2016试剂间统计表
医疗机构制剂发展计划表
医疗机构制剂发展计划表1、医疗机构制剂使用情况:我院医疗机构制剂全部由本院制剂室生产和供应，2012—2016年品种数逐渐减少，从14种减少到6种，使用数量和销售金额在2012—2015年基本保持稳定，2016年大幅下降，缩减为6个品种；2017年开始，我院制剂室关停，从本市他院进行医疗机构制剂的调剂以满足本院临床需求，临床使用医疗机构制剂的品种数上升到17个品种，使用数量和销售金额也较2012—2016年均有较大增长，见表1。
2、医疗机构制剂品种分布:从表2可以看出，2012—2017年我院医疗机构需求较大的品种是氯化钾口服溶液、复方薄荷脑滴鼻液、复方硫磺洗剂（类似于白色洗剂）、氧化锌洗剂（类似于氧化锌软膏）、复方硫酸新霉素滴鼻液、呋喃西林滴耳液、硼酸溶液、碳酸氢钠滴耳液、水杨酸醇滴耳液。
3、医疗机构制剂使用科室分布:2012—2017年期间，我院医疗机构制剂使用数量共计115 537支，排名前十的科室使用数量之和为115 048支（瓶），占99.58%；其中，皮肤科与耳鼻咽喉科使用数量之和为104 025支，占90.04%，其余使用量较大的科室分别为普内科、普外科、急救部外科，见表3。
一、讨论：4、医疗机构制剂的供需矛盾分析：从表1及表2的结果可知，我院2012—2017年临床对于医疗机构制剂的需求是没有得到满足的，尤其是2012—2016年，随着《医疗机构制剂配制质量管理规范》（GPP）和制剂室换证工作的深入开展，对制剂软、硬件要求越来越规范和严格，我院制剂室因软、硬件投入不足与狭窄的临床应用及利润空间的不平衡，加上较大的人力成本，长期处于亏损状态，不得不一再缩减医疗机构制剂品种和产量，2016年底由于制剂室设备故障得不到维修或更换，就此关停制剂室。
而2017年全年，我院从重庆市中医院进行医疗机构制剂的调剂，供应品种增加到17个品种，销售数量和销售金额相较于此前最大的一年仍有约30%的增加（已考虑药品零加成的影响），说明我院临床科室对于医院制剂的需求在2017年以前一直未达到饱和状态，对医院制剂的产能需求大概在每年2.2万支（瓶），产值需求每年大概在16万元（以目前的价格测算），充分说明此前我院临床科室对于医疗机构制剂的需求远远没有得到应有的满足。
体外诊断试剂申报资料要求及常见问题
体外诊断试剂注册申报资操作规范的通知（12号）》中对申报资 料的基本要求规定，申报资料格式应当符合下列要求：
（1）申报资料应有所提交资料目录。 （2）申报资料应当按目录顺序排列并装订成册。 （3）申报资料一式一份，其中产品技术要求一式两份，
资料申报前需准备的事项-产品分类
体外诊断试剂类产品在《体外诊断试剂注册管理办法》中对分类的规定如下： 第十七条 根据产品风险程度由低到高，体外诊断试剂分为第一类、第二类、第
三类产品。 （一）第一类产品
1.微生物培养基（不用于微生物鉴别和药敏试验）； 2.样本处理用产品，如溶血剂、稀释液、染色液等。 （三）第三类产品 1.与致病性病原体抗原、抗体以及核酸等检测相关的试剂； 2.与血型、组织配型相关的试剂； 3.与人类基因检测相关的试剂； 4.与遗传性疾病相关的试剂； 5.与麻醉药品、精神药品、医疗用毒性药品检测相关的试剂； 6.与治疗药物作用靶点检测相关的试剂; 7.与肿瘤标志物检测相关的试剂; 8.与变态反应（过敏原）相关的试剂。
国家食品药品监督管理总局关于发布医疗器械注册证补办程序等5个相关工作程 序的通告（2015年第91号）
国家食品药品监督管理总局关于发布医疗器械注册指定检验工作管理规定的通告 （2015年第94号）
基本法律法规及知识储备的重要性
食品药品监管总局关于执行医疗器械和体外诊断试剂注册管理办法有关 问题的通知（食药监械管〔2015〕247号）
MPX V2.0试剂在血液核酸筛查中的应用
MPX V2.0试剂在血液核酸筛查中的应用高犁;钱惠忠;许友山;胡越;夏卫【摘要】目的：通过与MPX V1.0试剂的比对，评估罗氏诊断公司MPX V2.0试剂在血液筛查中的可行性和适用性。
方法在罗氏Cobas核酸检测平台上，分别使用MPX V1.0或MPX V2.0试剂对9418人次HBsAg、抗-HCV、抗-HIV、TP ELISA阴性的无偿献血者血液标本进行核酸定性检测，并对NAT阳性样本进行鉴别确认试验和电化学发光检测。
结果9418人次标本经MPX V1.0检出混样阳性样本10例，6例拆分阳性样本，检出总阳性率0.064%；MPX V2.0检出9例混样阳性，6例拆分阳性，检出总阳性率0.064%；MPX V2.0对MPX V1.0，相对阴性符合率99.98%，相对总符合率99.96%；MPX V1.0和MPX V2.0均检测为阳性者4例，MPX1.0和MPX V2.0单独阳性者各2例。
用确认试验鉴别4例 HBV DNA阳性，结果1例HCV RNA阳性，3例不确定；发现1例低CT值（MPX V1.0 CT=16.4，MPX V2.0 CT=18）样本，经MPX V2.0判定为HCV感染，推测为HCV感染窗口期，之后经追踪检测证实。
结论 MPX V2.0试剂与MPX V1.0试剂拆分率接近，检出总阳性率一致，相对总符合率较高；两种试剂均有对低病毒载量（<20 U/ml）样本的漏检，灵敏度仍待提高；MPX V2.0可直接区分病毒感染类型，更有利于对阳性献血者的解释和追踪随访，以指导其早期就诊。
%ObjectiveTo assess the feasibility and applicability of roche diagnostics MPX V2.0 in screening of blood nucleic acid technology(NAT) by its comparison with MPX V1.0.MethodsMPX V1.0 or MPX V2.0 reagent was used for NAT screening according to9418 ELISA-negativedonors(HBsAg-,anti-HCV-, anti-HIV- and TP-). NAT positive samples were confirmed with electrochemical luminescence detection.Results8 sampleswere positive in9418 donors, in which 6 samples were observed MPX V1.0 positive and6 , MPX V2.0 positive. We found one sample with low CT(MPX V1.0 CT=16.4,MPX V2.0 CT=18)and positive HCV-Ag (MPX V2.0). We believed that this donor was in the window phase of HCV infection confirmed by the second test one month later.Conclusion Either MPX V1.0 or MPX V2.0 reagentmay miss low viral load samples (<20IU/mL). The sensitivity needs to be improved. MPX V2.0 can directly distinguish the type of viral infection based on fluorescence. MPX V2.0 is advantageous over MPX V1.0 to explain the positive donors and make early diagnosis.【期刊名称】《临床输血与检验》【年(卷),期】2016(000)001【总页数】5页(P66-70)【关键词】血液安全;核酸检测;血液筛查;MPX V2.0试剂【作者】高犁;钱惠忠;许友山;胡越;夏卫【作者单位】214000 江苏省无锡市中心血站检验科;214000 江苏省无锡市中心血站检验科;214000 江苏省无锡市中心血站检验科;214000 江苏省无锡市中心血站检验科;214000 江苏省无锡市中心血站检验科【正文语种】中文【中图分类】R466.6输血相关病毒主要指HBV、HCV和HIV三类[1]。
大肠菌群平板计数法方法学验证报告
GB 4789.3-2016大肠菌群平板计数法方法学验证报告一、验证目的验证GB4789.3-2016《食品微生物学检验大肠菌群计数（大肠菌群平板计数法）》在本实验室的适用性。
二、验证方法本实验样品取不同不同类型产品进行实验，严格按照GB4789.3-2016进行，除上述实验程序外，为保证本次验证的科学性和准确性，本次实验添加阳性对照组，对照组由标准菌株大肠埃希氏菌（CICC10389）接种培养而成，与样品实验程序同时进行。
三、验证设备和试剂1.冰箱：BCD-212DG/A 海信（北京）电器2.生化培养箱：LRH-70 上海一恒科学仪器3.电位pH计：PHS-3C+（精确度0.01）成都世纪方舟科技有限公司4.无菌均质器：SCIENTZ-04 宁波新芝生物科技有限公司5.恒温振荡器：SHA-A 江苏金坛环宇科学仪器厂6.菌落计数仪：Scan-500 北京五洲东方科技发展有限公司7.天平:JE-502 上海浦春计量仪器有限公司8.超净工作台:SW-CJ-2FD 上海博迅实业9.显微镜：B203LED 重庆奥特光学仪器有限公司培养基和试剂：1.结晶紫中性红胆盐琼脂（VRBA）北京陆桥技术股份有限公司2.煌绿乳糖胆盐（BGLB）肉汤北京陆桥技术股份有限公司3.无菌生理盐水：同GB 4789.3项下制法。
四、验证环境1.依据《消毒与灭菌效果的评价方法与标准GB15981-1995》定期对高压蒸汽灭菌锅的灭菌效果进行检测评价并记录；2.依据《无菌室消毒灭菌操作规程》定期对对无菌室、超净台进行清洁消毒灭菌并记录；3.依据《实验室质量控制规范食品微生物检测GB/T27405-2008》定期对对无菌室及超净台进行沉降菌检测并记录；4.无菌室检验：详见《xxxx》；五、验证步骤1.样品的稀释1.1 固体和半固体样品：称取25 g 样品放入盛有225 mL生理盐水的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打 1 min～2 min，制成1:10 的样品匀液。
不同试剂盒检测猪口蹄疫O型合成肽疫苗免疫抗体的对比试验
不同试剂盒检测猪口蹄疫O型合成肽疫苗免疫抗体的对比试验廖美娜;袁敏【摘要】使用口蹄疫O型正向间接血凝抗体试剂盒(IHA)和2个厂家生产的猪口蹄疫病毒VP1结构蛋白抗体酶联免疫吸附试验诊断试剂盒(VP1-ELISA)分别检测接种猪口蹄疫O型合成肽疫苗免疫后不同时间的抗体合格率,以探讨3种抗体检测试剂盒的相关性.结果显示,IHA试剂盒与两种VP1-ELISA的符合率较差,分别为11.7％、12.5％,IHA试剂盒不能用于检测合成肽疫苗免疫抗体;VP1-ELISA试剂盒可以科学评价合成肽疫苗免疫抗体,两种VP1-ELISA试剂盒的平均符合率为93.6％,但是VP1-ELISA (UBI)试剂盒的稳定性高于VP1-ELISA(Z)试剂盒.【期刊名称】《广东畜牧兽医科技》【年(卷),期】2016(041)001【总页数】4页(P24-26,29)【关键词】猪口蹄疫;O型抗体;试剂盒;对比【作者】廖美娜;袁敏【作者单位】河源市龙川县动物卫生监督所赤光分所,广东河源517349;河源市龙川县畜牧兽医渔业局,广东河源517300【正文语种】中文【中图分类】S851.3口蹄疫（Foot-an-mouth isease，FM）是一种急性、热性、高度接触性传染病[1]，严重危害我国畜牧业的发展[2-3]。
目前，我国对口蹄疫实行预防为主、扑杀为辅的防控政策，对口蹄疫实行强制免疫。
免疫抗体检测是科学评价免疫质量的有效手段，也是制定免疫程序的可靠依据。
在实际工作中，因受到检测方法、检测试剂的不同而导致检测结果常有差异。
近几年，猪口蹄疫O型合成肽疫苗作为一种新型疫苗在市场上得到广泛的应用[4]。
为了选择科学评估此种疫苗免疫质量的检测方法，本试验通过使用猪口蹄疫O型合成肽疫苗免疫猪群后，采集不同时间的血清，分别使用正向间接血凝试验试剂盒（IHA）和2个厂家生产的猪口蹄疫病毒VP1结构蛋白抗体酶联免疫吸附试验诊断试剂盒（VP1-ELISA），进行了猪口蹄疫O型抗体检测的对比试验。
VCA-IgA ELISA试剂盒筛查临界值的探讨
VCA-IgA ELISA试剂盒筛查临界值的探讨发表时间：2016-03-28T10:08:08.640Z 来源：《健康世界》2016年1期供稿作者：田丽贞曹进胡翠萍张姝琪[导读] 广州市戒毒管理局医院检验科中国人民武装警察部队广东省总队医院检验科欧蒙VCA-IgA ELISA试剂盒在华南地区的诊断临界值以1.33较为合适，对不同地区应该制定适合本地区的诊断临界值。
1广州市戒毒管理局医院检验科；2中国人民武装警察部队广东省总队医院检验科；3中山大学附属第三医院耳鼻喉科摘要：目的：建立欧蒙EB病毒VCA-IgA ELISA试剂盒在华南地区的诊断临界值，使其符合华南地区鼻咽癌筛查和诊断的需要。
方法：采用VCA-IgA ELISA法对本院1500例正常人、279例鼻咽癌病人和30例非鼻咽癌头颈部肿瘤病人进行测定。
结果：采用比值1.33作为欧蒙VCA-IgA ELISA法诊断临界值时，该实验在华南地区的诊断特异性为91.1%，灵敏度为90.0%。
结论：欧蒙VCA-IgA ELISA试剂盒在华南地区的诊断临界值以1.33较为合适，对于不同地区应该制定适合本地区的诊断临界值。
关键词：鼻咽癌；EB病毒；cutoff值；VCA鼻咽癌的发生存在人种和地区性差异，中国的华南地区鼻咽癌是比较常见的头颈部肿瘤【1】。
目前，针对EB病毒对于鼻咽癌的血清学检测方法很多：间接免疫荧光法，免疫酶法【3】，ELISA等。
VCA-IgA ELISA法是目前比较成熟和广泛使用的鼻咽癌早期筛查指标之一[4]。
相对于之前的免疫酶法，ELISA具有更加客观，减少人力，便于质量控制等优点。
但是，目前尚无针对各个不同地区参考值的研究，特别是没有适合鼻咽癌高发区的诊断临界值及参考范围。
故VCA-IgA ELISA法存在特异性或者灵敏度不高等缺点，而且一些VCA-IgA ELISA法也存在结果间缺乏可比性的问题，不利于治疗后的观察。
我们拟建立VCA-IgA ELISA试剂盒在华南地区合适的诊断临界值，采用欧蒙公司生产的VCA-IgA ELISA法试剂盒，通过对1500例高发地区正常人的检测，制定出适合华南地区欧盟VCA-IgA ELISA法的诊断临界值，1 资料与方法1．1，血浆标本正常对照标本收集2010 年3 -8月在中山大学肿瘤医院体检标本1500例，确诊治疗前鼻咽癌279例，非鼻咽癌头颈部肿瘤30例。
W-001-09.生物实验室.试剂库存统计表.2013.03.01
级别 BS Ind Ind Ind Ind Ind Ind Ind Ind Ind Ind Ind Ind Ind Ind Ind Ind Ind Ind AR AR Ind Ind Ind Ind Ind Ind Ind Ind Ind Ind Ind
厂家 货号 备注 报价 数量 国药沪试 71034644 生工报价 40 1 生工BBI SB0815-25g 138 1 生工BBI EB0441-25g 64 1 生工BBI CB0331-25g 78 1 生工BBI CB0038-25g 170 1.5 国药沃凯 71011284 2 生工BBI CB0037-25g 168 1 国药沃凯 71011387 1 生工BBI BB0242-25g 88 1 生工BBI MB0591-50g 58 1 天津大茂 3.8黄绿-5.4蓝 75 1 上海森灏精细化工 生工报价25g 150 1 生工BBI PB0420-25g 194 1 生工BBI BD0070-25g 250 0.5 天津大茂 1 天津大茂 4.5红-6.2黄 12 1.5 天津大茂 30 1 阿拉丁 1098940 120 1 生工BBI BB2230-25g3.0黄-4.6紫 188 1 天津大茂 1.5 天津永大 1 上海三爱思 6.0黄-7.6兰 60 1 天津大茂 5.2黄-6.8紫 58 1 天津大茂 9.4蓝-14.0红 115 1 上海三爱思 3.0红-4.4黄 18 1 国药沪试 71040860 9.3无色-10.5蓝色 84 2 天津天新 8.0无色-10.0红紫色 8 1.5 广州化学试剂 8.0无色-10.0红紫色 0.5 天津大茂 10.0黄-12.0红 9 1 天津大茂 3.0蓝紫-5.2红 1 生工BBI TT1140-10g 40 1 生工BBI ST1031-25g 45 1
GB 4789.10-2016 食品安全国家标准 食品微生物学检验 金黄色葡萄球菌检验
中华人民共和国国家标准G B4789.10 2016食品安全国家标准食品微生物学检验金黄色葡萄球菌检验2016-12-23发布2017-06-23实施中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会前言本标准代替G B4789.10 2010‘食品安全国家标准食品微生物学检验金黄色葡萄球菌检验“㊁S N/T0172 2010‘进出口食品中金黄色葡萄球菌检验方法“㊁S N/T2154 2008‘进出口食品中凝固酶阳性葡萄球菌检测方法兔血浆纤维蛋白原琼脂培养基技术“㊂本标准与G B4789.10 2010相比,主要变化如下:试验用增菌液统一为7.5%氯化钠肉汤㊂食品安全国家标准食品微生物学检验金黄色葡萄球菌检验1范围本标准规定了食品中金黄色葡萄球菌(S t a p h y l o c o c c u s a u r e u s)的检验方法㊂本标准第一法适用于食品中金黄色葡萄球菌的定性检验;第二法适用于金黄色葡萄球菌含量较高的食品中金黄色葡萄球菌的计数;第三法适用于金黄色葡萄球菌含量较低的食品中金黄色葡萄球菌的计数㊂2设备和材料除微生物实验室常规灭菌及培养设备外,其他设备和材料如下:2.1恒温培养箱:36ħʃ1ħ㊂2.2冰箱:2ħ~5ħ㊂2.3恒温水浴箱:36ħ~56ħ㊂2.4天平:感量0.1g㊂2.5均质器㊂2.6振荡器㊂2.7无菌吸管:1m L(具0.01m L刻度)㊁10m L(具0.1m L刻度)或微量移液器及吸头㊂2.8无菌锥形瓶:容量100m L㊁500m L㊂2.9无菌培养皿:直径90mm㊂2.10涂布棒㊂2.11p H计或p H比色管或精密p H试纸㊂3培养基和试剂3.17.5%氯化钠肉汤:见A.1㊂3.2血琼脂平板:见A.2㊂3.3 B a i r d-P a r k e r琼脂平板:见A.3㊂3.4脑心浸出液肉汤(B H I):见A.4㊂3.5兔血浆:见A.5㊂3.6稀释液:磷酸盐缓冲液:见A.6㊂3.7营养琼脂小斜面:见A.7㊂3.8革兰氏染色液:见A.8㊂3.9无菌生理盐水:见A.9㊂第一法金黄色葡萄球菌定性检验4检验程序金黄色葡萄球菌定性检验程序见图1㊂图1金黄色葡萄球菌检验程序5操作步骤5.1样品的处理称取25g样品至盛有225m L7.5%氯化钠肉汤的无菌均质杯内,8000r/m i n~10000r/m i n均质1m i n~2m i n,或放入盛有225m L7.5%氯化钠肉汤无菌均质袋中,用拍击式均质器拍打1m i n~ 2m i n㊂若样品为液态,吸取25m L样品至盛有225m L7.5%氯化钠肉汤的无菌锥形瓶(瓶内可预置适当数量的无菌玻璃珠)中,振荡混匀㊂5.2增菌将上述样品匀液于36ħʃ1ħ培养18h~24h㊂金黄色葡萄球菌在7.5%氯化钠肉汤中呈混浊生长㊂5.3分离将增菌后的培养物,分别划线接种到B a i r d-P a r k e r平板和血平板,血平板36ħʃ1ħ培养18h~ 24h㊂B a i r d-P a r k e r平板36ħʃ1ħ培养24h~48h㊂5.4初步鉴定金黄色葡萄球菌在B a i r d-P a r k e r平板上呈圆形,表面光滑㊁凸起㊁湿润㊁菌落直径为2mm~3mm,颜色呈灰黑色至黑色,有光泽,常有浅色(非白色)的边缘,周围绕以不透明圈(沉淀),其外常有一清晰带㊂当用接种针触及菌落时具有黄油样黏稠感㊂有时可见到不分解脂肪的菌株,除没有不透明圈和清晰带外,其他外观基本相同㊂从长期贮存的冷冻或脱水食品中分离的菌落,其黑色常较典型菌落浅些,且外观可能较粗糙,质地较干燥㊂在血平板上,形成菌落较大,圆形㊁光滑凸起㊁湿润㊁金黄色(有时为白色),菌落周围可见完全透明溶血圈㊂挑取上述可疑菌落进行革兰氏染色镜检及血浆凝固酶试验㊂5.5确证鉴定5.5.1染色镜检:金黄色葡萄球菌为革兰氏阳性球菌,排列呈葡萄球状,无芽胞,无荚膜,直径约为0.5μm~1μm㊂5.5.2血浆凝固酶试验:挑取B a i r d-P a r k e r平板或血平板上至少5个可疑菌落(小于5个全选),分别接种到5m LB H I和营养琼脂小斜面,36ħʃ1ħ培养18h~24h㊂取新鲜配制兔血浆0.5m L,放入小试管中,再加入B H I培养物0.2m L~0.3m L,振荡摇匀,置36ħʃ1ħ温箱或水浴箱内,每半小时观察一次,观察6h,如呈现凝固(即将试管倾斜或倒置时,呈现凝块)或凝固体积大于原体积的一半,被判定为阳性结果㊂同时以血浆凝固酶试验阳性和阴性葡萄球菌菌株的肉汤培养物作为对照㊂也可用商品化的试剂,按说明书操作,进行血浆凝固酶试验㊂结果如可疑,挑取营养琼脂小斜面的菌落到5m LB H I,36ħʃ1ħ培养18h~48h,重复试验㊂5.6葡萄球菌肠毒素的检验(选做)可疑食物中毒样品或产生葡萄球菌肠毒素的金黄色葡萄球菌菌株的鉴定,应按附录B检测葡萄球菌肠毒素㊂6结果与报告6.1结果判定:符合5.4㊁5.5,可判定为金黄色葡萄球菌㊂6.2结果报告:在25g(m L)样品中检出或未检出金黄色葡萄球菌㊂第二法金黄色葡萄球菌平板计数法7检验程序金黄色葡萄球菌平板计数法检验程序见图2㊂图2金黄色葡萄球菌平板计数法检验程序8操作步骤8.1样品的稀释8.1.1固体和半固体样品:称取25g样品置于盛有225m L磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质杯内,8000r/m i n~10000r/m i n均质1m i n~2m i n,或置于盛有225m L稀释液的无菌均质袋中,用拍击式均质器拍打1m i n~2m i n,制成1ʒ10的样品匀液㊂8.1.2液体样品:以无菌吸管吸取25m L样品置于盛有225m L磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥形瓶(瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠)中,充分混匀,制成1ʒ10的样品匀液㊂8.1.3用1m L无菌吸管或微量移液器吸取1ʒ10样品匀液1m L,沿管壁缓慢注于盛有9m L磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌试管中(注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面),振摇试管或换用1支1m L 无菌吸管反复吹打使其混合均匀,制成1ʒ100的样品匀液㊂8.1.4按8.1.3操作程序,制备10倍系列稀释样品匀液㊂每递增稀释一次,换用1次1m L无菌吸管或吸头㊂8.2样品的接种根据对样品污染状况的估计,选择2个~3个适宜稀释度的样品匀液(液体样品可包括原液),在进行10倍递增稀释的同时,每个稀释度分别吸取1m L样品匀液以0.3m L㊁0.3m L㊁0.4m L接种量分别加入三块B a i r d-P a r k e r平板,然后用无菌涂布棒涂布整个平板,注意不要触及平板边缘㊂使用前,如B a i r d-P a r k e r平板表面有水珠,可放在25ħ~50ħ的培养箱里干燥,直到平板表面的水珠消失㊂8.3培养在通常情况下,涂布后,将平板静置10m i n,如样液不易吸收,可将平板放在培养箱36ħʃ1ħ培养1h;等样品匀液吸收后翻转平板,倒置后于36ħʃ1ħ培养24h~48h㊂8.4典型菌落计数和确认8.4.1金黄色葡萄球菌在B a i r d-P a r k e r平板上呈圆形,表面光滑㊁凸起㊁湿润㊁菌落直径为2mm~ 3mm,颜色呈灰黑色至黑色,有光泽,常有浅色(非白色)的边缘,周围绕以不透明圈(沉淀),其外常有一清晰带㊂当用接种针触及菌落时具有黄油样黏稠感㊂有时可见到不分解脂肪的菌株,除没有不透明圈和清晰带外,其他外观基本相同㊂从长期贮存的冷冻或脱水食品中分离的菌落,其黑色常较典型菌落浅些,且外观可能较粗糙,质地较干燥㊂8.4.2选择有典型的金黄色葡萄球菌菌落的平板,且同一稀释度3个平板所有菌落数合计在20C F U~ 200C F U之间的平板,计数典型菌落数㊂8.4.3从典型菌落中至少选5个可疑菌落(小于5个全选)进行鉴定试验㊂分别做染色镜检,血浆凝固酶试验(见5.5);同时划线接种到血平板36ħʃ1ħ培养18h~24h后观察菌落形态,金黄色葡萄球菌菌落较大,圆形㊁光滑凸起㊁湿润㊁金黄色(有时为白色),菌落周围可见完全透明溶血圈㊂9结果计算9.1若只有一个稀释度平板的典型菌落数在20C F U~200C F U之间,计数该稀释度平板上的典型菌落,按式(1)计算㊂9.2 若最低稀释度平板的典型菌落数小于20C F U ,计数该稀释度平板上的典型菌落,按式(1)计算㊂9.3 若某一稀释度平板的典型菌落数大于200C F U ,但下一稀释度平板上没有典型菌落,计数该稀释度平板上的典型菌落,按式(1)计算㊂9.4 若某一稀释度平板的典型菌落数大于200C F U ,而下一稀释度平板上虽有典型菌落但不在20C F U~200C F U 范围内,应计数该稀释度平板上的典型菌落,按式(1)计算㊂9.5 若2个连续稀释度的平板典型菌落数均在20C F U~200C F U 之间,按式(2)计算㊂9.6 计算公式式(1):T =A BC d(1)式中:T样品中金黄色葡萄球菌菌落数;A某一稀释度典型菌落的总数;B某一稀释度鉴定为阳性的菌落数;C某一稀释度用于鉴定试验的菌落数;d 稀释因子㊂式(2):T =A 1B 1/C 1+A 2B 2/C 21.1d(2)式中:T样品中金黄色葡萄球菌菌落数;A 1第一稀释度(低稀释倍数)典型菌落的总数;B 1第一稀释度(低稀释倍数)鉴定为阳性的菌落数;C 1第一稀释度(低稀释倍数)用于鉴定试验的菌落数;A 2第二稀释度(高稀释倍数)典型菌落的总数;B 2第二稀释度(高稀释倍数)鉴定为阳性的菌落数;C 2第二稀释度(高稀释倍数)用于鉴定试验的菌落数;1.1计算系数;d 稀释因子(第一稀释度)㊂10 报告根据9中公式计算结果,报告每g (m L )样品中金黄色葡萄球菌数,以C F U /g(m L )表示;如T 值为0,则以小于1乘以最低稀释倍数报告㊂第三法 金黄色葡萄球菌M P N 计数11 检验程序金黄色葡萄球菌M P N 计数检验程序见图3㊂图3金黄色葡萄球菌M P N法检验程序12操作步骤12.1样品的稀释按8.1进行㊂12.2接种和培养12.2.1根据对样品污染状况的估计,选择3个适宜稀释度的样品匀液(液体样品可包括原液),在进行10倍递增稀释的同时,每个稀释度分别接种1m L样品匀液至7.5%氯化钠肉汤管(如接种量超过1m L,则用双料7.5%氯化钠肉汤),每个稀释度接种3管,将上述接种物36ħʃ1ħ培养,18h~24h㊂12.2.2用接种环从培养后的7.5%氯化钠肉汤管中分别取培养物1环,移种于B a i r d-P a r k e r平板36ħʃ1ħ培养,24h~48h㊂12.3典型菌落确认按8.4.1㊁8.4.3进行㊂13结果与报告根据证实为金黄色葡萄球菌阳性的试管管数,查M P N检索表(见附录C),报告每g(m L)样品中金黄色葡萄球菌的最可能数,以M P N/g(m L)表示㊂附录A培养基和试剂A.17.5%氯化钠肉汤A.1.1成分蛋白胨10.0g牛肉膏5.0g氯化钠75g蒸馏水1000m LA.1.2制法将上述成分加热溶解,调节p H至7.4ʃ0.2,分装,每瓶225m L,121ħ高压灭菌15m i n㊂A.2血琼脂平板A.2.1成分豆粉琼脂(p H7.5ʃ0.2)100m L脱纤维羊血(或兔血)5m L~10m LA.2.2制法加热溶化琼脂,冷却至50ħ,以无菌操作加入脱纤维羊血,摇匀,倾注平板㊂A.3B a i r d-P a r k e r琼脂平板A.3.1成分胰蛋白胨10.0g牛肉膏5.0g酵母膏1.0g丙酮酸钠10.0g甘氨酸12.0g氯化锂(L i C l㊃6H2O)5.0g琼脂20.0g蒸馏水950m LA.3.2增菌剂的配法30%卵黄盐水50m L与通过0.22μm孔径滤膜进行过滤除菌的1%亚碲酸钾溶液10m L混合,保存于冰箱内㊂A.3.3制法将各成分加到蒸馏水中,加热煮沸至完全溶解,调节p H至7.0ʃ0.2㊂分装每瓶95m L,121ħ高压灭菌15m i n㊂临用时加热溶化琼脂,冷至50ħ,每95m L加入预热至50ħ的卵黄亚碲酸钾增菌剂5m L摇匀后倾注平板㊂培养基应是致密不透明的㊂使用前在冰箱储存不得超过48h㊂A.4脑心浸出液肉汤(B H I)A.4.1成分胰蛋白质胨10.0g氯化钠5.0g磷酸氢二钠(12H2O)2.5g葡萄糖2.0g牛心浸出液500m LA.4.2制法加热溶解,调节p H至7.4ʃ0.2,分装16mmˑ160mm试管,每管5m L置121ħ,15m i n灭菌㊂A.5兔血浆取柠檬酸钠3.8g,加蒸馏水100m L,溶解后过滤,装瓶,121ħ高压灭菌15m i n㊂兔血浆制备:取3.8%柠檬酸钠溶液一份,加兔全血4份,混好静置(或以3000r/m i n离心30m i n),使血液细胞下降,即可得血浆㊂A.6磷酸盐缓冲液A.6.1成分磷酸二氢钾(K H2P O4)34.0g蒸馏水500m LA.6.2制法贮存液:称取34.0g的磷酸二氢钾溶于500m L蒸馏水中,用大约175m L的1m o l/L氢氧化钠溶液调节p H至7.2,用蒸馏水稀释至1000m L后贮存于冰箱㊂稀释液:取贮存液1.25m L,用蒸馏水稀释至1000m L,分装于适宜容器中,121ħ高压灭菌15m i n㊂A.7营养琼脂小斜面A.7.1成分蛋白胨10.0g牛肉膏3.0g氯化钠5.0g琼脂15.0g~20.0g蒸馏水1000m LA.7.2制法将除琼脂以外的各成分溶解于蒸馏水内,加入15%氢氧化钠溶液约2m L调节p H至7.3ʃ0.2㊂加入琼脂,加热煮沸,使琼脂溶化,分装13mmˑ130mm试管,121ħ高压灭菌15m i n㊂A.8革兰氏染色液A.8.1结晶紫染色液A.8.1.1成分结晶紫1.0g95%乙醇20.0m L1%草酸铵水溶液80.0m LA.8.1.2制法将结晶紫完全溶解于乙醇中,然后与草酸铵溶液混合㊂A.8.2革兰氏碘液A.8.2.1成分碘1.0g碘化钾2.0g蒸馏水300m LA.8.2.2制法将碘与碘化钾先行混合,加入蒸馏水少许充分振摇,待完全溶解后,再加蒸馏水至300m L㊂A.8.3沙黄复染液A.8.3.1成分沙黄0.25g95%乙醇10.0m L蒸馏水90.0m LA.8.3.2制法将沙黄溶解于乙醇中,然后用蒸馏水稀释㊂A.8.4染色法a)涂片在火焰上固定,滴加结晶紫染液,染1m i n,水洗㊂b)滴加革兰氏碘液,作用1m i n,水洗㊂c)滴加95%乙醇脱色约15s~30s,直至染色液被洗掉,不要过分脱色,水洗㊂d)滴加复染液,复染1m i n,水洗㊁待干㊁镜检㊂A.9无菌生理盐水A.9.1成分氯化钠8.5g蒸馏水1000m LA.9.2制法称取8.5g氯化钠溶于1000m L蒸馏水中,121ħ高压灭菌15m i n㊂附录B葡萄球菌肠毒素检验B.1试剂和材料除另有规定外,所用试剂均为分析纯,试验用水应符合G B/T6682对一级水的规定㊂B.1.1 A㊁B㊁C㊁D㊁E型金黄色葡萄球菌肠毒素分型E L I S A检测试剂盒㊂B.1.2p H试纸,范围在3.5~8.0,精度0.1㊂B.1.30.25m o l/L㊁p H8.0的T r i s缓冲液:将121.1g的T r i s溶解到800m L的去离子水中,待温度冷至室温后,加42m L浓H C L,调p H至8.0㊂B.1.4p H7.4的磷酸盐缓冲液:称取N a H2P O4㊃H2O0.55g(或N a H2P O4㊃2H2O0.62g)㊁N a2H P O4㊃2H2O2.85g(或N a2H P O4㊃12H2O5.73g)㊁N a C l8.7g溶于1000m L蒸馏水中,充分混匀即可㊂B.1.5庚烷㊂B.1.610%次氯酸钠溶液㊂B.1.7肠毒素产毒培养基B.1.7.1成分蛋白胨20.0g胰消化酪蛋白200m g(氨基酸)氯化钠5.0g磷酸氢二钾1.0g磷酸二氢钾1.0g氯化钙0.1g硫酸镁0.2g菸酸0.01g蒸馏水1000m Lp H7.3ʃ0.2B.1.7.2制法将所有成分混于水中,溶解后调节p H,121ħ高压灭菌30m i n㊂B.1.8营养琼脂B.1.8.1成分蛋白胨10.0g牛肉膏3.0g氯化钠5.0g琼脂15.0g~20.0g蒸馏水1000m LB.1.8.2制法将除琼脂以外的各成分溶解于蒸馏水内,加入15%氢氧化钠溶液约2m L校正p H至7.3ʃ0.2㊂加入琼脂,加热煮沸,使琼脂溶化㊂分装烧瓶,121ħ高压灭菌15m i n㊂B.2仪器和设备B.2.1电子天平:感量0.01g㊂B.2.2均质器㊂B.2.3离心机:转速3000g~5000g㊂B.2.4离心管:50m L㊂B.2.5滤器:滤膜孔径0.2μm㊂B.2.6微量加样器:20μL~200μL㊁200μL~1000μL㊂B.2.7微量多通道加样器:50μL~300μL㊂B.2.8自动洗板机(可选择使用)㊂B.2.9酶标仪:波长450n m㊂B.3原理本方法可用A㊁B㊁C㊁D㊁E型金黄色葡萄球菌肠毒素分型酶联免疫吸附试剂盒完成㊂本方法测定的基础是酶联免疫吸附反应(E L I S A)㊂96孔酶标板的每一个微孔条的A~E孔分别包被了A㊁B㊁C㊁D㊁E 型葡萄球菌肠毒素抗体,H孔为阳性质控,已包被混合型葡萄球菌肠毒素抗体,F和G孔为阴性质控,包被了非免疫动物的抗体㊂样品中如果有葡萄球菌肠毒素,游离的葡萄球菌肠毒素则与各微孔中包被的特定抗体结合,形成抗原抗体复合物,其余未结合的成分在洗板过程中被洗掉;抗原抗体复合物再与过氧化物酶标记物(二抗)结合,未结合上的酶标记物在洗板过程中被洗掉;加入酶底物和显色剂并孵育,酶标记物上的酶催化底物分解,使无色的显色剂变为蓝色;加入反应终止液可使颜色由蓝变黄,并终止了酶反应;以450n m波长的酶标仪测量微孔溶液的吸光度值,样品中的葡萄球菌肠毒素与吸光度值成正比㊂B.4检测步骤B.4.1从分离菌株培养物中检测葡萄球菌肠毒素方法待测菌株接种营养琼脂斜面(试管18mmˑ180mm)36ħ培养24h,用5m L生理盐水洗下菌落,倾入60m L产毒培养基中,36ħ振荡培养48h,振速为100次/m i n,吸出菌液离心,8000r/m i n 20m i n,加热100ħ,10m i n,取上清液,取100μL稀释后的样液进行试验㊂B.4.2从食品中提取和检测葡萄球菌毒素方法B.4.2.1牛奶和奶粉将25g奶粉溶解到125m L㊁0.25M㊁p H8.0的T r i s缓冲液中,混匀后同液体牛奶一样按以下步骤制备㊂将牛奶于15ħ,3500g离心10m i n㊂将表面形成的一层脂肪层移走,变成脱脂牛奶㊂用蒸馏水对其进行稀释(1ʒ20)㊂取100μL稀释后的样液进行试验㊂B.4.2.2脂肪含量不超过40%的食品称取10g样品绞碎,加入p H7.4的P B S液15m L进行均质㊂振摇15m i n㊂于15ħ,3500g离心10m i n㊂必要时,移去上面脂肪层㊂取上清液进行过滤除菌㊂取100μL的滤出液进行试验㊂B.4.2.3脂肪含量超过40%的食品称取10g样品绞碎,加入p H7.4的P B S液15m L进行均质㊂振摇15m i n㊂于15ħ,3500g离心10m i n㊂吸取5m L上层悬浮液,转移到另外一个离心管中,再加入5m L的庚烷,充分混匀5m i n㊂于15ħ,3500g离心5m i n㊂将上部有机相(庚烷层)全部弃去,注意该过程中不要残留庚烷㊂将下部水相层进行过滤除菌㊂取100μL的滤出液进行试验㊂B.4.2.4其他食品可酌情参考上述食品处理方法㊂B.4.3检测B.4.3.1所有操作均应在室温(20ħ~25ħ)下进行,A㊁B㊁C㊁D㊁E型金黄色葡萄球菌肠毒素分型E L I S A检测试剂盒中所有试剂的温度均应回升至室温方可使用㊂测定中吸取不同的试剂和样品溶液时应更换吸头,用过的吸头以及废液处理前要浸泡到10%次氯酸钠溶液中过夜㊂B.4.3.2将所需数量的微孔条插入框架中(一个样品需要一个微孔条)㊂将样品液加入微孔条的A~G 孔,每孔100μL㊂H孔加100μL的阳性对照,用手轻拍微孔板充分混匀,用黏胶纸封住微孔以防溶液挥发,置室温下孵育1h㊂B.4.3.3将孔中液体倾倒至含10%次氯酸钠溶液的容器中,并在吸水纸上拍打几次以确保孔内不残留液体㊂每孔用多通道加样器注入250μL的洗液,再倾倒掉并在吸水纸上拍干㊂重复以上洗板操作4次㊂本步骤也可由自动洗板机完成㊂B.4.3.4每孔加入100μL的酶标抗体,用手轻拍微孔板充分混匀,置室温下孵育1h㊂B.4.3.5重复B.4.3.3的洗板程序㊂B.4.3.6加50μL的TM B底物和50μL的发色剂至每个微孔中,轻拍混匀,室温黑暗避光处孵育30m i n㊂B.4.3.7加入100μL的2m o l/L硫酸终止液,轻拍混匀,30m i n内用酶标仪在450n m波长条件下测量每个微孔溶液的O D值㊂B.4.4结果的计算和表述B.4.4.1质量控制测试结果阳性质控的O D值要大于0.5,阴性质控的O D值要小于0.3,如果不能同时满足以上要求,测试的结果不被认可㊂对阳性结果要排除内源性过氧化物酶的干扰㊂B.4.4.2临界值的计算每一个微孔条的F孔和G孔为阴性质控,两个阴性质控O D值的平均值加上0.15为临界值㊂示例:阴性质控1=0.08阴性质控2=0.10平均值=0.09临界值=0.09+0.15=0.24B.4.4.3结果表述O D值小于临界值的样品孔判为阴性,表述为样品中未检出某型金黄色葡萄球菌肠毒素;O D值大于或等于临界值的样品孔判为阳性,表述为样品中检出某型金黄色葡萄球菌肠毒素㊂B.5生物安全因样品中不排除有其他潜在的传染性物质存在,所以要严格按照G B19489‘实验室生物安全通用要求“对废弃物进行处理㊂附录C金黄色葡萄球菌最可能数(M P N)检索表每g(m L)检样中金黄色葡萄球菌最可能数(M P N)的检索见表C.1㊂表C.1金黄色葡萄球菌最可能数(M P N)检索表阳性管数0.100.010.001M P N 95%置信区间下限上限000<3.0 9.5 0013.00.159.6 0103.00.1511 0116.11.218 0206.21.218 0309.43.638 1003.60.1718 1017.21.318 102113.638 1107.41.320 111113.638 120113.642 121154.542 130164.542 2009.21.438 201143.642 202204.542 210153.742 211204.542 212278.794阳性管数0.100.010.001M P N95%置信区间下限上限220214.542 221288.794 222358.794 230298.794 231368.794 300234.694 301388.7110 3026417180 310439180 3117517200 31212037420 31316040420 3209318420 32115037420 32221040430 323290901000 330240421000 331460902000 33211001804100 333>1100420注1:本表采用3个稀释度[0.1g(m L)㊁0.01g(m L)和0.001g(m L)]㊁每个稀释度接种3管㊂注2:表内所列检样量如改用1g(m L)㊁0.1g(m L)和0.01g(m L)时,表内数字应相应降低10倍;如改用0.01g (m L)㊁0.001g(m L)㊁0.0001g(m L)时,则表内数字应相应增高10倍,其余类推㊂。
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试剂名称 试剂数量 无水乙醇 17瓶 1，4二氧六环 14瓶 A0 盐酸 39瓶 硫酸 20瓶 乙酸（冰醋酸） 10瓶 甲醛 7瓶 4-甲氧基苯甲醛（大茴香醛） 1瓶 糠醛 1瓶 丙烯醛 3瓶 乙二醇二甲醚 2瓶 乙二醇甲醚 5瓶 1-乙基-2-吡咯烷酮 1瓶 石油醚 1瓶 1，3-二甲基吡咯烷酮 1瓶 A1 4-甲基-2戊酮 2瓶 环己酮 环乙酮 丁酮 1瓶 1瓶 1瓶 试剂名称 三丁基磷 碘甲烷 甲基硅油 乙酰乙酸甲酯 NaNO2 硝酸 铝镍合金 雷尼镍 氢氟钠 发烟硫酸 汞 甲胺溶液 邻氯硝基苯 N,N，-二环己基碳二 亚胺 三氯乙酸 三氯甲烷 浓硫酸 数量 19瓶 11瓶 25瓶 20瓶 2瓶 3瓶 1瓶 1瓶 1瓶 2瓶 4瓶 5瓶 4瓶 1瓶 5瓶 5瓶 1瓶
2瓶 2瓶 4瓶 11瓶 2瓶 2瓶 1瓶 1瓶 1瓶 1瓶
C1
E2 饱和食盐水 1瓶 工业盐酸（30%） 1瓶 C1 丙烯酸乙酯混合液 1瓶 磺酰氯 1瓶 四氯化钛 1+1.5 F0 丙烯酸 1瓶 甲酸98% 0 5 C2 过氧乙酸 30%过氧化氢 6瓶 丁二酸 1 R-(t)-α -甲基苄胺 500ml 3
2瓶 380g
A3
三氯氧磷 1-氟萘 草酰氯 磷酸 B0 正庚烷 2-甲基四氢呋喃 3-氧化戊酸甲酯3kg 氯甲酸乙酯 甲基苯甲酯 月桂酸甲酯 丙二酸二甲酯 氰乙酸乙酯 硼酸三丁酯 氯甲酸异丙酯 B1 乙酰乙酸乙酯 二甲基亚砜 正丁醇 异丙醇 1，2-丙二醇 MO4080500ml wt%甲醇溶液
N-BOC-EXO-3-氨基托烷 N-BOC-EXO-3-氨基托烷 N-BOC-EXO-3-氨基托烷 N-BOC-EXO-3-氨基托烷 N-BOC-EXO-3-氨基托烷 N-BOC-EXO-3-氨基托烷
3-溴丙腈
9.8kg 10kg 4.77kg 4.63kg 5kg 10kg 24kg
1 2 2 2 2 1 4
F2
2－吡咯烷酮 21%乙醇钠 DBLL 1KG L-乳酸甲酯
1.5 1瓶 1瓶
铜粉 1瓶 2－甲基四氢呋喃 1瓶 3－乙酰吡啶 5瓶 3－（4－氟苯基）－1－异丙基吲哚 1瓶 2－氯－3－氨基－4甲基吡啶 1瓶 N－甲基吲哚，CP，98% 1瓶 苯甲醛 1瓶 喹啉 2瓶 环丁砜 1瓶 正庚烷 20瓶 异丙醚 20瓶 DMF 1瓶 磷酸 1瓶 N-乙基－2－吡啶烷酮 1瓶
A3
氯乙酰500ml 三丁基磷
F1
1，2－二氯乙烷 2－氯丙酰氯 乙酰氯 溴代苯 N-甲基吡咯烷酮 四硼酸钠 1，2二氯乙烷 1，2－二氯乙烷 异丙醚 水合肼 C9H11NO2 甲磺酰胺 醋酐 吡啶 1，4一二氧六环 Байду номын сангаас氯乙酸甲酯 乙酸异丙酯99.5% 邻二甲苯 丙酮 DMF 环氧丁酸溶液 AP-95 1KG
1瓶 1瓶 1瓶 3瓶 20kg 9瓶 7瓶 7瓶 6瓶 1瓶 1瓶 1瓶 1瓶 4瓶 1瓶 1瓶 2瓶 1瓶 1瓶 1瓶 2.5L 1瓶
D0
D1
N-乙基-2-吡咯烷酮 1瓶
D2 1，4二氧六环 10瓶 6-溴-乙醇 1瓶 2，5-二氯硝基苯 1瓶 C3H7NO2 2瓶 D3 2-Nitropropane 4瓶 1，2-Diamino-2-methylpropane 4瓶 硝基甲苯 4瓶 A2 2-硝基甲苯 4瓶 1，3，5-三甲苯 5瓶 六甲基二硅氧烷 2瓶 丙酮 4L 三氟甲磺酸 500g
E1
甲苯 1瓶 回收乙酸乙酯 1瓶 氟化剂副产物 2瓶 APS母液 1瓶 N－甲基苄胺 1瓶 N,N，-二环己基碳二亚胺1瓶 四正丁基氟化铵 1瓶 三乙醇胺 4瓶 N.N－二甲基酰胺 1瓶 苄胺（250ml） 1瓶
E2
N-甲基苯胺 二甲胺水溶液 N,N－二乙基酰胺 1，3－二溴丙烷 氯化苄 溴乙烷 环氧氯丙烷 苯甲酰溴 溴代正丁烷 四氯乙烯
1瓶 1瓶 13瓶 4瓶 20瓶 4桶 3瓶 2瓶 2瓶 3瓶 1瓶 6瓶 4瓶 1瓶 3瓶 2瓶 1瓶 1瓶 3瓶 3瓶 2瓶
E0
1-溴-乙醇 1瓶 环己醇 8瓶 2-乙基己醇（异辛醇） 3瓶 异丙醇 3瓶 叔戊醇 5瓶 6瓶 B2 叔丁醇 乙二醇 2瓶 苯甲醇 1瓶 正丙醇 8瓶 丙二醇 3瓶 无水甲酸 1瓶 本甲腈（阿拉丁） 4瓶 丙酮 38 苯甲腈（国药） 11 三氯化硼 1桶 C0 21%乙醇钠 1桶 NMP 1桶 邻二甲苯 2桶 环丁砜 1桶 溴素 1瓶+100g 甲基苯甲酯 1瓶