普通PCR及测序PCR原理分解
pcr测序原理
pcr测序原理PCR测序原理。
PCR（Polymerase Chain Reaction）是一种重要的分子生物学技术，它可以在体外大规模复制DNA片段。
PCR技术的应用非常广泛，其中之一就是在测序中的应用。
PCR测序是通过PCR技术扩增DNA片段，然后对扩增产物进行测序，以获取DNA序列信息。
下面将详细介绍PCR测序的原理。
首先，我们需要了解PCR技术的基本原理。
PCR技术是通过酶的作用，在体外扩增DNA片段。
PCR反应需要一对引物（primers）、DNA模板、DNA聚合酶、四种核苷酸和缓冲液等组分。
引物是PCR反应的起始物，它们是由实验者设计合成的短链DNA片段，与待扩增的DNA序列互补配对。
在PCR反应中，引物与DNA模板结合，DNA聚合酶沿着引物合成新的DNA链。
通过PCR反应，可以在短时间内扩增出大量的DNA片段。
在PCR测序中，我们通常使用Sanger测序法。
Sanger测序法是通过DNA聚合酶合成DNA链的方式进行测序。
在PCR测序中，我们需要对PCR扩增产物进行测序，以获取DNA序列信息。
测序过程中，我们通常使用荧光标记的引物和特殊的测序试剂，通过测序仪器对DNA序列进行测定。
PCR测序的原理可以简单概括为以下几个步骤：1. PCR扩增，首先，我们需要利用PCR技术对待测序的DNA片段进行扩增。
在PCR反应中，引物与DNA模板结合，DNA聚合酶沿着引物合成新的DNA链，从而扩增出大量的DNA片段。
2. 准备测序反应，将PCR扩增产物与荧光标记的引物和特殊的测序试剂混合，准备进行测序反应。
荧光标记的引物可以在测序仪器中发出特定的荧光信号，用于测定DNA序列。
3. 测序反应，将混合好的PCR扩增产物和测序试剂放入测序仪器中进行测序反应。
在测序反应中，DNA聚合酶沿着荧光标记的引物合成DNA链，同时测序仪器记录下荧光信号。
4. 数据分析，最后，利用测序仪器记录下的荧光信号数据进行分析，得到DNA序列信息。
PCR技术及测序解析
Pacific BioscienceSMRTT
该测序也是基于边合成边测序的原理，这项技术使用ZeroModeWaveguide(ZMW)(零级波导)。测序的过程：被荧光标记磷酸基团 的核苷酸在聚合酶活性位点上与模板链结合（每种脱氧核苷酸被不用颜 色的染料标记），被激发出荧光，在荧光脉冲结束后，被标记的磷酸集 团被切割并释放，聚合酶转移到下一个位置，下一个脱氧核苷酸连接到 位点上开始释放荧光脉冲，进行下一个循环。
基因测序技术
1.第一代：Sanger链终止法、Gilbert化学降解法
2.第二代：454、Illumina、 SOLiD
3.第三代：Helico BioScience Pacific BioscienceSMRTT
pcr种类和原理
PCR种类和原理引言聚合酶链反应（PCR）是一种基因分析技术，广泛应用于分子生物学领域。
通过PCR，可以在短时间内扩增一小段DNA序列，从而方便进行基因检测、DNA测序等相关操作。
本文将介绍PCR的种类和原理。
PCR的种类PCR根据特定的用途和反应条件的不同，可以分为以下几种不同类型：标准PCR标准PCR是PCR的最基本形式，包括三个步骤：变性、退火和延伸。
在变性步骤中，将PCR反应体系中的DNA序列加热至高温，使其两个链解开。
然后，降温至一定温度，使引物（寡核苷酸）与DNA序列的两个链的末端结合。
最后，在合适的温度下，通过DNA聚合酶，使DNA序列的两个链延伸。
逆转录PCR逆转录PCR（RT-PCR）是一种将RNA转录成DNA的反应。
通过使用逆转录酶将RNA转录成cDNA，然后进行PCR扩增，可以更方便地研究RNA的表达和变化。
定量PCR定量PCR（qPCR）是一种用于测量DNA序列数量的PCR技术。
通过引入荧光探针或染料，可以实时监测PCR反应的进行，并据此计算目标DNA序列的起始数量。
数字PCR数字PCR是一种通过将反应体系分成多个小区域，并进行单分子级别的PCR扩增，实现对DNA序列的精确计数的方法。
长PCR长PCR用于扩增较长的DNA序列。
通常，标准PCR技术在扩增1000个碱基以上的DNA序列时表现不佳，而长PCR通过优化反应条件，可以扩增数千个碱基以上的DNA 序列。
PCR的原理PCR的原理基于DNA的复制过程。
PCR反应体系主要包括DNA模板、引物、DNA 聚合酶和反应缓冲液。
下面是PCR反应的基本步骤：1.变性：将反应体系加热至95°C，使DNA模板的双链解开。
此步骤中，DNA模板上的两个链会分离开，形成两个单链模板。
2.退火：降温至较低的温度，使引物与模板DNA的单链序列互补结合。
每个引物在目标区域的两端结合。
3.延伸：在适当温度下，DNA聚合酶开始将引物作为起始点，向外延伸合成新的DNA链，形成与模板DNA互补的两条新的DNA链。
《PCR详细讲解》课件
Oligo
《PCR详细讲解》
《PCR详细讲解》
《PCR详细讲解》
《PCR详细讲解》
《PCR详细讲解》
Primer BLAST
《PCR详细讲解》
《PCR详细讲解》
《PCR详细讲解》
《PCR详细讲解》
《PCR详细讲解》
逆转录PCR
《PCR详细讲解》
逆转录PCR的原理
由一条RNA单链转录为互补DNA （cDNA）称作逆转录PCR（Reverse Transcription PCR，RT-PCR），由依 赖RNA的DNA聚合酶（逆转录酶）来完 成。
《PCR详细讲解》
引物设计的基本原则
1、引物应具有足够的特异性。
如果需要从基因组等较复杂的模板中扩 增特定的DNA序列，则需要考虑目的DNA序列 的保守性，尽量避免所选引物设计区域序列 的非特异性。
引物与非特异序列的同源性不超过70% 或有连续8个互补碱基。
NCBI Primer BLAST
《PCR详细讲解》
24个核苷酸。 识别mRNA的3’端poly（A）尾，
因此仅mRNA可被逆转录。
《PCR详细讲解》
逆转录引物：
（3）特异性引物 能与目标RNA碱基序列互补的寡
核苷酸引物，仅产生待分析基因的 cDNA。
《PCR详细讲解》
半定量 RT-PCR
《PCR详细讲解》
基本概念
半定量RT-PCR（semi-quantitatie reverse transcription and polymerase Chain reaction ,SqRT-PCR）是常用的一种简捷、特 异的定量RNA测定方法，通过mRNA反转录成cDNA，再进行PCR扩增， 并测定PCR产物的数量，可以推测样品中特异mRNA的相对数量。
pcr原理及应用
pcr原理及应用PCR（聚合酶链式反应）是一种在分子生物学领域广泛应用的技术，通过这种技术可以在体外合成大量特定DNA序列。
PCR的原理基于DNA的复制过程，在PCR过程中，需要一对引物（primers），引物的序列与目标DNA序列的两个端点相匹配。
PCR反应可以分为三个步骤：变性、退火和延伸。
首先，将DNA样本与引物、DNA聚合酶和dNTPs（脱氧核苷三磷酸）一起放入反应管中。
接下来，反应管中的温度升高至94-98℃，使DNA变性，即使其双链解开。
然后，温度降低至50-60℃，使引物与DNA序列互补配对，称为引物的退火温度。
最后，温度升高至72℃，此时DNA聚合酶开始在退火的引物上进行延伸合成新的DNA链，形成双链DNA。
PCR技术在许多领域都有广泛的应用。
第一，PCR可以用于基因分型及基因突变的检测。
通过设计特定的引物，可以选择性地扩增目标基因，并通过检测PCR产物的大小和序列来确定基因型或突变情况。
其次，PCR可用于基因工程和克隆。
通过PCR技术，可以从DNA样本中扩增出特定的DNA片段，然后将其插入到质粒或其他表达载体中，实现特定基因的克隆和表达。
另外，PCR也可用于DNA测序。
在测序反应中，需要将目标DNA进行PCR扩增，然后将PCR产物纯化，再进行测序反应。
通过PCR扩增，可以在测序反应中获得足够的DNA量，以确保测序的准确性和可靠性。
此外，PCR技术还可以应用于病原体的检测。
通过PCR扩增特定的病原体标记基因，可以在短时间内检测到病原体的存在，从而为疾病的诊断和治疗提供帮助。
总结来说，PCR技术具有高度灵敏性、高效性和广泛的应用范围。
它在基础研究、医学诊断、基因工程等领域发挥了重要作用，并为科学研究和临床应用提供了强有力的工具。
pcr测序原理
pcr测序原理PCR测序原理PCR测序是一种基于聚合酶链式反应（PCR）技术的DNA测序方法。
其原理是通过PCR扩增DNA片段，然后将扩增产物进行测序，从而得到DNA序列信息。
下面将详细介绍PCR测序的原理。
一、PCR扩增1.1 PCR反应体系PCR反应体系主要包括以下组分：模板DNA、引物、酶、缓冲液和dNTPs。
- 模板DNA：即待扩增的DNA片段。
- 引物：引物是一种短链寡核苷酸，通常由20个碱基左右组成，用于定向扩增目标DNA片段。
- 酶：PCR反应中使用的酶为聚合酶（polymerase），其作用是在每个循环中将单链模板DNA复制成双链DNA。
- 缓冲液：缓冲液用于调节反应体系的pH值和离子强度等参数，以确保反应能够顺利进行。
- dNTPs：即脱氧核苷三磷酸（deoxyribonucleoside triphosphates），是构成新合成DNA链所需的四种单元之一。
1.2 PCR扩增过程PCR扩增过程分为三个步骤：变性、退火和延伸。
- 变性：在PCR反应开始时，将反应体系加热至94℃左右，使DNA 双链解开成两条单链。
- 退火：将温度降至引物的退火温度（通常为50-65℃），使引物与模板DNA结合成一个稳定的复合物。
- 延伸：将温度升高至聚合酶的最适工作温度（通常为72℃），聚合酶开始在引物的基础上扩增新的DNA链。
这个过程会一直持续到dNTPs用完或者达到设定的PCR循环次数。
1.3 PCR产物经过多轮PCR扩增后，可得到大量目标DNA片段。
这些产物可用于下一步的PCR测序。
二、PCR测序2.1 Sanger测序Sanger测序是最早被广泛使用的PCR测序方法。
其原理是通过在PCR反应中加入一种特殊的二进制核苷酸（dideoxynucleotide，ddNTP）来终止新合成链的延伸，从而得到不同长度的DNA片段，并通过电泳分离出这些片段。
根据片段长度和ddNTP种类可以推断出DNA序列信息。
PCR技术及测序
pcr技术的发展历程
1983年
Kary Mullis首次提出PCR技术的基本 原理。
1985年
Mullis和Cetus公司合作，实现了第一 次成功的PCR实验。
1987年
美国PE-Cetus公司推出了商业化PCR 仪，使PCR技术开始广泛应用于生命 科学研究领域。
1990年
美国PE-Cetus公司推出第一台自动 PCR仪。
测序分析
对PCR产物进行测序，获得目标基因的序列信息。
结果解读
对测序结果进行解读，分析基因变异、表达水平等信息。
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测序分析
对纯化的产物进行测序分析，以确定其序列。
结果解读
对测序结果进行解读，分析其与已知序列的 相似性和差异性。
04 测序技术概述
测序技术的定义
测序技术是指通过一定的方法测定生 物体内核酸的碱基排列顺序，从而分 析其基因型的过程。
测序技术是基因组学、遗传学和生物 信息学等领域的重要工具，对于生命 科学研究、医学诊断和治疗等方面具 有重要意义。
pcr技术及测序
目录
• pcr技术概述 • pcr技术的基本原理 • pcr技术的操作流程 • 测序技术概述 • 测序技术的基本原理 • 测序技术的操作流程
01 pcr技术概述
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
pcr技术的定义
• 聚合酶链式反应（PCR）：一种在生物体外复制特定DNA片段 的核酸扩增技术，通过DNA聚合酶的催化，将模板DNA在一定 温度下进行变性、退火和延伸，完成DNA的扩增。
测序技术的反应过程
模板准备
提取待测DNA，进行纯化处理，获得高质量的模板。
引物设计
pcr测序原理
pcr测序原理1. 引言PCR（聚合酶链反应）是一种在分子生物学领域中广泛应用的技术，它可以在短时间内扩增DNA的特定片段。
PCR测序是一种基于PCR 技术的DNA测序方法，它通过PCR扩增出的DNA片段来确定DNA 序列。
本文将深入探讨PCR测序的原理及其在基因组研究中的应用。
2. PCR测序原理PCR测序是一种无模板法的测序方法，它利用PCR扩增DNA片段，然后通过测序仪器对扩增的片段进行测序。
下面将详细介绍PCR测序的原理。
2.1 PCR扩增需要设计一对引物，引物的序列应该与待扩增片段的两端序列匹配。
PCR反应涉及到三个步骤：变性、退火和延伸。
在变性步骤中，将待扩增的双链DNA加热至95°C，使其变性成两条单链DNA。
将反应体系温度降低至55-65°C，引物与目标片段的互补序列进行配对，这一步骤称为退火。
在72°C的延伸步骤中，分别使用DNA聚合酶和四种核苷酸（dNTPs）扩增新的DNA链，形成DNA扩增产物。
2.2 扩增产物纯化在PCR反应结束后，扩增产物需要进行纯化。
纯化的目的是去除杂质和剩余的引物、核苷酸和酶等。
纯化的方法通常包括酶处理、柱层析或凝胶电泳等。
纯化后的扩增产物可以被用于后续的PCR测序实验。
2.3 PCR测序PCR测序需要使用测序仪器，测序仪器可以检测到每个扩增产物的碱基序列。
通常使用有效的荧光标记dideoxynucleotides（ddNTPs）来标记链终止。
在测序反应中，扩增产物会与引物和ddNTPs一起放入测序仪器中。
随着延伸的进行，当ddNTPs加入到新合成链中时，DNA链的扩增会终止。
由于每种ddNTPs都有不同的荧光标记，测序仪器会同时监测DNA链扩增的终止情况和发出的荧光信号，从而确定DNA序列。
3. PCR测序的应用PCR测序在基因组研究中有着广泛的应用。
下面将介绍PCR测序在以下几个方面的应用：3.1 基因突变检测PCR测序可以用于检测基因组中的突变，从而帮助研究人员了解突变与疾病之间的关系。
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2）循环参数
(1)变性
使双链DNA解链为单链 95oC 20-30秒
(2) 退火
退火温度由引物Tm值决定，一般为
Tm – 5~10℃
增加温度能减少引物与模板的非特异性结合;降 低温度可增加反应的灵敏性。
（3）延伸
70-75oC(温度取决于聚合酶的活性） 延伸时间由扩增片段长度及DNA 聚合酶的延伸速度决定
第5轮扩增（32=25）
PCR的基本原理
第3轮扩增（8）
标准的PCR反应体系
4种dNTP混合物 上下游引物 模板DNA Taq DNA聚合酶 Mg2+ 各200umol/L 各10～100pmol 0.1～2ug 2.5u 1.5mmol/L
PCR反应条件
1）PCR反应成分 （1）模板
模板可以是DNA，也可以是RNA（反转录PCR）， 既可以是双链，也可以是单链。
制备杂交探针
基因组DNA结构功能的研究
低浓度引物
高浓度引物
反向PCR (reverse PCR)
是用反向的互补引物来扩增两引物以外的DNA片 段对某个已知DNA片段两侧的未知序列进行扩增。 可对未知序列扩增后进行分析 , 如探索邻接已知 DNA片段的序列；用于仅知部分序列的全长 cDNA 的 克隆,扩增基因的插入DNA；建立基因组步移文 库。
原 因
1. 模板:含有抑制物，含量低 2. Buffer对样品不合适 3. 引物设计不当或者发生降 对 解 策 4. 反应条件：退火温度太高，延
伸时间太短
1. 纯化模板或者使用试剂盒提取 模板DNA或加大模板的用量 2. 更换Buffer或调整浓度 3. 重新设计引物（避免链间二聚 体和链内二级结构）或者换一 管新引物 4. 降低退火温度、延长延伸时间
3. 各种试剂最好先进行分装，然后低温贮存。
注意的事项：
（一）防止污染
试剂小量分装 吸头及EP管一次性使用 器皿及工作区域要分开，无菌操作
（二）设立对照
阳性对照： 阴性对照： 试剂对照： 阳性模板 阴性模板 除模板外的所有组分
PCR的类型及应用
• 研究
– 基因克隆，DNA测序，分析突变 – 细菌、病毒、寄生虫检测，诊断 – 遗传图谱的构建，DNA测序，表达图谱 – 犯罪现场标本分析 – 各种肿瘤检测
4.对标本的纯度要求低： 不需要分离病毒或细菌及培养细胞， DNA 粗制品及总RNA均可作为扩增模板。 可直接用临床标本如血液、体腔液、洗嗽 液、毛发、细胞、活组织等粗制的DNA 扩增检测
PCR常见问题
•
假阴性，无扩增产物
非特异性扩增 拖尾 假阳性
• • •
• 无扩增产物
现象：正对照有条带，而样品则无；
• 诊断
• 人类基因组工程
• 法医
• 肿瘤
• 其他……
PCR的不同类型
重组PCR 反向PCR 原位PCR 巢式PCR 热启动PCR 实时定量PCR 不对称PCR 多重PCR 连接酶链反应 递减PCR RT－PCR
重组PCR（基因克隆）
质粒DNA
基因片段
重组DNA
Bam H I 5’
5’ Bam H I Bam H I
Mg2+可与负离子结合，所以反应体系中dNTP、EDTA 等的浓度影响反应中游离的Mg2+浓度。
（6）缓冲液（Buffer）
10mmol/L TrisHCl 调节PH，使Taq酶活性作用 环境维持在扁碱性（pH8.3,室温） 50mmol/L KCL 有利于引物的退火，但过高会 抑制Taq酶活性 0.01% 明胶 保护酶不变性失活
（4）循环次数
主要取决于模版DNA的浓度
一般为25-35次
次数过多：扩增效率降低
错误掺入率增加
一个典型PCR体系
反应体系（50 ul）： Taq酶 2.5 U 10x Buffer 5 ul dNTP(2.5mM) 4 ul DNA模板 0.1～2ug 上游引物(10P) 2 ul 下游引物(10P) 2 ul H2O 补足至50 ul 总计 50 ul
LP（Labelled primers)检测
原位PCR的作用
既往鉴定细胞内特异序列一般采用原位杂交（ISH）， 但在每个细胞中目的片段的拷贝数少于10的情况下，该方 法的敏感度就明显下降。而标准的PCR则可扩增出细胞内单 拷贝的序列，敏感度很高，但却未能与细胞形态学研究相 结合。
ISPCR则可把这两者结合起来，成为细胞学诊断中一种崭 新的检测技术。利用该法可检测细胞内病毒感染、细胞内 基因重排、以及分析细胞内RNA表达产物等方面发挥一定 作用。在检测细胞的潜在感染方面也具有重要意义。
已知序列
未知序列
未知序列
限制酶 未知序列
已知序列
限制酶 未知序列
连接酶
多重PCR
用于检测特定基因序列的存在或缺失。
引物
电 泳
原位ＰＣＲ
原位聚合酶链式反应（In Still PCR，Is－PCR） 是由Haase等于1990年首创。它是利用完整的细胞作 为一个微小的反应体系来扩增细胞内的目的片段， 在不破坏细胞的前提下，利用一些特定的检测手段 来检测细胞内的扩增产物。 直接用细胞涂片或石蜡包埋组织切片在单个细胞 中进行ＰＣＲ扩增。可进行细胞内定位。 适用于检测病理切片中含量较少的靶序列
不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制剂、 DNA结合蛋白类。 一般100ng DNA模板/100L。
模板浓度过高会导致反应的非特异性增加。
（2）Taq DNA聚合酶（Taq酶）
DNA聚合酶的主要活性是在具备模板、引物、dNTP等 存在的情况下催化DNA的合成。
Taq酶来自水生嗜热菌
Thermus aquaticus
一
PCR技术
PCR概念 PCR的原理 PCR中的注意事项 PCR的主要类型
什么是PCR?
• 多聚酶链式反应(polymerase chain reaction)简称 ＰＣＲ技术，是一种在DNA聚合酶作用下体外 扩增特异ＤＮＡ片段的技术。 PCR技术操作简 便，可在短时间获得数百万个特异的目的ＤＮ Ａ序列的拷贝。80年代中期PCR技术的发明， 引起了生物技术发展的一次革命，目前已被广 泛应用于与分子生物学相关的各个领域。
操作步骤
①固定组织或细胞:将组织细胞固定于预先用四氟乙烯 包被的玻片上，并用多聚甲醛处理，再灭活除去细胞内 源性过氧化物酶.
②蛋白酶K消化处理:用60ug/ml的蛋白酶K将固定好的 组织细胞片55℃消化处理2h后，96℃2min以灭活蛋白酶 K. ③PCR扩增:在组织细胞片上，加PCR反应液，覆盖并加 液体石蜡后，直接放在扩增仪的金属板上，进行PCR循环 扩增.有的基因扩增仪带有专门用于原位PCR的装置. ④杂交:PCR扩增结束后，用标记的寡核苷酸探针进行原 位杂交
PCR反应的几个要素
• • • • • • DNA聚合酶 模板（要扩增的DNA） 引物 dNTPs Buffer（缓冲液） Mg 2+ 等 生产机器 模具 原料 稳定的环境 润滑剂
PCR反应步骤
95℃（变性）
50℃（退火） 72℃（延伸）
PCR循环（25-35个）
变性(denaturaion)
• 非特异性扩增
现象：PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大
或小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。
• 非特异性扩增
原 因
1.
2. 3. 4. 5. 6.
引物特异性差 模板或引物浓度过高 酶量过多 对 Mg2+浓度偏高 策 退火温度偏低 循环次数过多
1. 2. 3.
4.
5. 6.
（6）两引物间避免有互补序列。 （7）引物3’端与模板序列要严格配对，3’端避免出现 3个或3个以上连续相同的碱基 ；引物 5’端无严格限 制。 3’ 5’
5’
3’
限制性内切酶的识别序列
启动子序列
定点突变 探针标记
（4）dNTP
dNTP： dATP， dTTP， dGTP， dCTP
dNTP浓度取决于扩增片段的长度
Bam H I
质粒DNA
目的基因 限制性核酸内切酶
GGAC
CCTG
GTCC
CAGG
GGAC
GTCC CAGG GGAC CCTG GTCC
CAGG
CCTG
不对称PCR
目的：扩增产生特异长度的单链DNA。
方法：采用两种不同浓度的引物。分别称为限制性引 物和非限制性引物,其最佳比例一般是0.01∶0.5μM, 关键是限制性引物的绝对量。 用途：制备核酸序列测定的模板
四种dNTP浓度应相等
浓度过高易产生错误碱基的掺入，浓度过低则 降低反应产量
dNTP可与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度下降，影 响DNA聚合酶的活性。
（5） Mg2+
Mg2+是DNA聚合酶的激活剂。 0.5mmol/L-2.5mmol/L反应体系。
Mg2+浓度过低会使Taq酶活性丧失、PCR产量下降； Mg2+过高影响反应特异性。
特点：1.良好的耐热性 在70～80℃具有最高聚合活性 在95 ℃仍然可以有50%活性 2. Mg2+依赖性 3. 扩增时3‘末端凸出一个A 碱基 3. 无校正功能 一般PCR中酶的用量为0.5-2.5 U/50 l，酶量增加使反应 特异性下降，酶量过少影响反应产量。
（3）引物
引物浓度：0.1-0.5 mol/L
反应流程（以扩增片段大小为
800bp为例）：
95℃ 95℃ 55℃ 72℃ 72℃ 4℃ 5 min 30 s 30 s 1 min 5 min ------
30个 循环
PCR的特点
1. 特异性强 2. 灵敏度高 PCR产物的生成量是以指数方式增加的，能 将皮克(pg=10 - 12)量级的起始待测模板扩增 到微克(g=10 -6)水平 3. 简便、快速 PCR反应一般在2～4 小时完成扩增反应。扩 增产物一般用电泳分析，不一定要用同位素， 无放射性污染、易推广