微生物快速检测技术
食品微生物快速检验和无菌操作技术
食品微生物快速检验和无菌操作技术食品微生物是指在食品中生长、繁殖或形成代谢产物，对人体健康有潜在危害的微生物。
一旦食品中存在微生物，就可能导致食品变质，不但影响产品质量，还对人体健康造成影响。
因此，对食品微生物进行快速检验和无菌操作技术是保证食品安全的关键。
快速检验技术可以提高检测效率，对于生产和加工过程中需要实时监测的食品生产企业而言尤为重要。
常用的食品微生物快速检测技术包括PCR技术、荧光PCR技术、生物传感器技术等。
1. PCR技术PCR技术是指聚合酶链式反应技术。
通过PCR技术，可以在短时间内扩增肠道致病菌的DNA，从而检测食品中是否存在这些微生物。
PCR技术具有高灵敏度、高特异性、快速、简单等优点，能够在短时间内对食品微生物进行快速检测。
PCR技术的不足是对反应体系的管控要求严格，反应过程中温度控制相对复杂，因此需要操作者有经验和高技能水平。
荧光PCR技术是在PCR技术基础上发展起来的一种新型PCR技术。
荧光PCR技术利用荧光探针与特定PCR产物结合生成荧光信号，从而进行定量检测。
荧光PCR技术具有快速、高灵敏度、高特异性、定量性强等优点，并且不需要繁琐的后续测序，因此被广泛应用于食品微生物检测中。
3. 生物传感器技术生物传感器技术是通过对微生物的生物学特性和物理化学特性进行研究，利用微生物和某些物理化学传感器相结合，对微生物进行检测或定量分析的一种新型检测技术。
生物传感器技术具有灵敏度高、快速、简单、无需复杂设备等优点，因此被广泛应用于食品微生物检测领域。
二、无菌操作技术无菌操作技术是指在无微生物污染的条件下，进行微生物实验和处理的操作技术。
无菌操作技术的目的是为了避免微生物的污染，保证实验的准确性和可靠性。
常用的无菌操作技术包括灭菌、隔离、纯化等。
1. 灭菌灭菌是指在一定温度、压力和时间条件下，杀灭微生物的技术。
常用的灭菌方式有热灭菌、紫外线灭菌、化学灭菌等。
其中，热灭菌是最常用的灭菌方式之一，它通过高温杀灭微生物，能够有效地消除微生物污染。
微生物快速检测技术..2024
引言：微生物在生物工程、食品安全、环境监测等领域中起着重要作用，因此，开发快速、准确、高效的微生物检测技术至关重要。
微生物快速检测技术是指能够在较短时间内对微生物进行快速检测和鉴定的技术。
本文将详细介绍微生物快速检测技术的原理、方法和应用。
概述：微生物快速检测技术基于先进的分子生物学、生物化学和光学仪器，在短时间内能够对微生物的存在和数量进行快速和准确的检测。
与传统的培养方法相比，微生物快速检测技术具有操作简便、结果快速、准确性高等优势。
在食品安全领域，微生物快速检测技术能够快速鉴定食品中的致病菌，提高食品的质量和安全性。
在环境监测领域，微生物快速检测技术能够迅速监测水质和土壤中的微生物，为环境保护提供有力支持。
正文内容：一、基于PCR技术的微生物快速检测1. PCR技术的原理和方法：介绍PCR技术的工作原理、步骤和所需试剂。
2. 基于PCR的微生物检测方法：详细介绍基于PCR技术的微生物检测方法，如实时荧光PCR、逆转录PCR等，以及其在食品和环境中的应用。
3. PCR技术的优势和局限性：分析PCR技术的优点和局限性，并提出未来的发展方向和改进方法。
二、基于基因芯片技术的微生物快速检测1. 基因芯片技术的原理和方法：介绍基因芯片技术的工作原理、设计和制备方法。
2. 基于基因芯片的微生物检测方法：详细介绍基于基因芯片技术的微生物检测方法，如DNA芯片、RNA芯片等，以及其在食品和环境中的应用。
3. 基因芯片技术的优势和局限性：分析基因芯片技术的优点和局限性，并提出未来的发展方向和改进方法。
三、基于质谱技术的微生物快速检测1. 质谱技术的原理和方法：介绍质谱技术的工作原理、样品制备和仪器设备。
2. 基于质谱的微生物检测方法：详细介绍基于质谱技术的微生物检测方法，如MALDI-TOF质谱、飞行时间质谱等，以及其在食品和环境中的应用。
3. 质谱技术的优势和局限性：分析质谱技术的优点和局限性，并提出未来的发展方向和改进方法。
微生物快速检测方法
快速检测的新方法
1、ATP生物荧光法 2、电阻抗法 3、颜色变化 4、流式细胞技术及激光扫描技术 5、其它：热量法，放射测量法
培养膜法_快速检测纸片技术
原理
二片塑料膜构成，上薄为盖，下厚为培养基。
操作方法：
缺点
➢ 成本比传统方法要稍高些。 ➢ 测试细菌总数、大肠菌群、霉菌和酵母菌时不能节约培养
时间。
培养膜法_快速检测纸片技术
应用
➢ 细菌总数 测试片中含有一种红色指示染剂，使所有菌落易认别计数。
➢ 大肠菌群 测试片中含有指示剂，使菌落为红色，且有气泡产生。
➢ 大肠杆菌 指示剂可使所有菌落为红色，并可留住大肠杆菌产生的气 泡。 24小时可确定大肠杆菌数。
与阻抗法类似，可以实现快速检测。 缺点：需要购买原厂的预装培养基，
应用范围受限制，成本高昂。
梅里埃的BacT/Alert微生物检测仪
基于微生物生成产生CO2的原 理。CO2积累越多，底部的 CO2传感器变黄，由LED发射 一束光至底部，探头检测反射 光的强度。光强度与微生物数 量有一定关系。
流式细胞技术
滤膜法
滤膜法常用于可过滤样品的微生物检测。
优点
灵敏度增大，菌落无扩散情况，便于计数。
缺点
需要额外的支出购买真空泵，多联支架及一次性滤膜； 如果抽滤过程空气洁净度不够，有可能造成二次污染， 尤其是对菌数要求特别严格的产品，如啤酒，澄清果 汁，桶装饮用水等。
ATP生物荧光法
原理
ATP＋萤光素+萤光素酶+O2—AMP+Ppi+CO2+氧化萤光素 +光
微生物快速检测方法
微生物快速检测方法概述微生物快速检测方法是通过各种技术手段，利用微生物的生物特性来快速检测微生物的存在和数量。
传统的微生物检测方法需要长时间的培养时间，而且需要复杂的设备和技术，费用昂贵，而新兴的微生物快速检测技术则能够快速、准确地检测微生物，被广泛应用于农业、食品、医疗等领域。
本文将介绍几种常见的微生物快速检测方法。
1. 荧光PCR荧光PCR指的是利用荧光标记的探针来检测PCR反应中产生的特定DNA序列。
在PCR反应过程中，如果存在目标DNA序列，则荧光标记的探针将与其特异结合，产生荧光信号，在荧光仪中进行检测即可得到检测结果。
荧光PCR具有高灵敏度、高特异性、快速方便等优点，被广泛应用于微生物检测中。
同时，还可以通过荧光PCR技术构建荧光定量PCR系统，实现对微生物数量的精确测定。
2. 生物传感器生物传感器是一种新型的可重复使用、非侵入式的微生物检测方法。
生物传感器利用生物体内酶、免疫学反应或细胞作为传感元件，将其与物理、化学、电子等传感技术相结合，实现对微生物的快速检测。
生物传感器具有检测速度快、检测灵敏度高、检测范围广等优点，而且能够实现实时在线监测，被广泛应用于工业用水、环境监测、食品安全等领域。
3. 免疫学检测法免疫学检测法利用生物的免疫反应来检测微生物的存在和数量。
常用的免疫学检测法包括酶联免疫吸附检测法（ELISA）、荧光免疫检测法、放射免疫检测法等。
免疫学检测法具有高度的特异性和灵敏度，能够快速、准确地检测微生物，被广泛应用于食品卫生和临床诊断等领域。
4. 质谱技术质谱技术是一种通过分子量确定分子结构和组成的方法，能够检测各种化合物和生物大分子。
在微生物快速检测中，质谱技术通常用于检测微生物的蛋白质组成、代谢产物和生长情况等。
质谱技术具有高度的特异性和灵敏度，能够快速地检测微生物，而且对检测结果进行质量控制，确保结果的可靠性。
总结微生物快速检测方法的发展给微生物检测带来了很大的便利，提高了检测效率和准确性。
微生物快速检测法(DME)
微生物快速检测法（DME）1、原理细菌和酵母菌都能在染色后通过显微镜直接计数，本程序可以对淀粉糊浆中活菌/死菌微生物污染进行准确计数2、仪器及试剂1、显微镜，40X物镜下观察2、天平3、微波炉4、三联不锈钢过滤器（包括三联支架+真空泵）5、平口镊子6、0.8um/25mm过滤膜7、载玻片8、盖玻片9、异丙醇，100％10、吖啶橙染色剂11、浸油12、75％乙醇13、洗洁精14、无菌杯3、操作程序1取一洁净的无菌杯（可重复使用，用洗洁精加自来水清洗干净后，使用离子水冲洗至少三次）2称取样品（取13克加去离子水至103克）3使用微波炉将配置好的样品微热（使样品充分溶解）4用去离子水将三联过滤杯冲洗干净。
（开过滤器，开泵—关过滤器，关泵—开排气阀，排气抽真空）（注：后可加入75％乙醇5ml，放置1min后滤掉）5使用平口镊子放置滤膜，亮面朝上，滤膜与过滤砂芯中间无缝隙6取出热好的样品，过滤，至103克样品全部滤完7关过滤器，关泵，排气8加入2.5ml吖啶橙染色剂，使其溢满整个滤膜9染色一分钟后，关排气阀，开过滤器，开泵10使用异丙醇冲洗（至少2.0ml）11在等待染色的1min时，取一载玻片加一滴浸油12在泵开启的状态下，用镊子移下滤膜（有助于滤膜干燥，便于观察）13在滤膜上再加一滴浸油，盖上盖玻片并用镊子将盖玻片压实（便于观察）14将放好滤膜的载玻片放在显微镜的40倍物镜下观察15细菌和酵母菌呈现桔色或绿色（细菌为针尖大小的亮点，酵母菌呈有规则的圆形或椭圆形，多为两个呈三个连在一起）16取中间位置观察20个视野，菌落总数/ml为20个视野的平均值*8617观察时，应注意滤膜四周的细菌，最好每个角落能观察到注意：1每个检测过程都在通风橱中进行2此检测方法检测出的菌类为死菌和活菌的总数4、技术程序可以采用集中计算方法确定每毫升的菌数，需要确定显微镜的视野范围，这个面积就是显微镜在给定放大倍数内可观察到的视野范围的总面积。
微生物高通量快速检测技术的优势有哪些？
微生物高通量快速检测技术的优势有哪些？微生物感染性疾病在临床上具有很高发病率，且类型多种多样，病情严重度不一，对人们生命健康安全产生重大威胁。
不断出现的新型微生物和已知微生物的变异，促使临床检验更加注重寻找新型微生物检验方法。
本文下面详细说一说微生物高通量快速检测技术的优势，以便为临床检测提供一些参考。
一、分子生物学技术分子生物学属于新兴学科之一。
生命科学的发展和进步，大大提高人们对微生物体的认知水平。
分子生物学技术能够立足分子水平，将诊断依据提供给医师，且已经实现与其他学科技术的融合。
通过对分子生物学技术的应用，能够突破微生物快速检测的限制，除了检测微生物生理特征和外部结构外，还能够进一步探索和开发细胞结构、核酸、分子结构，促进核酸杂交技术与聚合酶链反应的产生，大大提高微生物检测灵敏度、可靠性。
现阶段已经被广泛应用于临床实践中。
基因芯片是一种新兴分子生物学在微生物检测中应用的典型方法。
此技术的优势是无需应用大量样品，可以迅速高效检测，不足是成本比较高、芯片灵敏度低、芯片特异性不足。
然而，此技术能够检测出耐药性细菌的耐药基因，进而将抗耐药的抗生素研制出来，推动抗感染药物的进步与发展。
二、免疫学技术这是临床一种常见检测技术，其原理是通过对抗原抗体特异性反应的运用，采用定量定性方式观察和分析组织细胞与特定抗原。
想要获得良好观察效果，需将抗原抗体反应充分展示出来，一般在检测之前，利用抗原抗体与标记物结合法，将物质的酶或荧光有色反应标记出来，借助电光镜可对抗原抗体实施定量与定性分析操作。
现阶段，很多病原微生物实验室都应用了免疫学技术，这种检测技术比较成熟，主要包括放射免疫分析、荧光免疫分析、化学发光免疫分析、含酶免疫分析等。
三、细菌毒素技术细菌毒素是一种致病性毒素，主要由细菌导致，通常分为两种类型，即内毒素、外毒素，外毒素指分泌到菌体外的毒素；内毒素指包含在菌体内，破坏菌体后释放而出的毒素。
毒素毒力大小对致病性强弱具有决定性影响，不同细菌的毒素存在很大差异。
微生物快速检测方法3篇
微生物快速检测方法第一篇：微生物快速检测方法是一种用于检测微生物数量和类型的技术，它排除了传统方法中需要多日甚至数周才能得到结果的限制。
目前，有多种不同的微生物快速检测方法可供选择，以下是其中几种。
1. PCR检测法聚合酶链式反应（PCR）是一种广泛使用的微生物检测方法。
该技术依赖于单个微生物细胞中的DNA模板，通过重复循环DNA引物扩增模板DNA，从而在富集的样品中检测出微生物DNA。
相比于传统方法，PCR不需要等待微生物生长，因此它可以极大地减少样品准备和数据分析的时间。
2. 荧光定量PCR检测法荧光定量PCR（qPCR）是PCR技术的一种变体，它使用荧光探针来实现DNA扩增的实时监测。
具体地，qPCR将荧光探针引入PCR反应体系中，当扩增过程中的DNA与荧光探针结合时，就会放出荧光信号。
这种方法在微生物检测中广泛应用，因为它可以定量检测微生物数量，同时还可以消除污染的干扰。
3. 基因测序技术基因测序技术是一种高通量的检测方法，它可以快速测定微生物所携带的基因序列。
基于DNA序列的比对和解码，可以对微生物进行鉴定和分类。
整个测序过程可以在几个小时内完成，可以检测出样品中的潜在病原微生物，并发现抗药性和毒力相关基因。
基因测序技术可以通过揭示微生物的全基因组，来理解微生物的生长和感染机制。
上述方法都可以提供快速并准确的微生物检测结果，可以用于食品、环境、医疗设备等领域。
但是，所有这些方法都需要具备高质量的DNA和RNA作为输入，否则检测结果可能会出现假阳性或假阴性。
第二篇：微生物快速检测方法在农业和食品安全领域中非常重要。
传统的分离和培养方法需要数天才能得到微生物检测结果，且很难检测到低浓度菌群。
为了更快速、准确地检测微生物，出现了一些新的技术，以下是几种常用的方法。
1. 生物传感器生物传感器技术利用大肠杆菌与质粒间的交互作用来检测特定代谢产物。
这种方法可以用于检测细菌、真菌和病毒等微生物。
生物传感器不仅可以检测单一代谢产物，还可以监测多种种类，可以在几分钟内获得结果。
常见食品微生物快速检测技术对比分析
快速检测技术能缩短检测时间，简化操作，常见的食品微生物检测技术有测试片法、纸片法和试剂盒法等，不同的快速检测法有不同的优缺点，但也有共同点，应用的领域不同，起到的作用就不同。
对测试片法、试剂盒法和纸片法的优缺点及意义作对比分析以促进其在食品微生物检验中的应用和推广。
1 常见的食品微生物快速检测 技术测试片法是以纸片、冷水可凝胶和无水纺布等作为培养基载体，将特定的显色物质固定在上面，通过观察试纸的显色反应来测定食品微生物的方法。
纸片扩散法是将含有定量抗菌药物的滤纸片贴在已接种了测试菌的琼脂表面，纸片中的药物在琼脂中扩散，随着扩散距离的增加，抗菌药物的浓度呈对数减少，在纸片周围形成浓度梯度，在药物扩散区域，纸片周围一定抑菌浓度范围内的测试菌不能生长，范围外的菌株继续生长，从而在纸片周围形成透明抑菌圈，抑菌圈的大小可以反映测试菌对测定药物的敏感程度，并与该药对测试菌的最低抑制浓度呈负相关，即抑菌圈越大，最低抑菌浓度越小。
试剂盒法是在检测样品中加入部分富集培养物，样品沿着检测装置流动，渐渐会出现分区，根据对照区和检测区的对比分析判定结果，短时间内就可以完成检测，是检测沙门氏菌的简便方法。
2 常见微生物快速检测技术在食品微生物检验中的应用食品微生物检测的三大指标是菌落总数、大肠菌群、致病菌，其中，菌落总数主要是作为判定食品被细菌污染程度的标志，是卫生检验指标的常检项之一，纸片法和测试片法均可用于检测食品中的菌落总数，虽检测原理和步骤不同，但结果的准确性均较高，是检测菌落总数的不二之选。
大肠菌群是评价食品卫生质量的重要指标之一，常用作粪便污染指标，以检出情况判定食品是否被粪便污染，常用纸片法检测大肠菌群数，该法比传统的最可能数法结果要更准确且所需时间要更短。
霉菌和酵母菌会使食品腐败变质，也常作为衡量食品卫生质量的指标菌，纸片法和快速测试片法均可用于霉菌和酵母菌的检测，霉菌和酵母菌在纸片上生长后显示蓝色斑点，霉菌菌落斑点较大且扩散，酵母菌菌落较小且圆滑。
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政府检测机构为什么需要微生物 快速检测？
日益严峻的食品安全局势的需要
•
•
提国生内 。高外检食测品安效全率形势严峻，恶性事件不断发
••
节欧洲约“人二力噁英资”源、“成疯本牛病”（20世纪90
年代）
•• 与日本国大际肠接杆菌轨O157:H7中毒（1996）
• 中国SARS（2003） 、东南亚国家禽流感 （2004）
14
• 固定底物技术酶底物法，需要coliert试 剂
• 采用大肠菌群细菌能产生D-半乳糖苷酶 分解ONPG（邻硝基苯β-D-半乳吡喃糖 苷）使培养液呈黄色，以及大肠埃希氏 菌产生D-葡萄糖醛酸酶分解MUG（4甲基伞形酮-D-葡萄糖醛酸苷 ）使培养 液在波长366nm紫外光下产生荧光的原 理，来判断水样中是否含有大肠菌群及 大肠埃希氏菌。只需24小时即可同时定 量出水样中大肠菌群和大肠埃希氏菌的 MPN值。
15
二、常规微生物快速检测技术现状
• 快速检测微生物数量的新方法： 1、ATP法：目前产品较多，如CHARM，
Biotrace, …..等。 2、电化学法：Sy-Lab公司Bactrac 4300，Tempo,… 3、颜色变化：如梅里埃的Bact/Alert和Foss的
MicroFoss。 4、流式细胞技术及激光扫描技术 5、其它：热量法，放射测量法
13
• SimPlateTMTPC 法：基于食源性细菌的蛋白 质有特异性酶类，TPC培养基内含有多种细菌 酶类所对应的底物。检样被细菌污染时，只要 具有一种酶的活性即能与底物作用生成4-甲基 伞形酮，培养24h后，在紫外线照射下，发出 蓝色荧光。
• 食源性细菌悬浮于TPC培养基表面，在分隔的 小池内能迅速进行生化反应，若有检样颗粒亦 无干扰；它不是由48h形成的菌落来计数，而 是24h后在紫外灯照射下记录培养皿内能发出 蓝色荧光的阳性池数，进而由最大近似值 (MPN) 表查出细菌的MPN。阳性池数与 MPN 呈松泊分布。
• 滤膜法常用于可过滤样品的微生物检测。 • 优点：灵敏度增大，菌落无扩散情况，
便于计数。 • 缺点：需要额外的支出购买真空泵，多
联支架及一次性滤膜；如果抽滤过程空 气洁净度不够，有可能造成二次污染， 尤其是对菌数要求特别严格的产品，如 啤酒，澄清果汁，桶装饮用水等。
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皿膜法—以纸片法为代表
•纸片法是目前被广泛接受的方法。国标 餐具大肠菌群采用的就是纸片法。
螺旋平板原理
接种针往外移动 同时自动将样品 稀释1000倍
平皿旋转
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螺旋平板法的优缺点
• 优点： 与传统方法相比，无需稀释3个梯度， 每个梯度倒2个平板，节省了大量人力物 力。
• 缺点： 检测时间并没有缩短，菌落总数仍需要 培养48小时。 需要配合自动菌落计数仪，否则人工计 数更麻烦。
10
滤膜法
• 传统计数改良法： 1、螺旋平板计数法：螺旋接种仪＋菌落计数 2、滤膜法：常用于一些可过滤样品的检测。 3、纸片法：培养基固定在载体上。省去制做
培养基的时间。主要用于细菌总数检测。 4、其它：如Simplate即用胶,改良MPN产品。
7
螺旋平板法
DWS螺旋平板接种仪
aColyte自动菌落计数仪
8
8、微生物的快速检测
2019-2-26
1
常见微生物检测项目
常规微生物项目：细菌总数、大肠菌群、 大肠杆菌、酵母总数、霉菌总数。
致病微生物项目：沙门氏菌、李斯特菌、 金黄色葡萄球菌、大肠杆菌O157：H7、 弯曲杆菌、致病弧菌、副溶血弧菌、志 贺氏菌、假单胞菌等。
2
• 国家标准GB/T 4789 1-40：食品卫生微生物 学检验：菌落总数测定、大肠菌群计数、沙门 氏菌检验、志贺氏菌检验、致泄大肠埃希氏菌 检验、副溶血性弧菌检验、小肠结肠炎耶尔森 氏菌检验、空肠弯曲菌检验、金黄色葡萄球菌 检验、溶血性链球菌检验、肉毒梭菌及肉毒毒 素检验、产气荚膜梭菌检验、蜡样芽孢杆菌检 验、霉菌和酵母菌计数、常见产毒霉菌的鉴定、 椰毒假单胞菌酵米面亚种检验、单核细胞增生 李斯特氏菌检验、肠杆菌科噬菌体检验、大肠 菌群快速测定、双歧杆菌检验、乳酸菌检验、 大肠埃希氏菌O157：H7/NM检验、阪崎肠 杆菌检验等。
• 美国菠菜大肠杆菌O157:H7污染事件
（2006）
4
企业为什么需要微生物快速检测？
• 市场销售环节要求快速出货。尤其是一些保质 期较短的产品。
• 减少物流的压力，尽可能减少仓存，加快资金 周转。
• 节约人力资源成本（外资企业尤其突出） • 对于运行HACCP质量保证体系的企业来说，快
速检测方法尤其重要。可以快速检测原料及半 成品的污染情况，以采取相应的措施控制最终 产品的微生物超标情况。
• 优点：无需制备培养基，携带方便，非漫延菌落 计数较方便。
• 缺点：不能节省检测时间。检测成本相对偏高。 大肠菌群纸片存在与MPN法无法对应的问题， 金黄色葡萄球菌纸片存在取样量太低的问题。目 前仅细菌总数纸片有一些用户。
12
其它即用胶，MPN改良法
Simplate
colilert
主要用于 水样或澄 清样品的 大肠菌群 或大肠杆 菌检测
5
快速检测方法势在必行！！
• 国外许多政府检测机构都在大量使用快速检测 方法，尤其是ATP法、免疫法、阻抗法和显色 培养基法在国外应用相当成功。
• 国内的许多政府检测机构也都已经在使用或正 在考虑使用国外先进的快速检测技术。
• 从长远发展趋势来说，快速方法是微生物检测 的一大方向。
6
一、常规微生物快速检测技术现状
16
表面洁净的检测方法
• 微生物学法：纸片、琼脂板、 棉签拭子、海绵拭子
• 非微生物学法（快速法）： ATP(三磷酸腺苷，蛋白质, 降 解糖、NADP(辅酶II)，其它。
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（一）ATP法 ATP---三磷酸腺苷
ATP来源于
细菌 酵母 霉菌 生物膜 组织残留
废弃物污染 人的污染
18
ATP 存在表明什么？
1. 人接触设备或器具 2. 设备或器具被污染 3. 清洗不正常 4. 非正常的敏感物污染 5. 微生物污染
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检测原理
荧光素 荧光素酶
ห้องสมุดไป่ตู้
ATP+ O 2+ Lu ci f e r i n + Lu ci f e r a se =
氧合荧光素
O x y l u ci f e r i n + A M P+ PPi + CO 2