培养基上会出现微生物菌落。
霉菌菌落常长成绒状、棉絮状或蜘蛛网状，可根据这一特征寻找霉菌菌落。
4.挑取培养皿内的霉菌菌落接种于斜面培养基上三、从饮水中分离大肠杆菌1.制作伊红美蓝培养基，趁热注入培养皿中，凝成平板，待用。
2.用灭过菌的锥形瓶盛取河水或沟水，按1:10稀释。
菌落分离纯化的方法
菌落分离纯化的方法
菌落分离纯化是微生物学中常用的一种方法，用于从混合培养基中分离出纯种细菌。
以下是一些常见的菌落分离纯化方法：
1. 灭菌分液法，将混合培养基均匀涂布在琼脂平板上，培养后在形成的菌落中选择单个菌落，用接种环在无菌条件下转移到新的琼脂平板上，经过培养后得到纯种菌落。
2. 稀释分液法，将混合培养基连续稀释后，在琼脂平板上均匀涂布，使得每个菌落都来自于单个细胞，然后进行培养，最终得到纯种菌落。
3. 过筛法，将混合培养基均匀涂布在琼脂平板上，培养后用无菌玻璃珠滚动在菌落上，使得每个菌落只有一个细胞，然后用接种环转移到新的琼脂平板上培养，得到纯种菌落。
4. 挑拣法，在混合培养基上直接挑选出单个菌落，然后用接种环转移到新的琼脂平板上培养，得到纯种菌落。
这些方法都可以用于分离纯化菌落，选择合适的方法取决于具
体的实验要求和操作技能。
值得注意的是，在进行菌落分离纯化时，需要严格遵守无菌操作规范，以避免外源微生物的污染。
分离接种实验报告
一、实验目的1. 学习和掌握微生物分离接种的基本原理和方法；2. 熟悉微生物纯种培养技术；3. 提高无菌操作技能。
二、实验原理微生物分离接种是微生物学实验中的一项基本操作，其主要目的是从混杂的微生物群体中分离出所需的纯种微生物。
实验原理主要包括以下两个方面：1. 稀释分离法：通过将微生物群体在适宜的培养基上进行稀释，使每个稀释度内仅含有一个或几个微生物细胞，然后选取单菌落进行培养，从而达到分离纯化的目的。
2. 选择培养法：根据微生物对特定条件的适应性，选择合适的培养基和培养条件，使所需的微生物生长繁殖，而抑制其他微生物的生长，从而实现分离纯化。
三、实验材料1. 菌种：金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草芽胞杆菌等；2. 培养基：牛肉膏蛋白胨固体培养基、琼脂糖固体培养基、液体培养基等；3. 试剂：无菌水、无菌生理盐水、无菌酒精、无菌接种环等；4. 仪器：无菌操作台、酒精灯、接种环、接种针、显微镜等。
四、实验步骤1. 准备工作（1）将无菌操作台、酒精灯、接种环、接种针等实验器材进行消毒处理；（2）将牛肉膏蛋白胨固体培养基和琼脂糖固体培养基在无菌条件下进行配制，并倒入培养皿中，待凝固后备用；（3）将金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草芽胞杆菌等菌种在无菌条件下进行复苏，并制备成菌悬液。
2. 微生物分离接种（1）稀释分离法① 取无菌接种环，蘸取菌悬液，在牛肉膏蛋白胨固体培养基平板上进行划线；② 重复上述操作，使菌悬液在平板上形成一系列平行线；③ 将平板倒置，放入37℃恒温培养箱中培养24小时；④ 观察菌落生长情况，选取单菌落进行纯化培养。
（2）选择培养法① 将菌悬液接种于琼脂糖固体培养基平板上；②在平板上加入适量抗生素，使平板成为选择培养基；③ 将平板倒置，放入37℃恒温培养箱中培养24小时；④ 观察菌落生长情况，选取单菌落进行纯化培养。
3. 纯化培养（1）将单菌落挑取至新的牛肉膏蛋白胨固体培养基平板上；（2）将平板倒置，放入37℃恒温培养箱中培养24小时；（3）观察菌落生长情况，确认纯化成功。
微生物纯种的分离方法
微生物纯种的分离方法自然界中的微生物总是杂居在一起，即使一粒土或一滴水中也生存着多种微生物。
要研究其中的某一种微生物，首先必须将它分离出来。
下面介绍几种纯种微生物的分离方法。
平板划线分离将已经熔化的培养基倒入培养皿中制成平板，用接种环沾取少量待分离的材料，在培养基表面平行或分区划线(图5-5)，然后，将培养皿放入恒温箱里培养。
在线的开始部分，微生物往往连在一起生长，随着线的延伸，菌数逐渐减少，最后可能形成纯种的单个菌落。
液体稀释法将待分离的样品经过大量稀释后，取稀释液均匀地涂布在培养皿中的培养基表面，培养后就可能得到单个菌落。
利用选择培养基进行分离不同的微生物对不同的试剂、染料、抗生素等具有不同的抵抗能力，利用这些特点可配制出适合某种微生物生长而限制其他微生物生长的选择培养基。
用这种培养基来培养微生物就可以达到纯种分离的目的。
菌丝尖端切割这种方法适于丝状真菌。
用无菌的解剖刀切取位于菌落边缘的菌丝的尖端，将它们移到合适的培养基上培养后，就能得到新菌落三、细菌的分离与计数（一）背景知识介绍1.细菌的分离与纯化自然界的细菌总是以杂居的方式存在，如土壤、水、空气等都分布着种类繁多的细菌。
我们如何知道这些杂居的细菌是哪种细菌呢？这就需要将这些带菌的材料中混杂的细菌，经过稀释，使其分散成单个存在的菌体，在固体培养基平板上，长成肉眼可见并具有一定特征的菌落。
这些菌落分离出来，进行纯培养。
所谓纯培养即在一个培养物中，所有的细菌都是由一个细菌分裂繁殖而产生的后代。
这种获得单一菌株纯培养的的方法称为细菌的分离。
常用的分离方法有稀释法和划线法。
（二）课题提出：我们的身体和周围的环境有大量的细菌，细菌与我们的生活和健康密切相关。
但是，自然存在的细菌都混杂在一起，我们要想研究和了解各种细菌的形态结构和功能，就要对其进行分离纯化，才能进行深入的研究。
如对一些致病菌的研究，食品卫生的研究，微生物工业的研究等。
在研究过程中，有时需要调查和检测细菌密度，则需要统计细菌的数量。
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连续稀释分离法
①取1克土样，在火焰旁放入装有99毫克无菌水的锥形瓶内，充分摇匀，将菌分散。
②用移液管吸取上述菌悬液1毫升，放入盛有9毫升无菌水的试管中，并进一步稀释成1000倍，即10-3的菌悬液。
按10倍稀释法连续稀释到10-8（每1次稀释，都须更换移液管）。
③取3支1毫升移液管分别从10-8、10-7、10-6菌悬液中吸取1毫升菌悬液，分别注入编号10-8、10-7和10-6的培养皿内，同一稀释液重复做3个培养皿。
④将温度为45～50℃的营养琼脂培养基倒入上述各培养皿内，轻轻旋转使菌悬液充分混合均匀，凝固后，将培养皿倒扣放置在温暖处（28℃左右），每天观察培养基表面有无微生物菌落。
⑤经过一定时间培养后，培养基上长出菌落，根据菌落特征，初步判断属于何种类型的微生物，并在显微镜下检查，若菌体形态一致，则可认为是初步分离到纯菌种。
⑥将分离培养所得的纯菌种，从平板培养基转移到试管斜面培养基上培养。