各种酶活力测定方法及注意事项

碱性蛋白酶及各种蛋白酶活力测定方法及测定有感

因长期测定碱性蛋白酶酶活力与角蛋白酶活力与胶原酶活力和弹性蛋白酶活力，碱性蛋白酶活力测定还好，因有国家标准，测定按照国标来便可大大减少误差。其余酶活力测定过程中因无统一标准且底物差异大，导致长期酶活力测定的混乱，各种酶活力测定方法与各种试剂添加，最后实际测定的酶活力只能仅作参考。

以下是各种蛋白酶活力测定方法及标曲绘制：

碱性蛋白酶测定方法

根据国标GB/T 23527-2009 附录B 蛋白酶活力测定福林法

以下是方法

碱性蛋白酶的测定方法参考 GB/T 23527-2009 附录 B 中福林酚法进行，即 1 个酶活力单位（U/mL）定义为 1 mL 酶液在 40℃、pH= 10.5 条件下反应 1 min 水解酪蛋白产生 1 μg 酪氨酸所需要的酶量，主要步骤如下。

2.2.6.1 标准曲线的绘制

（1）L-酪氨酸标准溶液：按表 2-6 配制。

表 2-6 L-酪氨酸标准溶液配置表

Table 2-6 L-Tyrosine standard solution form

管号酪氨酸标准溶液的浓度/

（μg/mL）

取 100 μg/mL 酪氨酸标准

溶液的体积/（mL）

取水的体积/

（mL）

0 0 0 10

1 10 1 9

2 20 2 8

3 30 3 7

4 40 4 6

5 50 5 5

（2）分别取上述溶液各 1.00 mL，各加 0.4 mol/L 碳酸钠溶液 5.0 mL，福林试剂使用

液 1.00 mL，置于 40 ℃±0.2 ℃水浴锅中显色 20 min，用分光光度计于波长 680 nm，10

mm 比色皿，以不含酪氨酸的反应管作为空白，分别测定其吸光度值，以吸光度值 A 为纵坐标，酪氨酸浓度 C 为横坐标，绘制 L-酪氨酸标准曲线。

图 2-1 L-酪氨酸标准曲线

Fig. 2-1 L-tyrosine standard curve

根据作图或用回归方程计算出当吸光度为 1 时的酪氨酸的量（μg），既为吸光度常数 K 值。其 K 值应在 95-100 范围内。上图所示标准曲线符合要求，可用于下一步实验。

2.2.6.2 测定方法

（1）计算方法

X = A × K × 4 / 10 × n = 2 / 5 × A × K × n 式（2-1）

式中，X —样品的酶活力，μ/g；

A —样品平行实验的平均吸光度；

K —吸光常数；

4 —反应试剂的总体积，mL；

10—反应时间 10 min，以 1 min 计；

n —稀释倍数。

（2）测定方法

①先将干酪素溶液放入 40 ℃±0.2 ℃恒温水浴中，预热 5 min。

②按下列程序操作，进行测定。

于 680 nm 波长，用 10 mm 比色皿测其吸光度。

试管A（空试管B（样

酶液1.00 mL 酶液1.00 mL

预热2 min 预热2 min

三氯乙酸2.00

干酪素1.00 mL mL

混匀混匀

保温10 min

干酪素1.00 mL 三氯乙酸2.00 mL 混匀混匀

10000 r/min

10000 r/min 离心2 min

离心2 min

滤液1.00 mL 滤液1.00 mL

加碳酸钠溶液5.00 加碳酸钠溶液mL 5.00 mL

加福林试剂1.00 mL 加福林试剂1.00 mL 显色20 min 显色20 min

角蛋白酶活力的测定

1、角蛋白酶活力测定方法

试剂和溶液：

a. 硼酸缓冲溶液（pH 10.5）：称取硼酸钠 9.54 g，氢氧化钠 1.6 g，加水至 900 mL，搅拌均匀。用 1 mol/L 盐酸溶液或 0.5 mol/L 氢氧化钠溶液调整 pH=10.5±0.05，

定容至 1000 mL。

b. 硼酸缓冲溶液（pH 9.5、11.5）：称取硼酸钠 9.54 g，加水至 800 mL，用氢氧化钠溶液调整 pH=9.5±0.05 或 pH=11.5±0.05，定容至 1000 mL。

c. 10%三氯乙酸：10 g 三氯乙酸，加水至 100 mL。

d. 0.5%羊毛角蛋白溶液：取 0.5g 羊毛角蛋白加入 100ml 硼酸缓冲液溶解

测定方法：

取 1 mL 酶液（0.1 g 酶粉用对应 pH 缓冲液溶解离心，取上清液适当稀释），取 4 支具塞试管中，空白加 1mL 酶液、2 mL 0.5%羊毛角蛋白溶液（pH10.5、硼酸缓冲液溶解）、2 mL 10 %三氯乙酸，对照加入 1ml 酶液和 2ml 角蛋白溶液，在40℃恒温水浴锅中反应1 h 后对照加2 mL 10 %三氯乙酸终止反应，在10000 r/min 离心 10 min，取上清液，过滤，在 280 nm 处测吸光度。（使用石英比色皿）酶活定义：1 ml/1 g 酶在该反应体系下对照相对于空白样 A280nm 吸光每升高 0.01 为 1 unit（U）。X=(A280-A0)×100×N

N 为稀释倍数

胶原蛋白酶活力的测定

标曲的绘制

取11支试管分别标号，向每支试管中分别加入0、0.05、0.1、0.15、0.2、

0.25、0.3、0.35、0.4、0.45、0.5 m L 的0.75umol/ml 的标准甘氨酸溶液，并用水补足至0.5 mL，各加入0.5 ml乙酸-乙酸钠缓冲液（pH5.4）充分混合，最

后加入0.5m L 茚三酮显色液，充分混合。用试管盖盖住，在100℃下水浴加热 10 min，冷却放置10min，加入4.5 m L乙醇（60%，v/v）进行稀释，在570nm 下比色。

吸光值与甘氨酸浓度标准曲线